Name: Mass spectrometric גישות לחקר מבנה חלבון ואינטראקציות באבקות Lyophilized (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: חקור שיטות ספקטרומטריית מסה לניתוח מבנה חלבונים באבקות ליופיליזציה. למד כיצד ssHDX-MS ו-ssPL-MS מספקות מידע ברזולוציה גבוהה על יציבות חלבונים במצב מוצק ועל אינטראקציות בין מולקולריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים בהכרת תודה על התמיכה הכספית של NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) ומהמכללה לרוקחות באוניברסיטת פרדו.

<ol><li>Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Billion+dollar+babies--biotech+drugs+as+blockbusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters.</a> Nat. Biotechnol. 25 (4), 380-382 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+Markets+and+Manufacturing+Technologies+for+Protein+Drugs%22">Global Markets and Manufacturing Technologies for Protein Drugs</a>. , BCC Research. BIO021D(2013).</li>
<li>Lai, M. C., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+chemical+stability+of+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Solid-state chemical stability of proteins and peptides.</a> J. Pharm. Sci. 88 (5), 489-500 (1999).</li>
<li>Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations%3A+some+practical+advice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice.</a> Pharm. Res. 14 (8), 969-975 (1997).</li>
<li>Carpenter, J. F., Chang, B. S., Garzon-Rodriguez, W., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations%3A+theory+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice.</a> Pharm. Biotechnol. 13, 109-133 (2002).</li>
<li>Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+determination+in+solution+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 265 (36), 22059-22062 (1990).</li>
<li>Ilari, A., Savino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+determination+by+x-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein structure determination by x-ray crystallography.</a> Methods. Mol. Biol. 452, 63-87 (2008).</li>
<li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+and+NMR+reveal+complementary+views+of+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure and dynamics.</a> Nat. Struct. Biol. 4, 862-865 (1997).</li>
<li>Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amorphous+pharmaceutical+solids%3A+preparation%2C+characterization+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization.</a> Adv Drug. Deliv. Rev. 48 (1), 27-42 (2001).</li>
<li>Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+infrared+spectroscopy+to+monitor+protein+structure+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and stability.</a> Expert. Rev. Proteomics. 2 (5), 731-743 (2005).</li>
<li>Grohganz, H., Gildemyn, D., Skibsted, E., Flink, J. M., Rantanen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+solid-state+analysis+of+freeze-dried+protein+formulations+using+NIR+and+Raman+spectroscopies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid solid-state analysis of freeze-dried protein formulations using NIR and Raman spectroscopies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (7), 2871-2875 (2011).</li>
<li>Bai, S., Nayar, R., Carpenter, J. F., Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+determination+of+protein+conformation+in+the+solid+state+using+near+infrared+%28NIR%29+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive determination of protein conformation in the solid state using near infrared (NIR) spectroscopy.</a> J. Pharm. Sci. 94 (9), 2030-2038 (2005).</li>
<li>Pikal, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+state+chemistry+of+proteins%3A+II.+The+correlation+of+storage+stability+of+freeze-dried+human+growth+hormone+%28hGH%29+with+structure+and+dynamics+in+the+glassy+solid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid.</a> J. Pharm. Sci. 97 (12), 5106-5121 (2008).</li>
<li>Wang, B., Tchessalov, S., Cicerone, M. T., Warne, N. W., Pikal, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sucrose+level+on+storage+stability+of+proteins+in+freeze-dried+solids%3A+II.+Correlation+of+aggregation+rate+with+protein+structure+and+molecular+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Impact of sucrose level on storage stability of proteins in freeze-dried solids: II. Correlation of aggregation rate with protein structure and molecular mobility.</a> J. Pharm. Sci. 98 (9), 3145-3166 (2009).</li>
<li>Schule, S., Friess, W., Bechtold-Peters, K., Garidel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+protein+secondary+structure+during+spray-drying+of+antibody%2Fmannitol+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of protein secondary structure during spray-drying of antibody/mannitol formulations.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 65 (1), 1-9 (2007).</li>
<li>Baerga-Ortiz, A., Hughes, C. A., Mandell, J. G., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+of+a+monoclonal+antibody+against+human+thrombin+by+H%2FD-exchange+mass+spectrometry+reveals+selection+of+a+diverse+sequence+in+a+highly+conserved+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein.</a> Protein. Sci. 11 (6), 1300-1308 (2002).</li>
<li>Coales, S. J., Tuske, S. J., Tomasso, J. C., Hamuro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+by+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+coupled+with+immobilization+of+antibody%2C+on-line+proteolysis%2C+liquid+chromatography+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid.+Commun.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry.</a> Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23 (5), 639-647 (2009).</li>
<li>Pacholarz, K. J., Garlish, R. A., Taylor, R. J., Barran, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+based+tools+to+investigate+protein-ligand+interactions+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry based tools to investigate protein-ligand interactions for drug discovery.</a> Chem. Soc. Rev. 41 (11), 4335-4355 (2012).</li>
<li>Houde, D., Peng, Y., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+differentially+affect+IgG1+conformation+and+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation and receptor binding.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (8), 1716-1728 (2010).</li>
<li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (6), 2071-2086 (2011).</li>
<li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photolabile+ligands+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Using photolabile ligands in drug discovery and development.</a> Trends. Biotechnol. 18 (2), 64-77 (2000).</li>
<li>Robinette, D., Neamati, N., Tomer, K. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoaffinity+labeling+combined+with+mass+spectrometric+approaches+as+a+tool+for+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Photoaffinity labeling combined with mass spectrometric approaches as a tool for structural proteomics.</a> Expert. Rev. Proteomics. 3 (4), 399-408 (2006).</li>
<li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Research+of+the+National+Bureau+of+Standards%22%5BJournal%5D)">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A (1), 8(1977).</li>
<li>Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+1.+Exchange+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 718-726 (2012).</li>
<li>Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+inexpensive+refrigerated+LC+system+for+H%2FD+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An efficient and inexpensive refrigerated LC system for H/D exchange mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22 (8), 1472-1476 (2011).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic. Acids. Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li>
<li>Sophocleous, A. M., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+2.+Exchange+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 727-733 (2012).</li>
<li>Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+Protein+Aggregation+during+Storage+in+Lyophilized+Solids+Using+Solid+State+Amide+Hydrogen%2FDeuterium+Exchange+with+Mass+Spectrometric+Analysis+%28ssHDX-MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS).</a> Mol. Pharm. 11 (6), 1869-1879 (2014).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203 (1-2), 1-60 (2000).</li>
