אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4 + CD45RB גבוה תאי T לעכברי immunodeficient

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום לדלקת מעיים על ידי העברה מאמצת של תאי T נאיביים לעכברים חסרי חיסון. זה מושג תחילה על ידי בידוד תאים מטחול עכבר, ליזה של תאי הדם ולאחר מכן העשרת האוכלוסייה עבור תאי T חיוביים CD 4. השלב השני הוא לתייג תאים אלה בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים CD 4 ו-CD 45 RB.

לאחר מכן, התאים המסומנים ממוינים באמצעות עובדות לאוכלוסיות CD 45, RB נמוך ו-CD 45 RB גבוה. השלב האחרון הוא העברת התאים הגבוהים CD 45 RB לעכברים חסרי חיסון על ידי הזרקה תוך צפקית. בסופו של דבר, התאים המועברים מופעלים וגורמים לנזק מקומי לרקמות בהיעדר תאי T רגולטוריים וכתוצאה מכך קוליטיס ניסיונית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר מחלות מעי דלקתיות כגון תפקידן של אוכלוסיות תאים ספציפיות והמיקרוביוטה של מערכת העיכול בפתוגנזה של מחלות. לאחר המתת חסד של העכבר התורם, יש לרסס את הבטן באתנול 70% כדי לעקר את האזור. לאחר מכן בצע חתך אופקי על פני הבטן וקילף את העור לאחור כדי לחשוף את הצפק באמצעות מלקחיים.

הרחק את הצפק מהאיברים הפנימיים ובצע חתך בצפק הבטן השמאלית. לאחר מכן, הוציאו את הטחול מהעכבר והניחו אותו בצלחת פטרי המכילה 10 מיליליטר קר כקרח, מדיום שלם. מרסקים את הטחול בשתי שקופיות זכוכית סטריליות ליצירת מתלה תא יחיד.

מסננים את התאים דרך מסננת של 70 מיקרון לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר ולאחר מכן שוטפים את המסננת בחמישה מיליליטר של מתח בינוני מלא עד חמישה טחול בצינור חרוטי אחד. לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים ב-450 פעמים G למשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט לתוך מיכל פסולת ולאחר מכן השעו בעדינות את התאים ב-10 מיליליטר של מאגר תיוג קר כקרח.

שלב 20 מיקרוליטר של תרחיף התא עם 180 מיקרוליטר של תמיסה כחולה של 0.4% טריאן ודגר על התאים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים לציטומטר המו וספרו את מספר התאים הלא כחולים מתחת למיקרוסקופ כדי להתחיל את גלולת ההעשרה ולהחיות בעדינות את התאים במאגר תיוג קר כקרח בריכוז של 20 כפול 10 לששת התאים למיליליטר. הוסף חמישה מיקרוליטרים של נוגדן להעשרת תאי CD ארבעה תאי T ביוטיניליים לכל אחד כפול 10 לששת התאים, ולאחר מכן דגר על התאים על הקרח עם הנוגדן למשך 15 דקות.

הוסף פי 10 מנפח מאגר התיוג לתרחיף התאים, ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב -450 פעמים G למשך שבע דקות. שאפו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. לאחר מכן, השעו מחדש את החלקיקים המגנטיים המצומדים של סטרפטווידין על ידי מערבולת והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של חלקיקים לכל אחד כפול 10 לששת התאים לתאים.

מערבבים את החלקיקים עם התאים על ידי לחיצה עדינה על הצינור ולאחר מכן מדגרים את התערובת בטמפרטורה של שש עד 12 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השעו מחדש את התאים לריכוז של 20 עד 80 פעמים 10 לששת התאים למיליליטר עם מאגר תיוג. לאחר מכן העבירו מיליליטר אחד של תאים מסומנים למבחנה תחתונה עגולה בגודל 12 מילימטר על 75 מילימטר והניחו את צינור השבר החיובי הזה על מגנט למשך שש עד שמונה דקות.

עם הצינור על המגנט, הסר בזהירות את הסופרנטנט בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית מבלי להפריע לתאים המסומנים והעביר אותו לצינור חרוטי סטרילי חדש של 50 מיליליטר. חלק זה מכיל את ה-CD ארבעה תאי T חיוביים. הסר את צינור השבר החיובי מהמגנט והשהה מחדש את התאים במאגר התיוג על ידי פיפטינג נמרץ.

