Name: אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4 + CD45RB גבוה תאי T לעכברי immunodeficient (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: למדו אינדוקציה של דלקת מעיים בעכברים באמצעות העברה מאמצת של תאי T CD4+ CD45RBhigh לנבלים immunodeficient. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני דלקת מעיים ופיתוח טיפולים חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי אמריקאי Gastroenterological Association (AGA) מחקר חוקרי פרס וקרוהן וקוליטיס קרן של אמריקה (CCFA) פיתוח קריירה פרס (לSZS), DK089692 F30 NIH NIDDK (לECS), ואוניברסיטת צפון מרכז קרוליינה לביולוגיה במערכת העיכול וDK34987 P30 מחלת גרנט (היסטולוגיה Core). מתקן UNC cytometry זרימת Core נתמך בחלקו על ידי NCI מרכז Core תמיכת גרנט (P30CA016086) למרכז לסרטן UNC Lineberger. אנו מודים ללוק B. Borst מState College אוניברסיטת צפון קרוליינה לרפואת וטרינרית על עזרתו עם ניתוח ואימונוהיסטוכימיה histopathological.

<ol><li>Xavier, R. J., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).</li>
<li>Cho, J. H., Brant, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+the+genetics+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).</li>
<li>Jostins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+have+shaped+the+genetic+architecture+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).</li>
<li>Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypically+distinct+subsets+of+CD4%2B+T+cells+induce+or+protect+from+chronic+intestinal+inflammation+in+C.+B-17+scid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice.</a> Int Immunol. 5 (11), 1461-1471 (1993).</li>
<li>Ostanin, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+transfer+model+of+chronic+colitis%3A+concepts%2C+considerations%2C+and+tricks+of+the+trade%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (2), 135-146 (2009).</li>
<li>Ma, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+habitat+change%3A+a+source+of+unrecognized+transient+alteration+of+intestinal+microbiota+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Routine habitat change: a source of unrecognized transient alteration of intestinal microbiota in laboratory mice.</a> PLoS One. 7 (10), e47416(2012).</li>
<li>Read, S., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+inflammatory+bowel+disease+in+immunodeficient+mice+by+depletion+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of inflammatory bowel disease in immunodeficient mice by depletion of regulatory T cells.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 15 (Unit 15 13), (1999).</li>
<li>Maillard, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wiskott-Aldrich+syndrome+protein+is+required+for+the+function+of+CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells.</a> J Exp Med. 204 (2), 381-391 (2007).</li>
<li>Hegazi, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+ameliorates+chronic+murine+colitis+through+a+heme+oxygenase+1-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide ameliorates chronic murine colitis through a heme oxygenase 1-dependent pathway.</a> J Exp Med. 202 (12), 1703-1713 (2005).</li>
<li>Kole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+regulate+effector+and+regulatory+T+cell+accumulation+and+anti-inflammatory+cytokine+production+during+T+cell-mediated+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs regulate effector and regulatory T cell accumulation and anti-inflammatory cytokine production during T cell-mediated colitis.</a> J Immunol. 191 (5), 2771-2779 (2013).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIL3-deficient+mice+develop+microbiota-dependent%2C+IL-12%2F23-driven+spontaneous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NFIL3-deficient mice develop microbiota-dependent, IL-12/23-driven spontaneous colitis.</a> J Immunol. 192 (4), 1918-1927 (2014).</li>
<li>Steinbach, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+PI3K+p110delta+Regulates+Th1%2FTh17+Development+and+Microbiota-Dependent+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate PI3K p110delta Regulates Th1/Th17 Development and Microbiota-Dependent Colitis.</a> J Immunol. 192 (8), 3958-3968 (2014).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIL3+is+a+regulator+of+IL-12+p40+in+macrophages+and+mucosal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity.</a> J Immunol. 186 (8), 4649-4655 (2011).</li>
<li>Leach, M. W., Bean, A. G., Mauze, S., Coffman, R. L., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease+in+C.B-17+scid+mice+reconstituted+with+the+CD45RBhigh+subset+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells.</a> Am J Pathol. 148 (5), 1503-1515 (1996).</li>
<li>Powrie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Th1+responses+prevents+inflammatory+bowel+disease+in+scid+mice+reconstituted+with+CD45RBhi+CD4%5BTitle%5D)+AND+%22T+cells.+Immunity%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4.</a> T cells. Immunity. 1 (7), 553-562 (1994).</li>
<li>Read, S., Malmstrom, V., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte-associated+antigen+4+plays+an+essential+role+in+the+function+of+CD25%28%2B%29CD4%28%2B%29+regulatory+cells+that+control+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation.</a> J Exp Med. 192 (2), 295-302 (2000).</li>
<li>Rogers, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+divergence+in+gastrointestinal+microbiota+in+physically-separated+genetically+identical+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice.</a> Sci Rep. 4, 5437(2014).</li>
<li>Fukata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloid+differentiation+factor+88+%28MyD88%29+is+required+for+CD4%2B+T+cell+effector+function+in+a+murine+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The myeloid differentiation factor 88 (MyD88) is required for CD4+ T cell effector function in a murine model of inflammatory bowel disease.</a> J Immunol. 180 (3), 1886-1894 (2008).</li>
<li>Kurtz, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+adenosine+regulates+colitis+through+effects+on+lymphoid+and+nonlymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular adenosine regulates colitis through effects on lymphoid and nonlymphoid cells.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 307 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Critical+role+for+A2A+adenosine+receptors+in+the+T+cell-mediated+regulation+of+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis.</a> J Immunol. 177 (5), 2765-2769 (2006).</li>
<li>Ranatunga, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protective+role+for+human+IL-10-expressing+CD4%2B+T+cells+in+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A protective role for human IL-10-expressing CD4+ T cells in colitis.</a> J Immunol. 189 (3), 1243-1252 (2012).</li>
<li>Srikrishna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxylated+glycans+mediate+colitis+through+activation+of+NF-kappa%5BTitle%5D)+AND+%22B.+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Carboxylated glycans mediate colitis through activation of NF-kappa.</a> B. J Immunol. 175 (8), 5412-5422 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד-אחר-צעד גרימת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברת מאמצת של תאי CD4 + CD45RB + T לעכברי immunodeficient. אנחנו השתמשנו טחולי C57BL / 6 תורם וRag1 syngeneic - / - עכברי נמען, אם כי זנים אחרים (למשל, BALB / ג, 129S6 / SvEv, סוכרת שאינן סובל מהשמנת יתר (NOD)) מודלים וגנטיים של כשל חיסוני (לדוגמא, SCID, Rag2 - / - גם) עשוי לשמש 4,14-16. היא מבוססת היטב כי לחץ משפיע על ר...