<li>Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+buffer+composition+and+processing+conditions+on+aggregation+of+bovine+IgG+during+freeze-drying%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying.</a> J. Pharm. Sci. 88 (12), 1354-1361 (1999).</li>
<li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+protein+structure+in+amorphous+solids+using+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 366 (1), 18-28 (2007).</li>
<li>Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+conformation+in+amorphous+solids+by+FTIR+and+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Biophys. J. 95 (12), 5951-5961 (2008).</li>
<li>Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolytic+labeling+to+probe+molecular+interactions+in+lyophilized+powders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders.</a> Mol. Pharm. 10 (12), 4629-4639 (2013).</li>
<li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (81), e50839(2013).</li>
<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2FD+exchange+and+mass+spectrometry+in+the+studies+of+protein+conformation+and+dynamics%3A+is+there+a+need+for+a+top-down+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach.</a> Anal. Chem. 81 (19), 7892-7899 (2009).</li>
<li>Jumper, C. C., Schriemer, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+laser-initiated+carbene+reactions+for+protein+topographic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis.</a> Anal. Chem. 83 (8), 2913-2920 (2011).</li>
<li>Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+excipients+on+protein+conformation+in+lyophilized+solids+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Pharm. Res. 25 (2), 259-267 (2008).</li>
<li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+and+calcium+exert+site-specific+effects+on+calmodulin+conformation+in+amorphous+solids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids.</a> Biotechnol. Bioeng. 97 (6), 1650-1653 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מספר מחקרים הראו כי הסביבה המקומית בדגימות lyophilized משפיעה פירוק חלבונים 5,29,30. עם זאת, הקמת מערכת יחסים ישירים בין מבנה חלבון ויציבות במצב המוצק לא הייתה אפשרית בשל חוסר שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה. היישום של שיטות קיימות ברזולוציה גבוהה כגון HDX וPL לאבקות lyophilized דורש שינוי של פרוטוקולי פתרון ופרשנות נתונים זהירים. HDX-MS וPL-MS אומצו ברציפות לפקח על תצורות חלבון במצב המוצק. התוצאות שהוצגו כאן ובמקומות אחרים 27,28,31-33 הדגימו את היכולת של שיטות אלה כדי לפקח קונפורמציה חלבון עם רזולוציה גבוהה בסביבה המוצקה. למרות שהשלבים הקריטיים בניתוח הנתונים אינם משתנים מתיוג בפתרון 34-36, שיקולים חשובים בעת התקנה ניסיונית ופרשנות נתונים נדרשים לחמי מצב מוצקתיוג cal. בחירה של מגיב התיוג חייבת להיות מבוססת על גודל ומנגנון של תיוג. הגודל הקטן של דאוטריום מאפשר את עמוד השדרה פפטיד שחקר בקלות, ואילו הגודל גדול יחסית של pLeu מגביל תיוג לצד הרשתות. שני ssHDX וssPL לא מראים העדפה לכל חומצת אמינו, כך שהתיוג תלוי רק בעמוד השדרה וצד-שרשרת חשיפה למטריצה. לחקור ביעילות תצורות חלבון במצב מוצק, הגורמים החיצוניים המשפיעים על תהליך התיוג חייבים להיות מבוקרים בקפידה. הסכום הכולל ואת הפריסה המרחבית של סוכן תיוג במוצקים lyophilized שונה מתמיסות מימיות. בssHDX, הסכום של D 2 O במטריצה ​​המוצקה עשוי להשפיע על השיעור של חלבון התגלגלות (או התגלגלות חלקי), מקפלים, וחילופי דאוטריום. זה לא המקרה עם הפתרון HDX, שבמדגם החלבון בדרך כלל מדולל עם נפח מספיק של D 2 O.סינון קפדני של ההשפעות של לחות בשיעור ssHDX יכול ליידע את הבחירה של תנאי RH אידיאליים. כדי לשלוט בקצב ספיחת לחות ולמנוע קריסה של האבקה בניסוחים המכילים חומרים בלתי פעיל hygroscopic (למשל סוכרוז וtrehalose), ssHDX עשויה להתבצע בתנאי קירור (2-8 מעלות צלזיוס). המחקר הקודם שלנו על השפעות לחות הראה גדילת שיעור והיקף של חליפין עם עלייה בתכולת לחות, כצפוי. בחלק גדול מהעבודה שלנו, RH ביניים של 43% ב -5 ° C הוכיח להיות אידיאלי להבחין ניסוחים בזמן סביר 24. התגובה מתבצעת בדרך כלל עד שתגיע לרמה. הדבר מבטיח כי ספיחת הלחות ודיפוזיה לתוך מוצק לא שולטים בקצב HDX. השימוש בגדלי מדגם מוצקים קטנים עם מראש lyophilization נפח של ≤2 מיליליטר גם מסייע להבטיח כי ספיחת אדי D 2 O היא למעשה מלאה בתחילת תקופת החליפין. למרות ssHDX-MS מספקמידע כמותי על קונפורמציה של חלבון במצב מוצק, יש תנאים מסוימים שבם פרשנות של נתונים אינן יכולה להתבסס אך ורק על מחקר ssHDX לבד. זה אפשרי כי ספיגת דאוטריום ירד נצפתה במדגם (בהשוואה לקבוצת ביקורת) יכולה להיות בגלל השימור גבוה יותר של מבנה חלבון או הכמות המשמעותית של אגרגטים חלבון בדגימה. במקרה כזה, פרשנות של נתונים ssHDX דורשת תוצאות משיטות משלימות אחרות. הרחבת שיא בספקטרום המוני deuterated נצפתה במשך כמה ניסוחים Mb 27,28. זה יכול להיות בגלל גורמים שונים כמו הנוכחות של אוכלוסיית חלבון מקופלת באופן חלקי, ההטרוגניות המרחבית במדגם, או הדרגתיים המרחבית בריכוז D 2 O. עם זאת, גורמים אלה לא הבחינו בssHDX-MS וזקוק לחקירה נוספת. כssPL-MS הוא חדש יחסית בהשוואה לשיטות אחרות, למידה מתמשכת abאת היישומים ואת מגבלותיו נדרש. בssPL, התמונה צולבת-מקשר הוא lyophilized עם החלבון. חוסר הלחות מגביל את הניידות של רכיבים בתוך המטריצה ​​המוצקה, וההרפיה המבנית החלקית שעלולות להתרחש עם ספיחת לחות בssHDX אינה תופעה בssPL. זה מגביל תיוג בssPL לסביבה הקרובה של התמונה צולבת-מקשר. עם זאת, בניגוד לHDX-MS, ניתוח MS / MS של החלבון הנקרא קוולנטית יכול לספק מידע מבני ברמת שאריות. מאז תיוג ssPL הוא קוולנטיים ובלתי הפיך, חזרה בורסה אינה מתרחשת וניתן להכין דגימות וניתחו ללא חשש לאובדן של תווית. כדי להקל על דיפוזיה של סוכן תיוג ולשפר את יעילות תיוג במוצקה-מטריצה, ssPL ניתן לבצע עם הגדלת% RH. ספיגת pLeu גם ניתן לשפר על ידי הגדלת הריכוז של סוכן photoreactive. היחס טוחנת של חלבון לpLeu יכול להיות מגוון לפי צורך. באופן כללי, עודף 100x טוחנת של pLeu לפרוחלבון יבטיח תיוג הולם. עם זאת, ריכוז pLeu גבוה עלול לגרום לאובדן של מבנה שליישונים במטריצה ​​המוצקה. לפיכך, בנוסף לקינטיקה תיוג והרכב ניסוח, בחירה של ריכוז pLeu חייבת גם להיות מבוססת על שמירה על השלמות מבנית של חלבון. כpLeu nonselectively תוויות XH (כאשר X = C, N, O) קבוצה, ייתכן שחומרים בלתי פעיל עם אתרי תיוג דומים יכולים להשפיע על הרמה של תיוג חלבון מאוד. ההתערבות של חומרים בלתי פעילים בזמינות pLeu לתיוג חלבון עדיין לא מאופיינת. זה ידוע שהקרבן שנוצר מהפעלת diazirine לא שאריות ספציפי, אולם מחקר אחד מדווח הטיה כלפי ASP וGlu 36. אמנם זה טוב ללמוד על אינטראקציות שאריות ספציפיות, מידע פפטיד-הרמה הוא גם שימושי וניתן להשתמש בם כדי לעצב חומרים בלתי פעילים לחסום אזורים עם חשיפה גבוהה מטריצה ​​במצב המוצק. ssPL-MS מספק מידע איכותי מפורט, אולםנתונים כמותיים צריכים להשיג ומדדים חזקים צריכים להיות מפותחים כדי לנתח הבדלי ניסוח פני מגוון רחב של מערכות lyophilized. השימוש בתווית שאריות ספציפיות בשילוב עם ניתוח MS / MS יכול לשפר עוד יותר את הרזולוציה לרמת חומצות אמינו. ריאגנטים תיוג כגון 2,3-butanedione לתייג Arg, נגזרי -hydroxysuccinimide N נגזרי -alkylmaleimide ליס וN לCys יכול לשמש כדי למפות בדיוק אינטראקציות מולקולריות באבקת lyophilized. עם זאת ריאגנטים אלה הם pH תלוי והתגובות לא יכולות להיות מבוקרות היטב כתיוג photolytic במצב מוצק. גישה חלופית היא לשלב התמונה צולבת-מקשר לתוך רצף החלבון עם השימוש בקווי auxotrophic תא, מוטגנזה מכוונת או derivatization שרשרת צד. מחקרי ssHDX-MS וssPL-MS הקודמים שלנו הראו כי תיוג של חלבון תלוי באופי וכמות חומרים בלתי פעילהמשמש 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS של Mb שיתוף lyophilized עם hydrochloride guanidine (Gdn.HCl) הראה ספיגת דאוטריום גדולה מMb במשותף עם lyophilized נמוך משקל מולקולרי סוכרים 32. במחקר שssPL-MS נפרד, Mb שיתוף lyophilized עם Gdn.HCl הראה הגנה טובה יותר מתיוג photolytic מ Mb עם סוכרוז 33. יתר על כן, מדידות כמותיות מssHDX-MS כבר מתאם גבוה עם היציבות של חלבון במהלך אחסון לטווח ארוך 28. מחקרים אלו מצביעים על כך שssHDX או ssPL של חלבון משקף את היקף ההחזקה מבנית של החלבון באבקת lyophilized. אנו מאמינים כי השמירה על מבנה המשני באבקות lyophilized מספקת סביבה נוחה לתיוג שרשרת צד עם pLeu והגנה של מימן אמיד מחילופי דאוטריום. עם זאת, השוואה מפורטת של התוכן אינפורמטיבי מהשיטות הללו צריכה להתבצע בעתיד. למרות הקמת השירות של ssHDX-MS וssPL-MSככלי מיון ניסוח סופו של דבר יהיה עליו להיות מיושמים על חלבונים רבים, תוצאות מהמחקרים האחרונים שלנו תומכת באימוץ הרחב יותר שלה. עם התפתחות נוספת, שיטות אלו צפויים להיות שימושיים נרחב לאפיון ניסוחים חלבון מצב מוצק בתעשיית הביו-פרמצבטיקה.

