בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של המעיים עכבר תאים דנדריטים (DCS) ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע באמצעות ריבוי צבעים ניתוח תזרים cytometric תוך העשרת חרוז מגנטי ואחריו מיון התא משמש להניב אוכלוסיות טהורות ביותר ללימודי תפקודית.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד במהירות תאים דנדריטיים במעי עכבר או dcs ומקרופאגים לאפיון פנוטיפי ותפקודי. זה מושג על ידי קצירת רקמת מעיים תחילה. השלב השני הוא לנתק את אפיתל המעי מהלמין פרופריה.

לאחר מכן, ה-Lamin Propria במעי מתעכל במהלך השלבים האחרונים של ההליך. תאי ה-Lamin propria מוכתמים בפלואורסצנטיות, נוגדנים מצומדים ומגודרים לאוכלוסיות תאים ספציפיות. בסופו של דבר, ניתן לאפיין ולטהר אוכלוסיות DC ומקרופאגים במעי בצורה מדויקת יותר עבור מחקרים פונקציונליים להערכת ייצור ציטוקינים, הצגת אנטיגן וויסות תאי חיסון.

אז היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שמהירות עיכול הרקמה מבטיחה ביטוי אנטיגן אופטימלי על פני התא, כדאיות התא ו/או התא. לאחר המתת חסד של העכבר ואישור מוות על ידי רפלקס צביטת הבוהן, יש לרסס אתנול 70% על הבטן ובית החזה של החיה. לאחר מכן השתמש במספריים כדי לבצע חתך אופקי קטן באמצע הבטן ולקלף את העור לאחור כדי לחשוף את הצפק.

פתחו את הצפק בעזרת מספריים לאחר חיתוך בסוגר הפילו כדי להפריד את הקיבה מהמעי הדק העליון והשתמשו במלקחיים כדי להקניט את המזנטריה. חותכים שוב בשסתום האילאוצקלי כדי לשחרר את כל המעי הדק מהמעי הגס. המשיכו להפריד את המזנטריה מהמעי הגס ועשו חתך בקצה פי הטבעת.

השתמש במספריים כדי לחתוך את המעי הגס פתוח לאורך והשתמש בטמפרטורת החדר C-M-F-P-B-S כדי לשטוף את תוכן הצואה והריר מלומן המעי. לאחר מכן השתמש במספריים והמלקחיים למקרוסקופיה. נתחו את כתמי המדורות לאורך המשטח האנטי מזנטרי של המעי הדק, וחתכו את המעי הדק לאורך.

לאחר מכן, נקה את לומן המעי הדק מתכולת צואה וריר עם יותר טמפרטורת חדר C-M-F-P-B-S. בנפרד, חותכים את המעי הדק והגס לחתיכות של כ-1.5 סנטימטר ומניחים את החלקים בצינורות חרוטיים בודדים של 50 מיליליטר המכילים 30 מיליליטר של C-M-F-H-B-S-S לפני המלחמה עם FBS ו-2 מילי-מולרי EDTA. הנח כל צינור חרוטי של 50 מיליליטר אופקית לתוך שייקר מסלולי ומנער את הצינורות ב-250 סל"ד למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הניחו מסננת רשת אחת מעל דלי אשפה. יוצקים את התוכן של כל צינור חרוטי של 50 מיליליטר דרך הרשת כדי לשחזר את חתיכות המעי ולאחר מכן מניחים אותם בצינורות חרוטיים בודדים חדשים של 50 מיליליטר המכילים 30 מיליליטר C-M-F-H-B-S-S עם FBS עם שני מילי-מולרי EDTA. לבסוף, החזירו את הצינורות לשייקר המסלול למשך 20 דקות נוספות.

לאחר סבב הטלטול השני, שפכו את תכולת כל צינור דרך המסננת. שוב, טפחו את עודפי המדיה באמצעות מגבת נייר, ולאחר מכן העבירו את חתיכות המעי לסירת מי גבינה קטנה מפלסטיק. ההיבט הקשה ביותר בטכניקה זו הוא עיכול הרקמות כדי להבטיח הצלחה, יש לקחת בחשבון את כל הפרמטרים השונים של משך העיכול, תכונות הקולגנאז, שלמות הרקמה וגודל הרקמה שיש לעכל באמצעות מספריים במהירות.