החזר את הצינור למגנט למשך שש עד שמונה דקות נוספות. שוב, העבירו בזהירות את ה-SUP nain לצינור השבר המועשר. הגדל את התפוקה של CD ארבעה תאי T חיוביים על ידי חזרה על ההעשרה לפי הצורך כדי להכין את התאים לתיוג צנטריפוגה ראשונה את המקטע המועשר ב-450 פעמים G למשך שבע דקות והשליך את הסופרנטנט.

לאחר מכן השעו מחדש את התאים במאגר התיוג לריכוז של 10 פעמים 10 עד התאים השישיים למיליליטר. Aliquot חמש פעמים 10 מהתאים החמישיים בצינורות מיקרו פוגה בודדים עבור תאי בקרה מוכתמים באיזוטופים לא מוכתמים ותאי בקרה מוכתמים בודדים. לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוגרם למיליליטר של CD ארבע, FE ומיקרוגרם אחד למיליליטר של נוגדנים CD 45 RB PE לצינור המכיל את תרחיף התא המקורי.

הוסף את כתמי בקרת האיזוטופים ואת הכתמים הבודדים באותו ריכוז לכמות התאים המתאימה. ערבבו בעדינות את התאים עם הנוגדנים ולאחר מכן דגרו את הצינורות על הקרח למשך 30 דקות. כסו את הצינורות כדי להגן עליהם מפני אור.

לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים במאגר התיוג כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט והשעו מחדש את התאים ב-10 פעמים 10 מתוך ששת התאים למיליליטר במאגר התיוג. לאחר מכן העבירו את מתלה התא דרך מסננת 70 מיקרון לתוך צינור פקס. הניחו את הצינור על קרח וכסו אותו כדי למנוע הלבנת תמונות של הכתמים.

השתמש בתאי הבקרה הלא מוכתמים והחד-שלביים כדי לכייל את הפיצוי על סדרן התאים. אל תכלול את התאים שאינם ברי קיימא באמצעות שער מפוזר קדימה וצדדית. ואז הגדר את השער עבור CD ארבעה תאים חיוביים ו-CD ארבעה תאים חיוביים RB עם הבקרות המוכתמות באיזוטופים.

השער הבא, האוכלוסייה החיובית של CD ארבע ולאחר מכן מיין את התאים לאוכלוסיות CD 45, RB גבוה ו-CD 45 RB נמוך. אסוף את התאים בצינורות המכילים שני מיליליטר של מדיום שלם ולאחר מכן הפעל אליקוט של כ-10 פעמים 10 לתאים השלישיים מכל שבר על סדרן התאים כדי להעריך את טוהר הדגימה להכנת תאים נמוכים CD 45 RB גבוה ו-CD 45 RB נמוך לשטיפת הזרקה ולהשעות אותם מחדש ב-PBS לצפיפות התאים המתאימה כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, רסנו היטב את העכבר הנמען והזריקו 100 מיקרוליטר של תרחיף התאים תוך צפקי לצד ימין ושמאל של הבטן.

עקוב אחר הפרמטרים הקליניים של העכברים הנמענים כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט מדי שבוע. התקדמות המחלה לאחר ההזרקה ניכרת בדרך כלל בשבוע החמישי. להקריב עכבר בנקודת זמן קבועה מראש או כאשר הוא מאבד 20% ממשקל גופו ההתחלתי ולחלץ את המעי הגס.

לאחר מכן מדוד ורשום את אורך ומשקל המעי הגס. CD ארבעה תאי CD חיוביים CD 45 RB High T הועברו לסמרטוט נוקאאוט אחד ו-NFIL שלושה RAG עכברים מקבלי נוקאאוט כפול עד חמישה שבועות לאחר ההזרקה. עכברי נוקאאוט כפול איבדו 10% ממשקל גופם ההתחלתי, המעי הגס של שני הסמרטוטים בנוקאאוט אחד ונוקאאוט כפול.

עכברים מושתלים עובו וקוצרו בהשוואה למעי הגס מעכברי הביקורת CD ארבעה תאי CD חיוביים CD 45 RB תאי T גבוהים להעברה לסמרטוט נוקאאוט אחד וסמרטוט נוקאאוט אחד P 10 עכברים מושתלי דלתא מוטנטיים ניתוח היסטולוגי בשלושה שבועות לאחר ההעברה הצביע על היפרפלזיה אפיתלית, חדירת תאים דלקתיים ומורסות קריפטה בסמרטוט אחד מקבלי מוטציה דלתא נוקאאוט אך לא סמרטוט עכברי נוקאאוט אחד לאחר שליטה. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך ארבע עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי.