Mass spectrometric גישות לחקר מבנה חלבון ואינטראקציות באבקות Lyophilized

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנטר את מבנה החלבון ברזולוציה גבוהה באמצעות חילופי מימן פולטים ותיוג ליטי של שרשרת צד יחד עם ספקטרומטריית מסה. זה מושג על ידי ליופיליזציה ראשונה, החלבון בנוכחות חומרי עזר שונים. בחילופי מימן דאוטריום במצב מוצק, החלבון הליופילי נחשף לאדי תחמוצת דאוטריום בחומר ייבוש אטום תחת לחות וטמפרטורה יחסית מבוקרים.

לצורך תיוג ליטי, החלבון עובר ליופיליזציה עם חומרי עזר וחומר פוטו-ריאקטיבי. לאחר מכן הבקבוקון מוקרן באור UV כדי לחבר את הסוכן לחלבון באופן קוולנטי. עבור כל שיטה, הדגימות מורכבות מחדש ומנותחות באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה שלמה של חלבון ופפטיד.

שתי השיטות הללו מספקות מידע משלים. ניסוחים שבהם מבנה החלבון נשמר מאוד, מראים ירידה בספיגת דאוטריום ותיוג ליטי מוגבר, ואילו אלה עם מבנה מופרע מראים ספיגה מוגברת של דאוטריום וירידה בתיוג הליטי. תיוג כימי, כגון חילופי מימן דאוטריום וקישור צולב צילום יחד עם ניתוח ספקטרומטרי מסה הותאם לאחרונה לחקר מבנה החלבון והאינטראקציות בתומכים חיים.

היתרון העיקרי של טכניקות אלו על פני שיטות קיימות כמו ספקטרוסקופיה CD ו-FDIR הוא שניתן לחקור את מבנה החלבון וסביבתו ברזולוציה גבוהה במצב מוצק. כדי להתחיל, הניחו 200 מיליליטר תחמוצת דאוטריום בתא התחתון של חומר ייבוש והוסיפו 400 גרם אשלגן פחמתי להכנת תמיסה רוויה, הניחו בפנים את צלחת הייבוש מחרסינה ואטמו את אטום הייבוש. אפשר לו להתייצב בחמש מעלות צלזיוס כדי להגיע ללחות יחסית יציבה הקרובה ל-43%הבא מקם את הבקבוקונים הלא מכוסים המכילים חלבון ליופיליזציה בתא העליון של הייבוש, אוטם את הייבוש ודוגר בחמש מעלות צלזיוס.

כדי ליזום את תגובת חילופי המימן דאוטריום לאיסוף דגימה, יש לכסות את הבקבוקון מיד לאחר הוצאתו מהחומר היבש ולאחר מכן להרוות את התגובה על ידי הקפאת הבקבוקון והחנקן הנוזלי. אחסן את הבקבוקון בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח ספקטרומטרי מסה. השתמש בספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה כדי לנתח את הדגימות כדי למזער את ההחלפה החוזרת.

איך המערכת הכרומטוגרפית הנוזלית בתוך קופסת קירור? כדי להגדיר תחילה את המכשיר, חבר את לולאת הדגימה ואת מלכודת החלבון לשסתום השולט בתהליכי ההתפלה והפליטה. לאחר מכן, כייל את המערכת על ידי הזרקת תערובת הכוונון בריכוז נמוך לספקטרומטר המסה והגדרת טווח יחס המסה למטען של 200 עד 3, 200.

לאחר מכן יש לקרר את מערכת הקירור לטמפרטורת פעולה יציבה של כאפס מעלות צלזיוס. מכינים את מאגר המרווה המכיל 0.2% חומצה פורמית ו-5% מתנול במים ומצננים אותו על קרח. לאחר העברת הדגימות לחנקן נוזלי, הסר בזהירות בקבוקון והרכיב מחדש את הדגימה על ידי תוספת של שני מיליליטר של מאגר מרווה.