מחלות המעי הדלקתיות (IBD) מחלת קרוהן וקוליטיס כיבית נובעות מאינטראקציה לא מוגדרת ומורכבת בין תגובות חיסוניות של המארח, רגישות גנטית, גורמים סביבתיים ותכולת הלומינל המעי1. מחקרי אסוציאציה אחרונים ברחבי הגנום מדווחים על קשרים בין גנים מווסתים של תאי חיסון ורגישות ל-IBD2,3. גנים פנימיים של תאי חיסון מולדים ונרכשים מיוצגים במחקרים אלה, מה שמצביע על תפקיד מרכזי לאוכלוסיות תאים אלה בפתוגנזה של IBD.
קיימים כיום יותר מ-50 מודלים של בעלי חיים של IBD אנושי. בעוד שאין מודל אחד של פנוקופיה מושלמת של מחלות מעי דלקתיות אנושיות, רבים מהם שימושיים לחקר היבטים שונים של מחלות אנושיות, כולל הופעת המחלה והתקדמותה ותגובת ריפוי הפצעים. בשיטה המתוארת כאן, דלקת מעיים מתחילה עם העברה מאמצת של תאי Tגבוהים CD4+CD45RB של טחול סינגני לעכברים נמענים חסרי תאי T ו-B4. אוכלוסיית תאי ה-Tהגבוהים CD4+CD45RB מכילה בעיקר תאי T נאיביים המוכנים להפעלה המסוגלים לגרום לדלקת כרונית במעי הדק ובמעי הגס. שיטה זו מאפשרת לחוקר לשנות משתני ניסוי מרכזיים, כולל אוכלוסיות תאי חיסון מולדים ונרכשים, כדי לענות על שאלות רלוונטיות מבחינה ביולוגית הנוגעות לפתוגנזה של מחלה. בנוסף, שיטה זו מספקת התחלה מדויקת של הופעת המחלה ומהלך זמן ניסיוני מאופיין היטב. זה מאפשר מחקר קינטי של מאפיינים קליניים של התקדמות מחלה בעכברים. דלקת מעיים הנגרמת על ידי שיטה זו חולקת מאפיינים רבים עם IBD אנושי, כולל דלקת כרונית במעי הגס והדק, פתוגנזה המונעת על ידי ציטוקינים כגון TNF ו-IL-12, ותסמינים מערכתיים כגון אובדן5. לפיכך, זוהי מערכת מודל אידיאלית לחקר הפתוגנזה של IBD אנושי.
השיטה כאן מתארת בפירוט את הפרוטוקול להשראת קוליטיס ניסיונית על ידי העברה מאמצת של תאי Tגבוהים CD4+CD45RB לעכברי Rag1-/-. אנו דנים בשלבים טכניים מרכזיים, תוצאות צפויות, אופטימיזציה ופתרון בעיות. אנו מתייחסים לאלמנטים הנדרשים לפיתוח מוצלח של מודל עכברי זה של דלקת מעיים למטרות מחקר.

