Name: בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: למד שיטה לבידוד תאים דנדריטיים ומקרופגים מהמעי העכבר באמצעות עיכול רקמת למינה פרופריה וציטומטריית זרימה. השיטה מאפשרת איפיון פנוטיפי ופונקציונלי מדויק של תאי חיסון מעיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אהרון ריי (אוניברסיטת אמורי המחלקה לרפואת ילדים בריאות לילדים של Core תזרים אטלנטה) עבור מיון התא. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק AA01787001, פיתוח קריירה פרס מ קרוהן קוליטיס קרן של אמריקה, מרכז המחקר אמורי-Egleston לילדים זרע מענק TLD

1. דיסקציה ודיסוציאציה בתאי האפיתל במעי הכנת חומרים כימיים וציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם Ca 2 + / 2 + Mg ללא PBS (CMF PBS) לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ע&quot;א חם 2 + / 2 מ&quot;ג + ללא HBSS עם FBS 5% (CMF HBSS / FBS) ו - 2 מ&quot;מ EDTA לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם Orbital שאכר אל 37 ° C. </li></ul> הערה: צעדים 1.1 ל 1.7 יש לבצע מהר ככל האפשר כדי למזער את היקף מותם של תאים כדי להשיג תשואה מקסימלית התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בתא CO 2 ואתנול ספריי 70% על הבטן ועל החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך אופקי קטן באמצע הבטן עם מספריים לקלף בחזרה את העור לחשוף הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להפריד בין הקיבה למעי הדק העליון על ידי חיתוך על הסוגר השוער. להקניט משם לפדר עם מלקחיים וחותכים שובשסתום ileo-cecal לשחרר את המעי הדק כולו מן המעי הגס. לעשות חתך על סף אנאלי ושוב ניסתה להפריד לפדר עד למעי הגס ללא תשלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים לפתוח את המעי הגס longitudinally באמצעות מספריים לשטוף את התוכן צואה וריר של לומן המעי ב CMF PBS בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מספריים מלקחיים כדי macroscopically לנתח את המדבקות של Peyer על פני השטח נגד mesenteric של המעי הדק ופצע פתוח המעי הדק longitudinally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את לומן המעי הדק של תוכן צואה וריר ב CMF PBS בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד לחתוך את המעי קטן / גדול לתוך כ 1.5 ס&quot;מ חתיכות ומניחים בתוך 50 צינורות נפרדים מ&quot;ל חרוטי המכילים 30 מ&quot;ל מחומם מראש CMF HBSS / FBS ו 2 מ&quot;מ EDTA. אין להוסיף יותר מ 1 לכל צינור המעי מ&quot;ל 50 חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופקית למקם כל צינור חרוטי 50 מ&quot;ל לתוך שייקר מסלולית וללחוץ על סל&quot;ד 250 על 20 דקות בשעה 37 ° C. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסננת אחת קווי מעל דלי פסולת ויוצקים את תוכן הצינור לכל קוני 50 מ&quot;ל דרך לשחזר את חתיכות 1.5 ס&quot;מ של המעי ומניחים אותם 50 צינורות נפרדים חרוטי מ&quot;ל המכיל 30 מ&quot;ל של טרום חוממו CHBSS / FBS עם 2 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 1.8. </li></ol> 2. רקמת העיכול בידוד של תאים במערכת העיכול ההכנות של חומרים כימיים וציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Collagenase פתרון: 1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​סוג השמיני collagenase מומס מחומם מראש CMF HBSS / FBS עם 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של DNase א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחומם מראש CMF HBSS / FBS ו 2 מ&quot;מ EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחומם מראש מסלולית שייקר ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קר כקרח CMF HBSS / FBS. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסיבוב השני של רעד, לשפוך את תוכן הצינור לכל קוני 50 מ&quot;ל דרך מסננת ולהעביר 1.5 ס&quot;מ של המעי חתיכות פלסטיק קטן שוקל הספינה לאחר מספיגה משם התקשורת עודף באמצעות מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות בשר טחון 1.5 חתיכות ס&quot;מ של המעי באמצעות מספריים ישירות הסירה משקל ולהוסיף המעי טחון ל 20 מ&quot;ל של תמיסת collagenase. אופקית למקם כל צינור חרוטי 50 מ&quot;ל לתוך שייקר מסלולית ולעכל בסל&quot;ד 200 דקות 10-20 ב 37 ° C. ראה דיון בהמשך על אופטימיזציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת לזמן קצר על מנת להבטיח ניתוק יסודית של רקמות מסנן כל המעי הנותר דרך מסננת 100 מיקרומטר תא ישירות לתוך צינור מ&quot;ל 50 חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעלה את הצינור בכל חרוטי 50 מ&quot;ל עם CMF HBSS / FBS ו צנטריפוגות בסל&quot;ד 1500 דקות 5 על 4 ° C. אם גלולה מוצקה לא ציין עבור דגימות המעי הגס לאחר צנטריפוגה, הדגימות יש centrifuged שוב דק &#39;3.5. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant ו resuspend תא גלולה ב קר כקרח CMF HBSS / FBS דגימות קרח על המקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לסעיף 3 לרכישת FACS / ניתוח או סעיף 4 להעשרת מגנטי חרוז עבור במהירות גבוהה התא sorting. </li></ol> 3. נוגדנים מכתים עבור ניתוח רב Flow צבע Cytometric של DCS ומקרופגים ההכנות של חומרים כימיים וציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קר כקרח CMF PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קר כקרח מכתים חיץ (CMF PBS + 5% FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התא מת כתם על קר כקרח CMF PBS בדילול 1:1000 באמצעות LIVE / מת אפשר לתקן ערכת אקווה Cell המלח הכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין את הקוקטייל מכתים נוגדנים על ידי הוספת הבאים הקרינה, שכותרתו נוגדנים חד שבטיים (מבז) למאגר קפוא מכתים: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (IA B)-Alexa פלואוריד 700, CD11b eFluor-450, F4/80-PE-Cy7. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים לתוך 5 מ&quot;ל קלקר צינור (FACS) מסביב לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים קר כקרח CMF PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות דגירה עם תאים מתים כתם במשך 15 דקות על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים קר כקרח CMF PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק תאים עם anti-FcγRIII/II 2.4G2 ב מכתים קר כקרחמאגר של 10 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים במאגר קר כקרח מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות עם קוקטייל נוגדנים מכתים עבור 20 דקות על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם חיץ קפוא מכתים פעמיים resuspend דגימות μl 400 מאגר קפוא מכתים ולעבור שווי 40 מיקרומטר מסנן על צינורות FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דגימות על LSR II cytometer (BD) כפי שהוגדרו על ידי אסטרטגיה gating בסעיף 5, איור 1. </li></ol> 4. העשרת DCS ומקרופגים מהמעי ההכנות של חומרים כימיים וציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קר כקרח מכתים חיץ (CMF PBS + 5% FBS). </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ההשעיה תא בודד המתקבל צעד 2.5 עם CD11b ו CD11c חרוזים מחשבי Mac פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם חיץ קר כקרח מכתים ואחריו צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant ו resuspend תא גלולה במאגר 1 קר כקרח מכתים מ&quot;לולעבור מסננת 100 מיקרומטר התא ואחריו מסננת תא 40 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעשיר את החרוז-מצורפים תאים מגנטיים ידי סלקציה חיובית באמצעות MACS טור LS מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.2 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם סמן מבז השטח כפי שמתואר בשלב 3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מגנטיים חרוז, מועשר בתאי פעמיים עם חיץ קר כקרח מכתים. Resuspend כדורי סלולריים במאגר 500 קר