תרופות חלבון הן המגזר בעל הצמיחה המהירה ביותר של תעשיית הביו-פרמצבטיקה ומציעות טיפולים חדשים ומבטיחים לטיפול במחלות סוררות בעבר, כוללים הפרעות הורמונליות, סרטן ומחלות אוטואימוניות 1. בשינה 2012, שוק biotherapeutics העולמי הגיע 138,000,000,000 $ והוא צפוי להגיע 179,000,000,000 $ על ידי השינה 2018 2. החלבונים הם גדולים יותר ושבירים יותר מתרופות מולקולה קטנה קונבנציונליות ולכן הם רגישים יותר לסוגים רבים של השפלה 3. כדי להבטיח חיי מדף ויציבות נאותים, תרופות חלבון לעתים קרובות כפי שנוסחו lyophilized (כלומר, מיובש בהקפאה) אבקות מוצקות. עם זאת, חלבון, עדיין עשוי לעבור השפלה במצב המוצק, במיוחד אם המבנה המקורי שלו לא נשמר במהלך 4,5 תהליך lyophilization. הבטחת המבנה שנשמר היא אפשרית רק אם יש שיטות אנליטיות שיכולה לחקור קונפורמציה חלבון במצב המוצק עם sufficienהרזולוציה t. ספקטרוסקופיה NMR 6 וקריסטלוגרפיה רנטגן 7 הן שיטות הרזולוציה גבוהה הנפוצה המשמשות להערכת מבנה חלבון במוצקים גבישיים ופתרון 8. בגלל האופי של חומרים בלתי פעיל ושיטות העיבוד משמשות, ניסוחים חלבון lyophilized הם בדרך כלל אמורפי ולא גבישים 9. חוסר האחידות וסדר מיקרוסקופי הופך את הטכניקות שהוזכרו לעיל מעשיים עבור חלבונים במוצקים אמורפיים. ספקטרוסקופיית פורה (FTIR) 10, ספקטרוסקופיית ראמאן 11 וספקטרוסקופיה אינפרא אדום הקרובה (NIR) 12 היו בשימוש באופן קבוע על ידי תעשיית הביו-פרמצבטיקה להשוות מבנה שניוני באבקות lyophilized לזה של המבנה-פתרון של המדינה האם. עם זאת, שיטות אלה הן ברזולוציה נמוכה, ורק יכולות לספק מידע על שינויים הגלובליים במבנה משני. אפיון מבני של מצב מוצק באמצעות FTIRהראה גם 13,14 החלש או מתאם 15 עני עם יציבות אחסון לטווח ארוך. מגבלות אלו מדגישות את הצורך בשיטות ברזולוציה גבוהה מתאימות לזהות הפרעות מבניות של חלבונים במצב המוצק. תיוג כימי יחד עם proteolysis וניתוח ספקטרומטריה התפתח גישה רבת עוצמה לניטור מבנה חלבון ואינטראקציות מולקולריות בתמיסה מימית. בפיתוח תרופות, HDX-MS שמש במשך מיפוי epitope באינטראקציות אנטיגן-נוגדן 16,17, כדי למפות אינטראקציות קולט סמים 18, כדי לפקח על ההשפעות של שינויים, שלאחר translational בקונפורמציה של תרופות חלבון 19, וכדי להשוות וריאציה אצווה לתצווה בפיתוח biosimilars 20. באופן דומה, ligands photoactivatable כבר משמש לזיהוי מטרות תרופה ולקבוע זיקה וספציפיות של תגובות בין תרופתי קולט 21,22 מחייבת. לדוארספקטרומטריית Xtend היישום של שיטות אלה לניסוחי lyophilized, הקבוצה שלנו פיתחה מצב מוצק המוני חילופי דאוטריום המימן (ssHDX-MS) וספקטרומטר מסת תיוג photolytic מצב מוצק (ssPL-MS) ללמוד תצורות חלבון ואינטראקציות חומר לא פעילות בדגימות lyophilized עם רזולוציה גבוהה. בשני ssHDX-MS וssPL-MS, החלבון מתויג תחת תנאי תגובה אידיאליים במוצקים lyophilized, ולאחר מכן הדגימות מחדש ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה עם או בלי עיכול מפרקי חלבונים. ssHDX-MS מספק מידע על חשיפת שרשרת העיקרית לאדי דאוטריום, בעוד ssPL-MS מספק מידע על הסביבה של רשתות בצד (איור 1). שתי שיטות ובכך יכולות לספק מידע משלים לגבי קונפורמציה חלבון במצב המוצק. כאן, אנו מספקים פרוטוקול כללי ללימוד חלבונים במוצקים lyophilized באמצעות ssHDX-MS וssPL-MS (איור 2), תוך שימוש בMb כחלבון מודל. אנחנו מראים את היכולת של שתי שיטות ללהבחין בהבדלים בניסוחים עם שני חומרים בלתי פעילים שונים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig1.jpg" /> איור 1:. מבנה חלבון מידת ssHDX וssPL במוצקים lyophilized באמצעות מנגנוני תיוג שונים (א) בHDX, אמיד עמוד השדרה מימנים חליפין עם דאוטריום כפונקציה של מבנה החלבון ו- D 2 O נגישות. במצב המוצק, השיעור ומטבע זר דאוטריום המידה תלויה ברמה של D 2 O וספיחה, ניידות חלבון (התגלגלות וקפל שוב את האירועים) והטבע של החומרים לא הפעילים קיימים במטריצה ​​המוצקה. (ב) בPL, קרינת UV ב365 ננומטר יוזם את הקמתה של קרבן תגובת ביניים מהקבוצה הפונקציונלית diazirine של pLeu והוכנס אינו ספציפי לכל אג&quot;ח XH (x = כל אטום) או, מודעהטוליפ אין על פני אג&quot;ח = C C בסביבתו הקרובה. במצב המוצק, השיעור ושל תיוג המידה תלויה בריכוז המקומי סוכן התיוג של, זמן הקרנה, מבנה חלבון והטבע של חומרים לא פעילים קיימים במטריצה ​​המוצקה. לוחות A ו- B להראות התיוג התיאורטי המרבי שיכול להתרחש על עמוד השדרה וצד-רשתות בהתאמה בחלבון. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig2.jpg" /> איור 2: מצב מוצק מראה סכמטי HDX-MS () וPL-MS (B) לחלבון בניסוח lyophilized.