<table><tbody><tr><td>שם המגיב / ציוד</td><td>מספר</td><td>קטלוגי</td><td>של החברה הערות/תיאור</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>12 מ"מ x 75 מ"מ צינור תחתון עגול</td><td>פלקון</td><td></td> 352052 <td></td></tr><tr><td>15 מ"ל קורנינג חרוטי</td><td></td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>26 גרם x 3/8 מחט</td><td>BD Biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל קורנינג חרוטי</td><td></td><td></td><td></td>430828</tr><tr><td>70 &#956; m מסננת תאים</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>BD IMagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>&-mercaptoethanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>35602</td><td></td></tr><tr><td>CD4-FITC IgG2b</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td></td></tr><tr><td>CD45RB-PE IgG2a</td><td>BD Pharminogen</td><td>553101</td><td></td></tr><tr><td>מדיה</td><td></td><td></td> מלאה <td>RPMI-1640, 1% עט/סטרפטוק, 10% FBS, 0.0004% &beta;-ME</td></tr><tr><td>צינור FACS + מסננת</td><td>BD פלקון</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישרברנד</td><td>12550A3</td><td></td></tr><tr>FBS <td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> תיוג <td>מושבת בחום 1x PBS, 0.5% BSA, 2 מ"מ EDTA</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> ליזה <td>0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 מ"מ EDTA</td></tr><tr><td>MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse CD4 T סט העשרת לימפוציטים - DM</td><td>BD Biosciences</td><td>558131</td><td></td></tr><tr><td>עכבר IgG2a-PE</td><td>BD Pharminogen</td><td>553457</td><td></td></tr><tr><td>עכבר IgG2b-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4732</td><td></td></tr><tr><td>פסטר פיפט</td><td>פישרברנד</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100X</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Fisherbrand</td><td>875713</td><td></td></tr><tr><td>אתנול טהור 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2705-HC</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td></td></tr><tr><td>מזרק</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>קורנינג Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Wash Media</td><td></td><td></td><td>RPMI-1640, 1% עט/סטרפטוק, 0.0004% &beta;-ME</td></tr></tbody></table>

אינדוקציה של murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל cd4<sup&gt; +</sup&gt; cd45rb<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי t לעכברי immunodeficient