לאחר מכן טען HPLC מתאים ושיטת ספקטרומטריית מסה. כדי לנתח את הדגימה כאן, יש להמליח 20 פיקומולים של מיוגלובין במלכודת החלבון למשך 1.7 דקות עם 5% אצטיל ניטריל ו-0.1% חומצה פורמית. לאחר מכן יש להוציא את החלבון על פני שיפוע של 3.3 דקות, להגדיל ל-80% אצטו ניטריל ו-0.1% חומצה פורמית.

הזרקו את הדגימה ואספו את ספקטרום המסה על פני טווח יחס מסה למטען של 200 עד 3, 200. כדי לקבוע את המסה של החלבון השלם כהפניה, השתמש באותה שיטה עם דגימת חלבון מדורגת שלא לצורך. השג את מסת החלבון על ידי פירוק הספקטרום הגולמי באמצעות תוכנת ניתוח נתונים לניתוח דגימות מיוגלובין, הגדר את טווח המסה בין 15 ל -18, קילודלטון את רזולוציית המסה לדלתון אחד ואת עפיפון השיא ל 90% לניתוח פפטידים, הכן את הדגימות באותו פרוטוקול כמו לחלבונים שלמים.

כאשר הדגימות מוכנות לניתוח, חבר עמוד פפין משותק ועמוד אנליטי לשסתום והחלף את מלכודת החלבון במלכודת פפטיד. כיול המערכת לפפטידים ביצעה עבור חלבונים שלמים, אך על ידי הגדרת טווח יחס המסה למטען של 100 עד 1700, ואז לקרר את מערכת הקירור לטמפרטורת פעולה יציבה של כאפס מעלות. לאחר כיול המערכת, תכנת את שיטת HPLC וספקטרומטריית המסה המתאימה.

כאן לעכל 20 פיקומולים של מיוגלובין על עמודת פפין עם 0.1% חומצה פורמית במים לתכנת את השיטה ללכוד ולהפיל את הפפטידים במלכודת הפפטידים למשך 1.7 דקות עם 10% אצטיל ניטריל ו-0.1% חומצה פורמית, ולסלק את הפפטידים תוך ארבע דקות עם שיפוע שעולה ל-60% אצטיל ניטריל ו-0.1% חומצה פורמית. לאחר מכן, הזרקו את הדגימה ואספו את ספקטרום המסה בטווח יחס מסה למטען של 100 עד 1700. נתח דגימת פפטיד לא מתוארכת עם ספקטרומטריית מסה טנדם כדי לזהות את השברים הפפטיים.

לאחר מכן הצליבו את המקטע שנקבע בניסוי עם מסות חזויות שנוצרו על ידי תוכנה. לאחר מכן, הגדר את חתך המסה ל-10 חלקים למיליון כדי לחסל מסות עם שגיאה גבוהה עבור פפטידים עם גפרורים. שימו לב למצב הטעינה של רצף הפפטידים ולזמן השמירה.

השתמש בנתוני הפפטיד שנאספו כדי לחשב את המספר הממוצע של דאוטרוס המשולבים בכל מקטע פפטי שימוש בתוכנת ניתוח הנתונים ראשית, ליופיליזציה של החלבון עם חומר העזר והלוצין כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט. לאחר הכנת הדגימות הפעל צולב UV המכיל מנורות UV של 365 ננומטר. הניחו למנורות להתחמם במשך חמש דקות.

לאחר שהמנורות התחממו, כבה אותן והנח את הבקבוקונים הלא מכוסים המכילים את הפורמולה בתוך תא הקישור. הקרינו את הדגימות באור UV למשך 40 דקות וכללו דגימות ללא פוטו לאוצין כבקרה לאחר ההקרנה ואחסן את הבקבוקונים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד לניתוח ספקטרומטרי מסה. הכן את הדגימות לניתוח על ידי הוספת מים מזוקקים בדרגת ספקטרומטריית מסה כדי להניב ריכוז חלבון סופי של שתי מיקרומולר.