קוצצים את חתיכות המעי ואז מוסיפים את המעי הטחון לצינור חרוטי בגודל 50 מילימטר המכיל 20 מיליליטר תמיסת קולגנאז. הנח את הצינור החרוטי אופקית לתוך שייקר המסלול ועכל את חתיכות המעי ב-200 סל"ד למשך 10 עד 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. כעת מערבל לזמן קצר את הצינור כדי להבטיח דיסוציאציה יסודית של כל רקמת המעי שנותרה ולאחר מכן סנן את תמיסת התאים דרך מסננת תאים של 100 מיקרון ישירות לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר.

לבסוף, מלאו את הצינור החרוטי עם C-M-F-H-B-S-S עם FBS וצנטריפוגה את תמיסת התא פעמיים למשך חמש דקות ב-425 כפול G בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שפכו את הסופרנטנט ותלו מחדש את כדור התא בקור קרח C-M-F-H-B-S-S עם FBS והניחו את הדגימות על קרח. לאחר צביעת התאים עבור חלבוני פני השטח המעניינים.

התחל ביצירת תרשים נקודות שאינו כולל את התאים החיוביים לכתם התא המת כפי שמודגם כאן. לאחר מכן, אל תכלול אירועים כפולים כפי שמוצג כאן וכאן. כעת השתמש בערוצי הפיזור קדימה והצד כדי לשער על התאים המעניינים, והקפד לא לכלול פסולת.

לאחר מכן צור שער עלילת נקודות נוסף על האנטיגן החיובי CD 45 והחיובי IAB. הצגת תאים בתרשים נקודות נפרד יוצרת אזורים להבחנה בין תת-קבוצות ספציפיות של DC ומקרופאגים. אזור R אחד המוצג כאן לוכד את התאים השליליים העמומים CD 11 C חיובי CD 11 B.

אזור R שני תוחם את התאים בעלי רמת ביטוי פני השטח דומה עבור CD 11 C כמו התאים באזור R one, אך המבטאים גם CD 11 B. שלושת אזורי R מציינים את התאים שהם CD 11, B חיובי ו-CD 11 C שלילי עמום. ניתן לנתח את שלושת האזורים הללו עבור ביטוי F 4 80 ו-CD 1 0 3 כדי להבדיל בין אוכלוסיות מקרופאגים ו-DC בהתאמה. כפי שניתן לראות בתרשים הנקודות הזה, התאים השליליים העמומים CD 11 C חיובי CD 11 B באזור R one יבטאו רמות גבוהות של אלפא עין CD 1 0 3 ורמות נמוכות של F ארבע 80.

תרשים נקודות זה מראה כי תאים חיוביים CD 11 B חיוביים ל-CD 11 C באזור R 2 יהיו מורכבים הן מ-DCS והן ממקרופאגים בהתבסס על הביטוי הדיכוטומי שלהם של CD 1 0 3 ו-F 4 80. לבסוף, בהתבסס על הפרופיל הפנוטיפי F 4 80 חיובי ו-CD 1 0 3 שלילי R שלוש, CD 11 B חיובי CD 11 C דל שלילי תאי CD 11 C דל שליליים מגודרים יהיו מורכבים ממקרופאגים, הקשר בין משך עיכול הרקמות על תפוקת התאים הכוללת לבין הביטוי של CD 11 B ו-CD 11 C מודגם בששת האיורים הבאים. רקמת מעי המתעכלת במשך שלוש דקות מניבה מספר תאים כולל נמוך וכתוצאה מכך מעט dcs ומקרופאגים זמינים לאפיון עיכול רקמות למשך 11 דקות מייצר תפוקה חזקה של תאים חיים, ומניב אוכלוסיות של dcs ומקרופאגים המבטאים רמות גבוהות של CD 11 B ו- CD 11 C הנבדלים פנוטיפית.

לעומת זאת, עיכול במשך 50 דקות מביא לתפוקת תאים דומה בהשוואה לעיכול אופטימלי. עם זאת, תיחום אוכלוסיות תאים שונות באמצעות CD 11 B ו-CD 11 C הופך לקשה יותר. ככל שהביטוי של CD 11 C פוחת ומספר התאים המתים עולה.

כך שעם אופטימיזציה של הפרמטרים לעיכול רקמת המעי, ניתן להשיג במהירות תפוקת תאים חזקה. כתוצאה מכך, הבידוד המהיר של dcs ומקרופאגים במעי עכבר יכול להיות שימושי להערכת התכונות התפקודיות של תאים חיסוניים עם אנטיגנים שלמים על פני השטח.