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

יש מודלים של בעלי חיים רבים ושונים זמינים ללימוד פתוגנזה של מחלות בבני אדם מעי דלקתיות (IBD), כל אחד עם יתרונות משלה וחסרונות. אנו מתארים כאן מודל קוליטיס ניסיוני שהוא ביוזמת העברת מאמצת של תאי טחול syngeneic CD4 + T CD45RB הגבוה לעכברי נמען חסרי T ו- B תא. אוכלוסיית תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB שמורכבת בעיקר של תאי מפעיל נאיביים היא מסוגלת גרימת דלקת מעיים כרונית, דומה מאוד להיבטים מרכזיים של IBD האנושי. שיטה זו ניתן להשפיע ללמוד היבטים של תחילת מחלה והתקדמות. בנוסף ניתן להשתמש בו כדי ללמוד את הפונקציה של מולדת, מסתגל, ואוכלוסיות תאים חיסוני רגולציה, ואת התפקיד של חשיפות סביבתיות, כלומר, החיידקים, בדלקת מעיים. במאמר זה אנו מדגימים את המתודולוגיה לגרימת דלקת המעי הגס עם פרוטוקול צעד-אחר-צעד. inc זהלרכב וידאו הדגמה של היבטים טכניים מפתח נדרשו לפתח מודל העכברי של קוליטיס הניסיוני למטרות מחקר בהצלחה.