לאחר מכן, נתח את הדגימות באותה שיטת ספקטרומטריית מסה כמו עבור החלבונים המאוחדים השלמים. אך אל תשתמש במערכת lc בקירור. רכוש נתוני ספקטרומטריית מסה עבור דגימת חלבון ללא תווית כדי לקבוע את המסה הטבעית של החלבון.

בצע את ניתוח הנתונים כמו עבור הדגימות הלא מדורגות לניתוח רמת הפפטיד. ראשית, בצע תיוג פוטו ליטי במצב מוצק עם חלבונים שלמים ואחסן אותם בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הרכיבו מחדש את הדגימה עם מאגר אמוניום ביקרבונט של 100 מילי-מולרי כדי להניב ריכוז חלבון סופי של 10 מיקרומולר.

מערבבים את הדגימה עם טריפסין ביחס מולארי של 10 לאחד של חלבון לטריפסין ומדגרים את התערובת הזו ב-60 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. בינתיים, חבר את לולאת הדגימה, מלכודת הפפטיד והעמודה האנליטית לשסתום מערכת HPLC. לאחר עיכול החלבון, הרוו את התגובה על ידי הוספת 0.1% חומצה פורמית במים כדי להניב ריכוז חלבון סופי של שתי מיקרומולר.

בשלב הבא לתכנת את המערכת בשיטות HPLC וספקטרומטריית מסה. כאן מזריקים ומפילים 20 פיקומולים של המיוגלובין המעוכל במלכודת הפפטידים למשך 1.5 דקות עם 5% אצטו ניטריל ו-0.1% חומצה פורמית מסירים את הפפטידים על ידי הגדלת השיפוע במשך 22 דקות ל-55% אצטיל ניטריל ואוספים את ספקטרום המסה בטווח שבין 100 ל-1700 מסה ליחס מטען. השתמש בכלי מקוון כדי לחשב את המסה התיאורטית של הפפטיד.

תוספת פוטו לאוצין עם מספרי הפוטו לאוצין שהתקבלו בעבר מניתוח החלבון השלם. כלול לפחות ארבעה מחשופים שהוחמצו. צור רשימה המונית ב- Excel עבור תוספת לאוצין צילום פפטיד.

לאחר מכן, התאם את רשימת המסות התיאורטית למסות שנצפו בניסוי על ידי הגדרת נקודת חיתוך לזיהוי מסות עם שגיאה נמוכה. במהלך חילופי מימן דאוטריום, התפתחות החלבון מאפשרת החלפת מימן בחלבוני דאוטריום השומרים על המבנה שלהם פחות מועדים להחלפת דאוטריום. כאשר בוצעה ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן דאוטריום במצב מוצק על פורמולציות מיוגלובין המכילות טאלוז וסורביטול, הפורמולה המכילה סורביטול הראתה ספיגת דאוטריום גדולה יותר ב-46%, מה שמצביע על כך שמבנה המיוגלובין בסורביטול מופרע יותר במהלך התהליך הליטי.

צילום לאוצין קישורים צולבים לשרשראות צד של חומצות אמינו נגישות. ניתוח ספקטרומטריית מסה פוטו-ליטית במצב מוצק של הסורביטול וה-TLOs המכילים ניסוחים של מיוגלובין הראה יותר קליטת פוטו איין בניסוח ה-TLOs מאשר מקבילו. זה מצביע על כך שהשרשראות הצדדיות נותרו נגישות בניסוח ה-TLOs.

גם חילופי מימן דאוטריום וגם תיוג ליטי משתמשים באזורים זמינים מסחרית ובמכשור טרשת נפוצה זמין כדי לאפיין חלבונים במצב מוצק עבור כל פורמולה נתונה. תיעוד הזמן הכולל מהכנת הדגימה ועד לניתוח הנתונים המלא הוא פחות משבועיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג מידע ברזולוציה גבוהה על מבנה החלבון וחשיבותו בתכנון ניסוחים יציבים של חלבון ליופילי.