בידוד פרוטוקול של העכבר נגזר מונוציט תאים דנדריטים והפעלה שלהם עוקבות במבחנה עם מכלולים חיסוניים הגידול

נגזר מונוציט DC (MoDC) יכול לחוש כמויות זעירות של מולקולות הקשורות סכנה, ולכן טענתי בקלות. אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של MoDC של דם וגידולים שלהם הפעלה עם מכלולים חיסוניים תוך הדגשת מפתח הזהירות הנחשבות על-מנת למנוע הפעלה מוקדמת שלהם.

שיטה זו נועדה לסייע למדענים לבודד DCs שמקורם במונוציטים מהדם והגידולים של עכברים נושאי גידול על מנת לחקור את תכונותיהם החיסוניות. אני חושב שהיתרון העיקרי של הליך זה בהשוואה לשיטות אחרות הוא שה-DCs המתקבלים שמקורם במונוציטים משקפים טוב יותר את מצב ההפעלה שלהם בגידול ובדם. הדבר הקשה ביותר הוא כנראה לוודא שכל הריאגנטים והכלים שלך סטריליים ושלא תכניס זיהום במהלך הליך זה.

אני מבודד תאים מיאלואידים ותאים דנדריטיים מגידולים כבר למעלה מ-15 שנה, והרעיון של השיטה הזו עלה לי כששמתי לב שפרוטוקולי בידוד שונים הביאו לדפוסים שונים של הפעלת תאים. מי שתדגים את ההליך תהיה גברת סנטנה-מגל, שהיא סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי.

לאחר המתת חסד של העכברים באמצעות פחמן דו חמצני בתוך מכסה זרימה למינרית, חלץ את הגידולים והנח אותם במדיום RPMI ללא סרום בקר עוברי. לאחר מכן, השתמש במספריים לניתוח כדי לפרוס את הגידול לחתיכות קטנות. העבירו את כל חלקי הגידול מעכבר בודד לצינור תחתון שטוח של 30 מיליליטר המכיל מאגר HBSS בתוספת קולגנאז IV ו-DNase I יחד עם מוטות הערבוב המגנטיים.

דגרו את הצינור עם חתיכות הגידול על שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם מערבל מגנטי בפנים במהירות של 200 עד 400 סיבובים לדקה למשך 20 עד 30 דקות. לאחר מכן, סנן את התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב -400 פעמים גרם למשך חמש עד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הצנטריפוגה, הוסף 1.5 מיליליטר של תמיסת מלאי בינונית בשיפוע צפיפות ל-8.5 מיליליטר של HBSS. לאחר מכן, ערבבו את מדיום שיפוע הצפיפות במרץ. לאחר מכן, פיפטה את התערובת לגלולה.

צנטריפוגה את מתלה התאים ב -400 פעמים גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שפכו את הסופרנטנט לאחר סיום הצנטריפוגה. לאחר שטיפת התאים הגלולים פעמיים, השעו מחדש במיליליטר אחד של מאגר בידוד.

הוסף את תרחיף התא ל-30 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצומדים CD11b. לאחר מכן, דגרו את התערובת בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מאגר בידוד.

החל את מתלה התאים על עמוד מגנטי שטוף מראש. לאחר מכן, השתמש בשלושה מיליליטר של מאגר בידוד כדי לשטוף את העמוד פעמיים. לאחר מכן, הסר את העמוד מהמגנט.

לאחר מכן, הוסף שישה מיליליטר של מאגר בידוד בעמודה. דחף עם בוכנה כדי לשטוף את התאים המסומנים מגנטית בצינור איסוף סטרילי. שוב, צנטריפוגה את התאים ב -400 פעמים גרם למשך חמש עד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר השעיה מחדש וצביעה של התאים, מיין את התאים על ידי שער התאים הקטנים, באמצעות פיזור צדדי קטן ופיזור קטן קדימה. לאחר המתת חסד של העכבר, יש לרסס עליו אתנול 70%. לאחר מכן, השתמש במספריים כירורגיים כדי להסיר את העור המכסה את הלב מתחת למכסה המנוע הלמינר.

לאחר מכן, נקו את המספריים באתנול. שטפו את החלל עם 20 מילי-מולרי EDTA HBSS, והשתמשו במספריים כדי לחתוך את הפרוזדור הימני של הלב. לאחר מכן, השתמש במזרק של 10 מיליליטר עם מחט בגודל 25 כדי לשטוף לאט את החדר הימני של הלב עם EDTA HBSS בגודל 20 מילי-מולרי.

לאחר מכן, השתמש במזרק סטרילי כדי לשאוב דם מחלל הצדר. העבירו את הדם בצינור המכיל הפראן סולפט ו-EDTA. לאחר מכן, פיפטה את הדם על מדיום שיפוע הצפיפות.

צנטריפוגה של תאי הדם ב -400 פעמים גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם בלם נמוך. לאחר צנטריפוגה, אסוף את התאים החד-גרעיניים בצינור. ממיסים את התאים ב-10 מיליליטר של מאגר בידוד כדי לשטוף את התאים.