כ 10 x 10 6 תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB מ -10 טחולים ממבוגרי C57BL / 6 עכברים תורמים באופן מהימן מבודדים. מספר זה ישתנה בהתאם לגיל והמתח של עכבר התורם ומיומנותו של החוקר. כאשר 4 x 10 5 C57BL / 6 תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB מועברים לתוך C57BL Rag1 / 6 - / - עכברי נמען, סימנים קליניים של מחלה מופיעים ברחבי שבוע 5 הודעה גודש-או מוקדם יותר אם עכברים עם רגישות גנטית למחלה חמורה יותר ( איור 2, 3) 1...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברה מאמצת של תאי Tגבוהים CD4+CD45RB סינגניים לנמענים חסרי תאי T ו-B. מאפיינים קליניים והיסטופתולוגיים מחקים מחלות מעי דלקתיות אנושיות. שיטה זו מאפשרת לחקור את התחלת דלקת המעי הגס והתקדמות המחלה.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשרות דלקת במעי באמצעות העברה אדופטיבית של תאי T נאיביים לעכברים עם חסר חיסוני. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד תאים מטחול של עכברים, ליזיס של תאי הדם ולאחר מכן העשרה של האוכלוסייה בתאי T חיוביים ל-CD4. השלב השני הוא סימון תאים אלו באמצעות נוגדני CD4 ו-CD45RB המשוררים לפלואורסצנט DI.בשלב הבא, התאים המסומנים מומיינים באמצעות FACS לאוכלוסיות של CD 45, RB low ו-CD 45 RB high. השלב הסופי הוא העברת תאי CD 45 RB high לעכברים עם חסר חיסוני באמצעות הזרקה תוך-פריטונית (intraperitoneal injection). בסופו של דבר, התאים שהועברו מופעלים וגורמים לנזק רקמתי מקומי בהיעדר תאי T רגולטוריים, מה שמוביל לקוליטיס ניסיונית.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בחקר מחלות מעי דלקתיות, כגון תפקידן של אוכלוסיות תאים ספציפיות והמיקרוביוטה של מערכת העיכול בפתוגנזה של המחלה. לאחר קטילת עכבר התורם, יש לרסס את הבטן ב-70% ethanol כדי לעקר את האזור. לאחר מכן, בצעו חתך אופקי לרוחב הבטן וקלפו את העור כדי לחשוף את הפריטוניאום באמצעות פינצטה.הרחיקו את הפריטונאום (peritoneum) מהאיברים הפנימיים ובצעו חתך בפריטונאום הבטני השמאלי. לאחר מכן, הוציאו את הטחול מהעכבר והניחו אותו בצלחת פטרי המכילה 10 milliliters של מצע מלא (complete medium) קר מאוד.סננו את התאים דרך מסננת של 70 micron לתוך מבחנה קונית של 50 milliliter, ולאחר מכן שטפו את המסננת עם five milliliters של מצע גידול מלא; ניתן לסנן עד חמישה טחולים למבחנה קונית אחת. לאחר מכן, סובבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 450 times G למשך שבע דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. שאבו את עליון הנוזל (supernatant) למכל פסולת, ולאחר מכן השהו בעדינות את התאים ב-10 milliliters של בופר סימון קר מאוד.ערבבו 20 µL של תרחיף התאים עם 180 µL של תמיסת trypan blue בריכוז 0.4%, והדגירו את התאים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו 10 µL מתרחיף התאים לתוך המוסימטר (hemocytometer) וספרו את מספר התאים שאינם כחולים תחת המיקרוסקופ. כדי להתחיל את תהליך העשרת המשקע, השביו בעדינות את התאים בבופר סימון קר (על קרח) בריכוז של 20 × 10⁶ תאים ל-mL. הוסיפו 5 µL של נוגדן להעשרת תאי CD4 T המסומן בביוטין עבור כל 1 × 10⁶ תאים, ולאחר מכן הדגירו את התאים עם הנוגדן על קרח למשך 15 דקות.הוסף לנתילי התאים נפח של פי 10 מבאפר הסימון (labeling buffer), ולאחר מכן סבב את התאים בצנטריפוגה ב-450 ×g למשך שבע דקות. שאב בזהירות את העליון (supernatant) מבלי להפר את משקע התאים. לאחר מכן, השהה מחדש את החלקיקים המגנטיים המצומדים לסטרפטאווידין על ידי וורטקס, והוסף לתאים חמישה µL של חלקיקים לכל 1 × 10⁶ תאים.ערבב את החלקיקים עם התאים על ידי נקישה עדינה של המבחנה, ולאחר מכן הדגר את התערובת בטמפרטורה של 6 עד 12 °C למשך 30 דקות. השהה מחדש את התאים בריכוז של 20 עד 80 × 10⁶ תאים למיליליטר באמצעות בופר סימון. לאחר מכן, העבר 1 ml של תאים מסומנים למבחנה בעלת תחתית עגולה במידות של 12 mm על 75 mm, והנח מבחנה זו של הפרקטור החיובי על מגנט למשך 6 עד 8 דקות.