<table><tbody><tr><td>מיוגלובין סוסים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M0630-5G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-טרהלוז דיהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>#T9531</td><td></td></tr><tr><td>D-סורביטול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>#240850</td><td></td></tr><tr><td>L-פוטו-לאוצין</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>#22610</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>#P0662</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>#P3786</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת דאוטריום</td><td>מעבדות איזוטופ קיימברידג'</td><td>#DLM-4-PK</td><td>חלופי (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich)</td></tr><tr><td>Immobilized pepsin</td><td>Applied Biosystems</td><td>#2-3132-00</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>#V511A</td><td>Chymotrypsin (Cat. מס ': #V1062, Promega) ניתן להשתמש בנוסף</td></tr><tr><td>מים, אופטימה LC / MS כיתה</td><td>פישר כימי</td> <td># 7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td> <td># 34998</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>תרמו מדעי</td> <td># 28905</td><td></td></tr><tr><td>ESI-TOF Calibrant</td><td>Agilent Technologies</td><td>#G1969-85000</td> מיקרוטראפ <td>חלבון נוזלי דליק מאוד</td></tr><tr><td></td><td>Michrom Bioresources</td><td>TR1/25108/03</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מלכודת פפטיד</td><td>Michrom Bioresources</td><td>TR1/25109/02</td><td></td></tr><tr><td>טור אנליטי</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td></td></tr><tr><td>מייבש הקפאה</td><td>VirTis AdVantage Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker מצויד בחמש מנורות 365 ננומטר</td><td>Stratagene Corp.</td>מערכת LC מקוררת LC מסדרת <td>Stratalinker 2400</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td>1200 עבור</td><td>HDX-MS</td></tr><tr><td>ESI-qTOF MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6520 qTOF</td><td></td></tr><tr><td>HDExaminer (תוכנת ניתוח נתונים HDX-MS)</td><td>Sierra Analytics</td><td></td><td>http://www.massspec.com/HDExaminer.html</td></tr></tbody></table>

mass spectrometric גישות לחקר מבנה חלבון ואינטראקציות באבקות lyophilized

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

מימן אמיד / החלפת דאוטריום (ssHDX-MS) ותיוג photolytic צד שרשרת (ssPL-MS) ואחריו ניתוח ספקטרומטריה יכולים להיות בעל ערך לאפיון הניסוחים lyophilized של תרופות חלבון. תיוג ואחרי עיכול מפרקי חלבונים מתאים מאפשר מבנה החלבון והאינטראקציות להיות ממופים עם רזולוציה ברמה-peptide. מאז חלבון אלמנטים מבניים התייצבו על ידי רשת של קשרים כימיים מהראשיות-הרשתות וצד-שרשרות של חומצות אמינו, תיוג ספציפי של אטומים בשאריות חומצת אמינו מספק תובנה המבנה והמבנה של החלבון. בניגוד לשיטות שגרתיות משמשות ללמוד חלבונים במוצקים lyophilized (למשל, FTIR), ssHDX-MS וssPL-MS לספק מידע כמותי וספציפי לאתר. התאגדות דאוטריום ופרמטרים הקינטית המידה יכולה להיות קשורה במהירות ובאיטיות להחלפת בריכות אמיד (מהיר N, N איטי) וישירות משקף את מעלותרי של קיפול חלבונים ומבנה בניסוחי lyophilized. תיוג photolytic יציב אינו עובר בחזרה לבורסה, יתרון על פני ssHDX-MS. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לשני ssHDX-MS וssPL-MS, באמצעות מיוגלובין (Mb) כחלבון מודל בניסוחי lyophilized המכילים גם trehalose או סורביטול.