שוב, צנטריפוגה של התאים ב -400 פעמים גרם למשך חמש עד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבחור את תאי CD11b, השעו מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מאגר בידוד. דגירה למשך 15 דקות עם 50 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצומדים CD11b בארבע מעלות צלזיוס.

צנטריפוגה ב -400 פעמים גרם למשך חמש עד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מאגר בידוד.

לאחר מכן, החל את מתלה התאים על עמוד מגנטי שטוף מראש. שוטפים את העמוד עם מאגר בידוד פעמיים. הסר את העמודה מהמגנט והוסף שישה מיליליטר של חוצץ בידוד על העמוד.

לאחר מכן, שטפו את התאים המסומנים מגנטית בצינור איסוף סטרילי על ידי דחיפה של הבוכנה. צנטריפוגה של התאים ב -400 פעמים גרם למשך חמש עד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השעו מחדש את התאים במאגר בידוד והכתים בנוגדנים מצומדים פלואורופור.

מיין את התאים על ידי שער התאים הקטנים באמצעות פיזור צדדי קטן וקטן קדימה. ראשית, תקן את התאים בפרפורמלדהיד 1.8% חוצץ למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. זרע את תרחיף התאים בכל באר של צלחת 96 בארות בצורת U.

לאחר מכן, הוסף דילולים משתנים של נוגדנים קושרי גידול בכל באר. לאחר מכן, דגרו את התאים על הקרח למשך 15 עד 20 דקות. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים עם 150 מיקרוליטר מי מלח חוצץ פוספט.

לאחר מכן, צנטריפוגה ב -400 פעמים גרם למשך חמש עד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, הוציאו את הסופרנטנט ושטפו את התאים פעמיים. ממיסים את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר FACS המכיל נוגדן משני מצומד פלואורופור.

לאחר מכן, דגרו את הצלחת על קרח למשך 15 עד 20 דקות. לאחר 15 עד 20 דקות, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר FACS כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה את הצלחת ב -400 פעמים גרם למשך חמש עד 10 דקות.

לשפוך את הסופרנטנט. לבצע ציטומטריית זרימה כדי לנתח את קשירת הגידול ולקבוע את הריכוז המינימלי של אימונוגלובולין G הנדרש לציפוי התאים. לאחר שהתאים מצופים בריכוז G מינימלי של אימונוגלובולין, הוסף את הקומפלקס החיסוני של הגידול המסומן ב-CFSE לתאים הדנדריטים שמקורם במונוציטים ביחס של אחד לחמישה.

לאחר מכן, דגרו על התערובת למשך 12 עד 16 שעות למשך הלילה במדיום מלא. בצע ניתוח FACS של הפעלת התאים הדנדריטיים שמקורם במונוציטים. עוצמת הקרינה הממוצעת מחושבת לאחר ניתוח ציטומטרי זרימה כדי לחקור את נוכחותם של נוגדנים IgG ו-M הקושרים תאי גידול LMP ex vivo.

התוצאות מראות כי נוגדני IgG מעכברים אלוגניים C57-Black/6 קושרים את תאי הגידול הרבה יותר חזק מהנוגדנים מהעכברים הסינגניים 129S1. לאחר מכן, מחושבת עוצמת הקרינה הממוצעת של יכולת הקישור של תאי גידול B16F10 עם ה-IgG. IgG המתקבל מעכברים אלוגניים 129S1 מראה עוצמת צביעה גבוהה פי 10 עם גידול B16F10 בהשוואה ל-IgG סינגני מעכברי C57-Black/6.

לאחר מכן, תמונות מיקרוסקופיות של DIC נלכדות כדי להראות את התאים הדנדריטים הקשורים לגידול שמקורם במונוציטים מגידולי B16F10. כאן, תמונות DIC נלכדות כדי להראות את התאים הדנדריטיים הדלקתיים והמפטרלים שמקורם במונוציטים שבודדו מדמם של עכברים נושאי גידול B16F10. ניתוח זרימה ציטומטרי נעשה גם כדי להשוות את דפוסי ההפעלה של תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים מהטחול וממח העצם לזה של הגידול והדם בדגירה עם הקומפלקס החיסוני.

התוצאה מראה ביטוי מוגבר של CD86 ו-MHC II על ידי מח העצם ותאים דנדריטיים טחוליים עם קומפלקסים חיסוניים. לאחר מכן, נעשית אימונוהיסטוכימיה קונפוקלית, המראה את ספיגת הגידול וביטוי MHC II כאשר התאים הדנדריטים מודגרים עם קומפלקס חיסון הגידול המסומן CFSE. לאחר שליטה, ניתן לבצע הליך זה תוך מספר שעות בהתאם למספר העכברים שבהם אתה משתמש.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על כל הריאגנטים והכלים שלך סטריליים בכל עת. פרוות עכברים היא מקור עיקרי לזיהומים. ודא שאף אחת מהשערות לא נוגעת ברקמות שלך.

אנו מקווים שלאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבודד DCs שמקורם במונוציטים מדם וגידולים של עכברים וכיצד להפעיל אותם לאחר מכן עם תאים מורכבים חיסוניים תוך הימנעות מהפעלתם המוקדמת.