כאשר המבחנה נמצאת על המגנט, הסר בזהירות את supernatant באמצעות פיפט פסטור מזכוכית, מבלי להפריע לתאים המסומנים, והעבר אותו למבחנה קונית סטרילית חדשה של 50 milliliter. פרקציה זו מכילה את תאי ה-T החיוביים ל-CD four. הסר את מבחנת הפרקציה החיובית מהמגנט והשהה מחדש את התאים בבופר סימון באמצעות פיפוט נמרץ.החזירו את המבחנה למגנט למשך שש עד שמונה דקות נוספות. שוב, העבירו בזהירות את ה-SUP למבחנת הפракציה המועשרת. הגדילו את התנובה של תאי T חיוביים ל-CD4 על ידי חזרה על תהליך ההעשרה במידת הצורך כדי להכין את התאים לסימון. ראשית, סבבו את הפракציה המועשרת בצנטריפוגה ב-450 ×g למשך שבע דקות והסירו את העלייה.לאחר מכן, השהו שוב את התאים בבופר סימון (labeling buffer) לריכוז של 10 × 10⁶ תאים למיליליטר. חלקו 5 × 10⁵ תאים למבחנות מיקרו-צנטריפוגה נפרדות עבור תאים ללא צביעה, תאים צבועים באיזוטופ ותאי בקרה בצביעה בודדת. לאחר מכן, הוסיפו 5 µg/mL של נוגדני CD4-FITC ו-1 µg/mL של נוגדני CD45RB-PE למבחנה המכילה את תרחיף התאים המקורי.הוסיפו את צביעות ביקורת האיזוטופ ואת הצביעות הבודדות בריכוז זהה למנות התאים המתאימות. ערבבו בעדינות את התאים עם הנוגדנים ולאחר מכן דגרו את המבחנות על קרח למשך 30 דקות. כסו את המבחנות כדי להגן עליהן מאור.בשלב הבא, שטפו את התאים פעמיים בבופר סימון כפי שמופיע בפרוטוקול הכתוב, ותלו את התאים בריכוז של 10 מיליון תאים למילליליטר בבופר סימון. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים דרך מסננת של 70 micron אל תוך מבחנה של FACS. הניחו את המבחנה על קרח וכסו אותה כדי למנוע דהיית צבע (photo bleaching) של הצבעים.השתמשו בתאים ללא צביעה ובתאי ביקורת עם צביעה של שלב בודד כדי לכוונן את הפיצוי (compensation) בממייין התאים. הסירו את התאים שאינם חיוניים באמצעות הגדרת שערים (gating) של פיזור קדמי ופיזור צידי. לאחר מכן, הגדירו את השערים עבור תאים חיוביים ל-CD4 ותאים חיוביים ל-CD4 RB באמצעות ביקורות שצבעו באיזוטופ.בשלב הבא, הגדירו שער (gate) עבור האוכלוסייה החיובית ל-CD4, ולאחר מכן בצעו מיון של התאים לאוכלוסיות CD45RB high ו-CD45RB low. אספו את התאים למבחנות המכילות 2 mL של מצע גידול מלא, ולאחר מכן העבירו אליקוט של כ-10×10³ תאים מכל פרקציה בממיין התאים כדי להעריך את טוהר הדגימה. כדי להכין את תאי ה-CD45RB high וה-CD45RB low להזרקה, שטפו אותם וסספנדו אותם מחדש ב-PBS בריכוז התאים המתאים כפי שמצוין בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, קבעו היטב את העכבר המקבל והזריקו 100 µL מתלי התאים באופן תוך-peritoneal לצד ימין ושמאל של הבטן.יש לעקוב אחר הפרמטרים הקליניים של העכברים המקבלים בהתאם לפרוטוקול הכתוב מדי שבוע. התקדמות המחלה לאחר ההזרקה ניכרת בדרך כלל בשבוע החמישי. יש להקריב עכבר בנקודת זמן שנקבעה מראש או כאשר הוא מאבד 20% ממשקל גופו ההתחלתי, ולהוציא את המעי הגס.לאחר מכן, מדדו ורשמו את אורכו ואת משקלו של המעי הגס. תאי T מסוג CD4 positive CD45RB high הועברו לעכברי מקלט rag1 knockout ולעכברי מקלט NFIL3 RAG1 double knockout; עד חמישה שבועות לאחר ההזרקה, עכברי ה-double knockout איבדו 10% ממשקל גופם הראשוני, במעי הגס של עכברי ה-rag1 knockout וה-double knockout.המעיים הגסים של העכברים המקבלים היו עבים וקצרים יותר בהשוואה למעיים גסים של עכברי ביקורת. T cells מסוג CD4+ CD45RBhigh הועברו לעכברים מקבלי rag1 knockout ולעכברים מקבלי rag1 knockout P10 delta mutant. ניתוח היסטולוגי שלושה שבועות לאחר ההעברה העלה על היפרפלזיה אפיתלית, חדירות של תאי דלקת ומורסות בקריפטות (crypt abscesses) בעכברים מקבלי rag1 knockout delta mutant, אך לא בעכברי rag1 knockout. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצעה בארבע עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