כאן, ssHDX-MS וssPL-MS היו בשימוש כדי לחקור את ההשפעה של חומרים בלתי פעילים באינטראקציות קונפורמציה ומצב המוצק של תצורות Mb lyophilized. הריכוזים של חלבון וחומרים בלתי פעילים ששמשו במחקר זה מוצגים בטבלת 1. נציגי תוצאות מניתוח ssHDX-MS וssPL-MS של Mb lyophilized מתקבל על ידי הבא הפרוטוקולים מעל מוצגים. ספיגת דאוטריום ברמת חלבון שלמה ssHDX-MS הוא מסוגל להבחין בין הניסוחים Mb ברמה שלמה. ספקטרה ההמונית deconvoluted של Mb ללא פגע הבא 144 שעות של ssHDX מMBS הניסוח הראתה ספיגת דאוטריום גדולה מניסוח MBT (איור 3 א). בממוצע, MBS הראה ספיגת דאוטריום 46% יותר מאשר MBT (טבלה 2). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig3.jpg"/&gt; איור 3: ssHDX-MS לMb שלם: (א) ספקטרום המוני Deconvoluted של Mb ללא פגע deuterated מניסוחי MBT (קו מוצק) וMBS (קו מקווקו) הבא 144 שעות של ssHDX. הספקטרום ההמוני deconvoluted של Mb ללא פגע undeuterated מוצג גם (קו מקווקו). (ב) קינטיקה ssHDX לMb ללא פגע בניסוחי MBT (קו מוצק) וMBS (קו מקווקו). במהלך ssHDX הזמן היה מצויד למשוואה עבור עמותת מעריכי שני שלב באמצעות גרף Pad Prism גרסת תוכנת 5 (n = 3, ± SD). קינטיקה deuteration לMBS שלם וMBT דומה בנקודות זמן מוקדמות (1-4 שעות), אבל MBS הראה גדילת חילופי דאוטריום עם עלייה בזמן (8-144 שעות) (איור 3). הדבר מצביע על החשיבות של בחירת נקודות זמן ארוכה יותר לssHDX בתנאי RH וטמפרטורה נמוכים יותר. כמו כן, תהליך הספיחה ודיפוזיה 2 O D עשוי להשפיע על השיעור של ssHDX בפו המוקדם הזמןints. המחקרים הקודמים שלנו הראו כי ספיחת לחות בssHDX תושלם בתקופה של שעות, ויש לו תרומה מינימאלית להחליף קינטיקה מעבר לכך זמן. השיעור ומטבע זר במידה שנצפה לכן אינו פשוט אמצעים של D 2 O adsorbtion 27,28. הברים הקטנים השגיאה באיור 3, המצביעים על סטיות תקן משלוש דגימות ssHDX-MS עצמאיות, עולים כי הניסוי הוא מאוד לשחזור. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> דאוטריום הספיג (%) ב </td><td> ג המהיר N </td><td> k ג המהיר </td><td> ג האיטי N </td><td> k ג האיטי </td></tr><tr><td> MBT </td><td> 15.9 ± 0.5 </td><td> 13.1 (0.8) </td><td> 0.43 (0.03) </td><td> 11.0 (0.9) </td><td> 0.019 (0.001) </td></tr><tr><td> MBS </td><td> 23.2 ± 0.5 </td><td> 15.4 (0.7) </td><td> 0.49 (0.04) </td><td> 19.2 (0.6) </td><td> 0.024 (0.002) </td></tr><tr><td> % השינוי ד </td><td> 46% </td><td> 18% </td><td> 14% </td><td> 75% </td><td> 26% </td></tr></tbody></table> טבלה 2:. מדדי כמותיים של ספיגת דאוטריום במחקרי ssHDX של ניסוחים Mb ראה טבלה 1 להרכב ספיגת דאוטריום אחוזים ב ביחס למקסימום תיאורטי על ידי Mb ללא פגע אחרי 144 שעות של HDX ב 5 מעלות צלזיוס, 43% לחות יחסית (n = 3. , פרמטרים ממוצעים ± SD). ג נקבעו על ידי רגרסיה ליניארית של נתונים קינטית ssHDX-MS. כמובן זמן של חילופי דאוטריום לMb שלם היה מצויד למודל עמותת biexponential (Eqn. 2). ערכים בסוגריים סטיות התקן של הפרמטרים רגרסיה. ד השינוי באחוזים במדידות היו calcul<html> ated כמו 100 x [(ערך מMBS - הערך מMBT) / (ערך מMBT)]. הפרמטרים רגרסיה (מהיר N, N איטי, k מהיר ואיטי k) לקינטיקה ספיגת דאוטריום לMBT MBS ומוצגים בטבלה 2. למרות ערכים מהירים ואיטיים N N גדולים יותר לMBS מ MBT, הבדלים בN האיטי ערכים היו גדולים יותר מהבדלים בערכים מהירים N. באופן ספציפי, הערך המהיר N הוא רק 18% יותר מאשר בMBS MBT, ואילו הערך האיטי N הוא 75% יותר מאשר בMBS MBT. הדבר מצביע על כך את הערכים איטיים N הקטנים יותר בMBT יכולים להיות בגלל השימור גבוה יותר של מבנה Mb או הגנה של קבוצות אמידי בחומרים בלתי פעילים שנחשפים לD 2 O בMBS. עם זאת, המנגנונים מפורטים אינם מובן באופן ברור. קבועי קצב (k מהיר ואיטי k) עבור שני הניסוחים דומים מאוד. = &quot;Jove_content&quot; ילדה&gt; ספיגת דאוטריום ברמת פפטיד בעקבות עיכול פפסין, כולל של 52 פפטידים זוהו. שישה שברים שאינם המתאימים למיותרים של רצף Mb 100% שמשו לניתוח דיווח כאן. ניתן להשיג מידע נוסף על ידי שימוש שבברים חופפים, כפי שדווח על ידי הקבוצה שלנו בעבר 24. ספיגת דאוטריום אחוזים לכל פפטיד חושב והתוצאות מדגימות 144 שעות זממו (איור 4 א). קינטיקה HDX לשישה שברים פפטי הראתה התנהגות biexponential (איור 4), עולה בקנה אחד עם תת-אוכלוסיות של אטומי מימן אמיד שעברו תמורה &quot;מהירה&quot; ו&quot; איטי &quot;. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig4.jpg" /> איור 4: ssHDX-MS לMb ברמת פפטיד: (א) ספיגת דאוטריום אחוזים במשך 6 שאינו reduשברים פפטי ndant מMb בניסוחי MBT (אפור) וMBS (לבן) הבאים 144 שעות של HDX. קינטיקה (B) ssHDX לשישה שברים פפטי אינם מיותרים מMb בניסוחי MBT (קו מוצק) וMBS (קו מקווקו). במהלך ssHDX הזמן היה מצויד למשוואה עבור עמותת מעריכי שני שלב באמצעות גרף Pad Prism גרסת תוכנת 5 (n = 3, ± SD). פרמטרים רגרסיה לפפטידים nonredundant מוצגים באיור 5. כקבועי קצב המותאמים לברי פפטיד אינם קבועים שיעור הממוצע אורגניים חיבור בודד, קבועי קצב שנצפו לברים פפטי לא יכולים להיות קשורים באופן ליניארי לאלו של החלבון שלם. הערכים מהירים N עבור רוב שברים פפטי (למעט 56-69 בר) בMBS ניסוחים היו מעט גדולים יותר מאלה בMBT (איור 5 א). באופן דומה, הערכים מהירים k בדרך כלל הראו הבדל קטן בין formulations ובאזורים שונים של מולקולת Mb (איור 5). עם זאת, הערכים איטיים איטיים וk N לMBS הם גדולים יותר באופן משמעותי בכל הברים מאשר לMBT (איור 5 ג ו5D). הגידול הניכר בk האיטי וN האיטי לMBS עשוי לשקף ניידות רבה יותר של קבוצות אמידי בבריכות &quot;איטיות&quot; החלפה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig5.jpg" /> איור 5: פרמטרים הקינטית ssHDX לפפטידים פפטי Mb: N מהיר (א), k המהיר (B), N האיטי (C) וk ערכים איטיים (D) המתקבלים מרגרסיה ליניארית של נתונים קינטית ssHDX-MS לשישה פפטידים פפטי אינם מיותרים מMb בניסוחי MBT (אפור) וMBS ( לבן) (n = 3, ± SE). &lt;/ P&gt; תיוג photolytic ברמת חלבון שלם Mb מוקרן בנוכחות 20x pLeu העודף נוצר Mb-pLeu adducts מרובה, כפי שזוהה על ידי LC-MS (איור 6 א). ספקטרום deconvoluted לMBT מוקרן במשך 40 דקות עם 20x pLeu הראה עד 3 תוויות עם התוספת של 115, 230 וDa 345 למסה של Mb ללא תווית. MBS מוקרן באופן דומה עם 20x pLeu הראה פחות ספיגת pLeu ברמה שלמה, עם עד 2 אוכלוסיות שכותרתו זוהו על ידי LC-MS. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig6.jpg" /> איור 6: ssPL-MS לMb שלם: (א) ספקטרום המוני Deconvoluted לMBT (קו מוצק) וMBS (קו מקווקו) שכותרתו עם 20x עודף (5% w / w) pLeu. ספקטרום המוני Deconvoluted של Mb ילידים (Mb lyophilized ומוקרן בהעדר pLeu) מוצג כקו המקווקו. U </em&gt; מציין אוכלוסייה של חלבון שנותרה ללא תווית לאחר הקרנה. אוכלוסיות של חלבון נושא 1, 2 ו -3 תוויות pLeu מיוצגות כ1 ליטר, 2L ו3L בהתאמה. קינטיקה (B) ssPL-MS לMb ללא פגע בניסוחי MBT (מעגלים סגורים) וMBS (עיגולים פתוחים) כפונקציה של ריכוז pLeu. כל הדגימות היו מוקרנים במשך 40 דקות. ברים שגיאה נמצאים בסימנים. (C) קינטיקה ssPL-MS לMb ללא פגע בניסוחי MBT (מעגלים סגורים) וMBS (עיגולים פתוחים) lyophilized ומוקרן בנוכחות 100x pLeu העודף (20.7% w / w) כפונקציה של זמן הקרנה. ברים שגיאה נמצאים בסימנים. במחקרים הקינטית, אחוזים של חלבון שכותרתו גדלו באופן אקספוננציאלי עבור שני MBS MBT ועם זמן הקרנת הגדלת (איור 6). MBS הראה פחות ספיגת pLeu מ MBT בכל פעם שקרינה. שני הניסוחים הופיעו להגיע לרמה של 40 דקות. לפיכך, מחקר הקינטית יכול להיות לנו<html> eful כדי לקבוע את משך ההקרנה הדרושה כדי להשיג הפעלת pLeu מלאה. קינטיקה התיוג נחקרו גם כפונקציה של ריכוז pLeu (איור 6 ג). אחוזים מהחלבון שכותרתו גדלו עם ריכוז pLeu עבור שני MBS MBT ו. עם זאת, ב20.7% w / w pLeu, MBT הראה ירידה בספיגת pLeu. זה יכול להיות בגלל ההרחקה של pLeu מפני שטח של החלבון בריכוז גבוה pLeu. לפיכך, יש לבצע מחקר עם משתנה ריכוז של pLeu כדי לבחור את ריכוז pLeu המתאים המאפשר תיוג מספיק על פני השטח החלבון ללא הדרת פני השטח. במחקר זה, 20x pLeu העודף נבחר למחקרים נוספים ברמה-peptide. הכוללים ירידה בתיוג נצפה עבור MBS מציע נגישות צד שרשרת עניה למטריצה ​​המכילה pLeu. זה עולה בקנה אחד עם שינוי קונפורמציה בנוכחות סורביטול כי תוצאות תיוג מופחת. תוכן &quot;&gt; תיוג photolytic ברמת פפטיד בהתבסס על מחקרי תיוג חלבון שלמים, 20x pLeu העודף נבחר כדי להשוות MBT MBS וברמת פפטיד. דגימות שכותרתו היו מתעכלים עם טריפסין ונותחו על ידי LC-MS. סך של 40 פפטידים המקביל לשל רצף Mb 100% אותרו עבור דגימות MBT MBS ו. בחלק מהמקרים, עיכול tryptic עשוי לספק כיסוי רצף חלבון מוגבל אם שאריות ליס ו / או Arg מסומנים בכבדות. כדי לשפר את כיסוי רצף, תערובת של טריפסין וchymotrypsin ניתן להשתמש כדי לעכל את החלבון שכותרתו. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig7.jpg" /> איור 7: ssPL-MS לMb ברמת פפטיד: ייצוג קריקטורה של Mb שכותרתו עם 20x pLeu העודף (5% w / w) בנוכחות trehalose () וסורביטול (B). החלבון שכותרתו היה מתעכל עם trypsin ופפטידים שכותרתו מופו על המבנה הגבישי של Mb (PDB מזהה 1WLA). אזורי שכותרתו וללא תווית בצבע ארגמן וירוק, בהתאמה. ssPL-MS עם עיכול טריפסין מספק מידע איכותי על פפטידים להיות מתויגים. בהתחשב באוכלוסיות שכותרתו השונות ברמה שלמה, המנגנון המופקר של תיוג pLeu והבדלים ביעילות יינון של פפטידים שכותרתו וללא תווית, שקשה להשיג מדדי כמותיים לssPL-MS לאחר עיכול. עם זאת, המידע האיכותי עדיין יכול לספק תובנה שינויי קונפורמציה חלבון ברמת פפטיד. במחקר זה, ניסוחים שני MBT MBS והראו ספיגת pLeu פני רוב שטח החלבון. בהשוואה לMBS, שברי פפטיד 32-42, 134-139 ו146-153 מMBT הראו תיוג pLeu (איור 7). הדבר מצביע על כך בצד-השרשרות של חומצות אמינו אלה חשופות לpLeu, כסלילים בregio אלהns הם שלמים במטריצת MBT. בניגוד לכך, ההגנה מפני תיוג pLeu במטריצת MBS עולה בקנה אחד עם הפרעות מבניות באזורים אלה. בסך הכל, התוצאות מssHDX-MS וssPL-MS מצביעות על כך שהשיטות יכולות לספק מידע ברמה-peptide ברזולוציה גבוהה משלים על עמוד השדרה (ssHDX-MS) וצד-שרשרת (ssPL-MS) השפעות חשיפה וחומר לא פעיל בניסוחי חלבון lyophilized .

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לספקטרומטריית מסה של חילופי מימן/דאוטריום במצב מוצק (ssHDX-MS) וספקטרומטריית מסה של תיוג פוטוליטי במצב מוצק (ssPL-MS) עבור חלבונים באבקות מוצקות. השיטות מספקות מידע ברזולוציה גבוהה על קונפורמציה של חלבונים ואינטראקציות במצב מוצק אמורפי, שעשוי להיות שימושי בתכנון ניסוח.

Mass spectrometric גישות לחקר מבנה חלבון ואינטראקציות באבקות Lyophilized

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לנטר את מבנהו של חלבון ברזולוציה גבוהה באמצעות החלפת מימן-דאוטריום וסימון ליתי של שרשראות צד, בשילוב עם ספקטרומטריית מסות. הדבר מושג תחילה על ידי ליופיליזציה של החלבון בנוכחות סוגים שונים של חומרי עזר. בהחלפת מימן-דאוטריום במצב מוצק, החלבון הליופיליזי נחשף לאדי דאוטריום אוקסיד בתוך מייבש אטום, תחת לחות יחסית וטמפרטורה מבוקרות.עבור סימון ליטי, החלבון עובר ליופיליזציה עם חומרים עזריים וסוכן פוטו-ריאקטיבי. לאחר מכן, המבחנה מקרינה באור UV כדי להצמיד את הסוכן לחלבון באופן קוולנטי. עבור כל שיטה, הדגימות מומסות מחדש ומנותחות באמצעות ספקטרומטר מסות ברזולוציה של חלבון שלם ושל פפטידים.שתי שיטות אלו מספקות מידע משלים. פורמולציות שבהן המבנה החלבוני נשמר במידה רבה, מראות ספיגה מופחתת של דאוטריום וסימון ליטי מוגבר, בעוד שפורמולציות עם מבנה משובש מראות ספיגה מוגברת של דאוטריום וסימום ליטי מופחת. סימון כימי, כגון החלפת מימן בדאוטריום וקשירה צולבת פוטוכימית בשילוב עם אנליזה ספקטרומטרית של מסות, הותאם לאחרונה לחקר מבנה חלבונים ואינטראקציות בתוך תמיכות חיות.היתרון המרכזי של טכניקות אלו על פני שיטות קיימות, כגון ספקטרוסקופיית CD ו-FDIR, הוא שניתן לבחון את מבנה החלבון ואת סביבתו ברזולוציה גבוהה במצב מוצק. ראשית, הכניסו 200 milliliters של deuterium oxide למדף התחתון של תא ייבוש (desiccator) והוסיפו 400 grams של potassium carbonate כדי ליצור תמיסה רוויה. הכניסו את פלטת הפורצלן של תא הייבוש ואטמו אותו באופן הרמטי. המתינו עד להשגת שיווי משקל בטמפרטורה של 5 °C כדי להגיע ללחות יחסית יציבה של כ-43%. לאחר מכן, מקמו את המבחנות הפתוחות המכילות חלבון ליופיליזד במדף העליון של תא הייבוש, אטמו את התא והדגירו בטמפרטורה של 5 °C.כדי להתחיל את תגובת חילוף המימן-דאוטריום (hydrogen deuterium exchange) לאיסוף דגימה, סגרו את הבקבוק מיד לאחר הוצאתו מהמייבש, ולאחר מכן עצרו את התגובה על ידי הקפאה מהירה (flash freezing) של הבקבוק בחנקן נוזלי. אחסנו את הבקבוק בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לביצוע האנליזה בספקטרומטריית מסות. השתמשו בספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה כדי לנתח את הדגימות במטרה למזער חילוף חוזר (back exchange).כיצד ממוקמת מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית בתוך תיבה מקוררת? כדי להגדיר את המכשיר תחילה, חברו את לולאת הדגימה ואת מלכוד החלבון לשסתום השולט בתהליכי הסרת המלחים (desalting) והאלוציה. לאחר מכן, כיילו את המערכת על ידי הזרקת תערובת כיוון בריכוז נמוך לספקטרומטר המסה והגדירו את טווח יחס המסה למטען ל-200 עד 3,200.לאחר מכן, קררו את המערכת המקוררת לטמפרטורת עבודה יציבה של כ-0 °C. הכינו את באפר הכיבוי (quenching buffer) המכיל 0.2% formic acid ו-5% methanol במים, וקררו אותו על קרח. לאחר העברת הדגימות לחנקן נוזלי, הוציאו בזהירות מבחנה ושחזרו את הדגימה על ידי הוספה של 2 mL מבאפר הכיבוי.בשלב הבא טענו שיטת HPLC וספקטרומטרית מסות מתאימה. כדי לנתח את הדגימה כאן, בצעו הסמכה של 20 picomoles של myoglobin במלכודת החלבון למשך 1.7 דקות עם 5% acetyl nitrile ו-0.1% formic acid. לאחר מכן, בצעו אלוציה של החלבון על פני גרדיאנט של 3.3 דקות, תוך הגדלה ל-80% aceto nitrile ו-0.1% formic acid.הזריק את הדגימה ואסוף את ספקטראות המסות בטווח של 200 עד 3,200 ליחס מסה למטען. כדי לקבוע את המסה של החלבון השלם כייחוס, השתמש באותה שיטה עם דגימת חלבון בעלת דירוג ידוע. קבע את מסת החלבון על ידי דה-קונוולוציה של הספקטראות הגולמיות באמצעות תוכנה לניתוח נתונים. עבור ניתוח דגימות מיוגלובין, הגדר את טווח המסה בין 15 ל-18 kilodaltons, את רזולוציית המסה ל-one Dalton ואת גובה הפיק ל-90%. עבור ניתוח פפטידים, הכן את הדגימות לפי אותו פרוטוקול המשמש עבור חלבונים שלמים.כאשר הדגימות מוכנות לניתוח, חברו עמודת pepin מקובעת ועמודה אנליטית לשסתום והחליפו את מלכודת החלבונים במלכודת פפטידים. בצעו כיול של המערכת עבור פפטידים כפי שבוצע עבור חלבונים שלמים, אך הגדירו את טווח יחס המסה למטען ל-100 עד 1700, ולאחר מכן קררו את המערכת המקוררת לטמפרטורת עבודה יציבה של כ-0°C. לאחר כיול המערכת, תכנתו את שיטת ה-HPLC והספקטרומטריית המסה המתאימה.בצעי עיכול של 20 picomoles של myoglobin בעמוד Pepin עם 0.1% formic acid במים; תכנת את השיטה ללכידה ולהסמכה (desalt) של הפפטידים במלכוד הפפטידים למשך 1.7 דקות עם 10% acetonitrile ו-0.1% formic acid, ולשחרור (elution) הפפטידים במשך ארבע דקות עם גרדיאנט העולה ל-60% acetonitrile ו-0.1% formic acid. לאחר מכן, הזרק את הדגימה ואסוף את ספקטראי המסות בטווח יחס מסה למטען של 100 עד 1700. נתח דגימת פפטידים לא מזוהה באמצעות ספקטרומטריית מסות טנדם (tandem mass spectrometry) כדי לזהות את המקטעים הפפטידיים.לאחר מכן, השוו את הפירמנט שנקבע בניסוי למסות החזויות שהופקו באמצעות התוכנה. בשלב הבא, הגדירו את סף המסות ל-10 parts per million כדי להסיר מסות עם שגיאה גבוהה עבור פפטידים בעלי התאמות. רשמו את מצב המטען של רצף הפפטיד ואת זמן השרידות.השתמש בנתוני הפפטידים המקומפלים כדי לחשב את המספר הממוצע של דויטריומים שנשלבו בכל מקטע פפטידי באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים. ראשית, בצע ליופיליזציה לחלבון עם החומר העזר והלוצין כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר הכנת הדגימות, הפעל מכשיר UV crosslinker המכיל נורות UV באורך גל של 365 nanometer. המתן חמש דקות לחימום הנורות.לאחר שהנורות התחממו, כבו אותן והניחו את הבקבוקונים הפתוחים המכילים את הפורמולציה בתוך תא הקשירה הצלבית. הקרינו את הדגימות באור UV למשך 40 דקות, וכלולו דגימות ללא photo leucine כביקורת. לאחר ההקרנה, סגרו את הבקבוקונים ואחסנו אותם בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד לניתוח הספקטרומטריה של מסות. הכינו את הדגימות לניתוח על ידי הוספת מים מזוקקים בדרגת mass spectrometry כדי להגיע לריכוז חלבון סופי של 2 µM.בשלב הבא, נתחו את הדגימות באמצעות אותה שיטת ספקטרומטריית מסות ששימשה עבור החלבונים הדאוטריים השלמים. אך אין להשתמש במערכת ה-lc המקוררת. רכשו נתוני ספקטרומטריית מסות עבור דגימת חלבון לא מסומנת כדי לקבוע את המסה הטבעית של החלבון.בצע את ניתוח הנתונים כפי שנעשה עבור דגימות ה-DERATED לצורך ניתוח רמות הפפטיד. ראשית, בצע סימון פוטוליטי במצב מוצק עם חלבונים שלמים ואחסן אותם בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שחזר את הדגימה עם בופר ammonium bicarbonate בריכוז 100 millimolar כדי להגיע לריכוז חלבון סופי של 10 micromolar.ערבבו את הדגימה עם trypsin ביחס מולרי של 10 ל-1 של חלבון ל-trypsin, והדגירו תערובת זו בטמפרטורה של 60 °C למשך 16 שעות. בינתיים, חברו את לולאת הדגימה (sample loop), מלכודת הפפטידים (peptide trap) ואת העמודה האנליטית לשסתומי מערכת ה-HPLC. לאחר עיכול החלבון, עטרו את התגובה על ידי הוספת 0.1% formic acid במים, כדי להגיע לריכוז חלבון סופי של 2 µM.לאחר מכן, תכנתו את המערכת עם שיטות ה-HPLC והספקטרומטריה של מסות. כאן, הזרקו והמיחו 20 picomoles של המיוגלובין שעבר עיכול למלכודת הפפטידים למשך 1.5 דקות עם 5% aceto nitrile ו-0.1% Formic acid; אלוטו את הפפטידים על ידי הגברת הגרדיאנט במשך 22 דקות עד ל-55% acetyl nitrile, ואספו את ספקטראי המסות בטווח של 100 עד 1700 יחס מסה למטען. השתמשו בכלי מקוון כדי לחשב את המסה התאורטית של הפפטיד.תוצר תגובה (adduct) של פוטו-לוסין עם מספרי הפוטו-לוסין שהתקבלו קודם לכן מניתוח החלבון השלם. כלול לפחות ארבעה שברים חסרים (missed cleavages). צור רשימת מסות ב-Excel עבור תוצר התגובה של פפטיד פוטו-לוסין.בשלב הבא, התאימו את רשימת המסות התיאורטית למסות שנצפו בניסוי על ידי קביעת נקודת חיתוך (cutoff) לצורך זיהוי מסות עם שגיאה נמוכה. במהלך חילוף מימן-דאוטריום, פתיחה של החלבון מאפשרת החלפת מימן בדאוטריום; חלבונים השומרים על מבנם פחות נוטים לחילוף דאוטריום. כאשר בוצעה ספקטרומטריית מסות לחילוף מימן-דאוטריום במצב מוצק על פורמולציות של מיוגלובין המכילות טלוז ומכילות סורביטול, הפורמולציה המכילה סורביטול הראתה ספיגת דאוטריום גבוהה ב-46%, מה שמרמז כי מבנה המיוגלובין בסורביטול מופר יותר במהלך התהליך הליטי.פוטו-לוסין יוצר קשרי צלב עם שרשראות צד של חומצות אמינו נגישות. ניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסות פוטוליטית במצב מוצק של פורמולציות מיוגלובין המכילות סורביטול ו-TLOs הראה ספיגה גבוהה יותר של פוטו-לוסין בפורמולציית ה-TLOs מאשר במקבילה לה. דבר זה מרמז כי שרשראות הצד נותרו נגישות בפורמולציית ה-TLOs.הן חילוף מימן-דאוטריום והן סימון ליטית משתמשים באזורים זמינים מסחרית ובמכשור MS זמין כדי לאפיין חלבונים במצב מוצק עבור כל פורמולציה נתונה. זמן הרישום הכולל מהכנת הדגימה ועד ניתוח הנתונים המלא הוא פחות משבועיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשיג מידע ברזולוציה גבוהה על מבנה החלבון וחשיבותו בתכנון של פורמולציות חלבון ליופיליזציה יציבות.