induction-murine-intestinal-inflammation-adoptive-transfer-effector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של המעיים עכבר תאים דנדריטים (DCS) ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע באמצעות ריבוי צבעים ניתוח תזרים cytometric תוך העשרת חרוז מגנטי ואחריו מיון התא משמש להניב אוכלוסיות טהורות ביותר ללימודי תפקודית.

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

סרטון זה מדגים את השראת מחלת השתל נגד המאכסן של המעי, GvHD, בעכבר מושתל המוקרן באופן קטלני באמצעות תאי גזע המטופויטיים אלוגניים ולימפוציטים מסוג T אלוריאקטיביים מעוררי GvHD. פרוטוקול זה מסייע לבסס מודל GvHD חמור במעי כדי להבין את מנגנון המחלה ולפתח אפשרויות טיפוליות חדשניות.

השראת מחלת השתל לעומת המאכסן במודלים של עכברים באמצעות השתלת מח עצם אלוגנית והשתלת תאים טחול

אנו מספקים שיטת שחזור כדי לגרום לסוכרת מסוג 1 (T1D) בעכברים בתוך שבועיים על ידי העברת המאמצת של CD4 איון אנטיגן ספציפי, העיקרי + T תאים.

אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic

במודל קוליטיס מונע אנטיגן זה, תאי OT-II CD4+ T המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום הועברו באופן מאומץ לעכברי RAG-/- המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בפגוציטים חד-גרעיניים (MPS). המארחים אותגרו עם Escherichia coli (E.coli) המבטא את חלבון האובאלבומין (OVA) שהתמזג לחלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP).

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

אנו מתארים כאן מודל של עכבר מדווח טרנסגני כדי לדמיין את התאים המייצרים IL-22 בתוך רקמות עכבר שונות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר מיקומם של ציטוקינים אחרים או חלבוני מזכיר בעכבר.

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מתאר השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic ומאפשרת חוזרות הערכות מיני-אנדוסקופית של המעי הגס דיסטלי באתרו נוכחות, מאפיינים של חומרת דלקת מעי בתוך בשידור חי עכברים הסובלים מעיים שתל – מול – מארח מחלות.

אינדוקציה של מעיים שתל – מול – מארח מחלות והערכה מיני-אנדוסקופית שלה בעכברים בשידור חי

בפרוטוקול זה מתואר מודל קוליטיס אימוץ של תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים. תאי CD4+ T מבודדים מעכברים מהונדסים CBir1 TCR. אלה הם ספציפיים עבור מיקרוביוטה המעי immunodominant אנטיגן CBir1 flagellin, אשר מועבר לתוך המטופל Rag1-/- עכברים, המוביל דלקת מעיים.

אינדוקציה של דלקת מעיים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR תאי CD4 + TCR מהונדסים לעכברים חיסוניים

האינטראקציה של רגישות גנטית, חסינות רירית וסביבה מיקרואקולוגית במעיים מעורבת בפתוגנזה של מחלות מעי דלקתיות (IBD). במחקר זה יישמנו השתלת מיקרוביוטה בצואה בעכברים עם מחסור ב-IL-10 וחקרנו את השפעתה על דלקת המעי הגס ותפקוד הלב.

הערכה טיפולית של השתלת מיקרוביוטה בצואה במודל עכבר עם מחסור באינטרלוקין 10

המחקר מדגים את תפקידו של העור בוויסות התגובות החיסוניות בעכברים באמצעות חיסון אפיעורי (EC). חיסון EC עם אנטיגן חלבון יכול לדכא תגובות חיסוניות ברגישות יתר למגע או להפוך דיכוי המושרה על ידי העור בשילוב עם דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן. חיסון EC מראה הבטחה כגישה יעילה ונטולת מחטים לאימונותרפיה.

מודל עכברי של אימונומודולציה המושרה אפיעורית

כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול המבסס מודל עכבר של דלקת מפרקים שגרונית (RA) באמצעות העברה מאמצת של תאי CD4+ T מעכברי SKG, המספק כלי ניסיוני מהיר ואמין לחקירת המנגנונים החיסוניים, התקדמות פתולוגית ופיתוח טיפולים חדשים לדלקת מפרקים שגרונית.

מודל העברה מאמץ של דלקת מפרקים שגרונית בעכברים

למדו אינדוקציה של דלקת מעיים בעכברים באמצעות העברה מאמצת של תאי T CD4+ CD45RBhigh לנבלים immunodeficient. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני דלקת מעיים ופיתוח טיפולים חדשים.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4

גלה סרטונים נוספים