mass-spectrometric-approaches-to-study-protein-structure-interactions

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

ספקטרומטריית מסה הוכיחה להיות כלי רב ערך עבור ניתוח מערכות חלבון גדול. שיטה זו מאפשרת תובנות אדריכלות, הרכב stoichiometry הכוללת של למקטע רב מכלולים. כאן, אנו לתאר, שלב אחר שלב, כיצד לבצע ניתוח מבניות ספקטרומטריית מסה, ולאפיין מבנים macromolecular.

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

מדידת מסה מדויקת מייצגת צעד חשוב במהלך החקירה של חלבונים. desorption / יינון בסיוע מטריקס לייזר (MALDI) ספקטרומטריית מסה (MS) יכולה לשמש לקביעה כאמור והיתרון המרכזי שלו הוא הסובלנות למלחים, חומרי ניקוי וחומרים מזהמים. כאן אנו מדגימים גישה נגישה לניתוח חלבונים גדולים יותר מאשר על ידי MALDI-MS 100 kDa.

מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון זמן של טיסה (MALDI-TOF) Mass ניתוח Spectrometric של חלבונים שלמים גדול מ100 kDa

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

הארכיטקטורה של מתחמי חלבון חיוני לתפקוד שלהם. שילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric הוכיח עוצמה ללמוד ההרכבה שלהם. אנחנו מספקים פרוטוקולים cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה ולהראות כמה שיטות משלימות אלה לעזור להבהיר את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון הרכבות.

שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

ספקטרומטר מסה (MS) התפתחה כלי חשוב החקירה של מבנה, הדינמיקה של הרכבות macromolecular. כאן, אנחנו משלבים גישות MS לחקור היווצרות מורכבות חלבון ואיגוד ליגנד.

ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית

כאן, אנו מציגים כיצד פיזור קרני רנטגן זווית קטנה (SAXS) יכול להיות מנוצל כדי לקבל מידע על מעטפות ברזולוציה נמוכה המייצג את המבנים macromolecular. בעת שימוש בשילוב עם טכניקות מבניים ברזולוציה גבוהה כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית, SAXS יכול לספק נתונים היסטוריים תובנות וחשבונות חלבונים ו macromolecular מתחמי בפתרון.

לימודי המבנית של מקרומולקולות בפתרון באמצעות פיזור קרני רנטגן זווית קטנה

סינתזות Lanthipeptide לזרז תגובות מרובות צעדים במהלך הביוסינתזה של מוצרים טבעיים פפטיד. כאן, אנו מתארים רציף, מלמטה למעלה, מימן-deuterium חילופי ספקטרומטריית מסה (HDX-MS) זרימת עבודה שניתן להפעיל כדי ללמוד את הדינמיקה הקונפורמטיבית של סינתטאז lanthipeptide, כמו גם אנזימים דומים אחרים המעורבים ביוסינתזה של מוצר טבעי פפטיד.

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

ההליכים הניסיוניים לביצוע תיוג קוולנטי מבוסס diethylpyrocarbonate עם זיהוי ספקטרומטרי מסה מתוארים. Diethylpyrocarbonate הוא פשוט מעורבב עם חלבון או חלבון קומפלקס של עניין, המוביל לשינוי של שאריות חומצות אמינו נגיש ממס. ניתן לזהות את השאריות ששונו לאחר עיכול פרוטאוליטי וניתוח כרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטריית מסה.

תיוג קוולנטי עם דיתילפירוקרבונט לחקר מבנה חלבון מסדר גבוה יותר על ידי ספקטרומטריית מסה

ספקטרוסקופיית פיזור אחורי של נייטרונים מציעה גישה לא הרסנית ונטולת תוויות לדינמיקה של ps-ns של חלבונים ומי ההידרציה שלהם. תהליך העבודה מוצג עם שני מחקרים על חלבוני עמילואיד: על הדינמיקה שנפתרה בזמן של ליזוזים במהלך צבירה ועל דינמיקת מי ההידרציה של טאו על היווצרות סיבים.

ספקטרוסקופיית נייטרונים ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקה של פיקו-שנייה-ננו-שנייה של חלבונים ומי לחות

חקור שיטות ספקטרומטריית מסה לניתוח מבנה חלבונים באבקות ליופיליזציה. למד כיצד ssHDX-MS ו-ssPL-MS מספקות מידע ברזולוציה גבוהה על יציבות חלבונים במצב מוצק ועל אינטראקציות בין מולקולריות.

Mass spectrometric גישות לחקר מבנה חלבון ואינטראקציות באבקות Lyophilized

גלה סרטונים נוספים