כקרח μL מכתים ללא אזיד הנתרן, ומעבירים דרך מסננת 40 מיקרומטר התא לתוך צינור FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך FACS-מיון על סדרן ARIA II תא BD למיין DC המעי ו / או תת מקרופאג של עניין. </li></ol> 5. Gating אסטרטגיה LP נגמ&quot;שים הערה: שימו לב, תאים במערכת העיכול בלא כתם עשוי להיות מנוצל כביקורת שלילית לסייע מיקום נכון של השערים להפריד בין אוכלוסיות חיוביות ושליליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שניתן לראות בתרשים1, ליצור עלילה נקודה לא לכלול תאים חיוביים עבור התא מת הכתם (איור 1 א) ואחריו למעט אירועים חולצה מהודקת (איור 1B ו-C). לאחר מכן, השער על תאים של עניין על פי קדימה פיזור בצד לוודא להוציא פסולת (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור עוד עלילה נקודה ושער נוסף על CD45 + ו-IA-B + תאים, אשר phenotypically המאפיינת נגמ&quot;שים 1E (איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מגרש נקודה נפרדת, לנתח עבור CD11b וביטוי CD11c להבחין DC ספציפיים תת מקרופאג (R1, R2 ו R3;. איור 1F). תאים של R1 הם CD11c + CD11b משעממים / - תאים. האזור, R2, מותווה כך התאים הללו יש רמות דומות של הבעת פני השטח של CD11c כמו תאים של R1 אבל גם תאים של R2 Express CD11b. לאחר מכן, באזור R3 מיועד תאים שאינם + CD11b ו CD11c משעמם / -. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">alyze אזורים R1, R2, וביטוי נוסף על F4/80 ו CD103 R3 להבדיל מקרופאג ואוכלוסיות DC, בהתאמה. CD11c + CD11b משעמם / - תאים של רמות גבוהות של R1 אקספרס integrin αE, CD103, ורמות נמוכות של F4/80 (איור 1G). CD11b + + CD11c תאים של R2 מורכבים משני DCS ומקרופגים המבוססים על ביטוי דיכוטומי שלהם CD103 ו F4/80 (איור 1H). לבסוף, CD11b + CD11c משעממים / - תאים של מקרופאגים R3 מהווים בסיס פרופיל פנוטיפי של F4/80 + ו-CD103 - (איור 1i) 16. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4040/4040fig1.jpg" /> באיור 1. האסטרטגיה gating עבור DCS ומקרופגים מעיים. תאים מתים () ו כפילויות (B ו-C) לא נכללו 1 מתוך ניתוח ולאחר מכן intesti קטןתאים NAL היו מגודרת בהתאם קדימה לצד פיזור (ד &#39;), ונגמ&quot;שים הוגדרו CD45 + IA B + (ה). מקרופאגים ו DCS זוהו על ידי ביטוי של CD11b ו CD11c (F). CD103 ו F4/80 ביטוי תאים טרום מגודרת על R1 (G), R2 (ג) ו R3 (אני) אוכלוסיות נותח. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4040/4040fig2.jpg" /> איור 2. התשואה התא מכתים איכות נוגדנים תלוי בזמן העיכול. CD11b דפוס מכתים CD11c תשואה התא הכולל של תת (A, D), בצורה אופטימלית, (B, E) או מעל מתעכל (C, F) רקמת המעי. תאים במערכת העיכול נותקו מן המעי קטן C57BL / 6 העכבר DCS ומקרופגים נותחו על ידי FACS על LSR BD השנייה. מתח הפיצוי נקבעו באמצעות בלא כתם חד fluorochrome המוכתמים splenocytes. תאים מתים (איור 1 א) ו כפילויות (איור 1 ב &#39;וג&#39;) לא נכללו 1 מניתוח. תאים של עניין ולאחר מכן נותחו על פי קדימה לצד פיזור (איור 1D) ואחריו gating על CD45 + ו-IA ב + תאים (איור 1E). לאחר מכן, CD11b וביטוי CD11c הוערך בין CD45 + IA B + תאים להתוות שלושה אזורים (R1, R2 ו R3;. איור 1F). CD103 ו F4/80 ביטוי בשלושת האזורים הוערך להבחין בין DCS ומקרופגים, בהתאמה. CD11c + / משעמם CD11b - תאים של R1 הביעו רמות גבוהות של integrin αE, CD103, ורמות נמוכות של F4/80 (איור 1G). CD11b + + CD11c תאים של R2 הורכבו שני DCS ומקרופגים המבוססים על ביטוי דיכוטומי שלהם CD103 ו F4/80 (איור 1H) תוך CD11b + CD11c משעממים / - תאים של מקרופאגים R3 מהווים בסיס פרופיל פנוטיפי של F4 / 80 + ו CD103 - ( <strאונג&gt; איור. 1i) 16. מקרופאגים בתוך השער R2 ומקרופגים בשער R3 יש קדימה דומה ולפזר תכונות לוואי והם להבחין ידי ביטוי CD11c. הדיכוטומיה פונקציונלי של תת קבוצות אלה עדיין מובנת. הקשר בין משך הזמן של עיכול רקמות על התשואה התא הכולל את הביטוי של CD11b ו CD11c מתוארת באיור 2. רקמת המעי אשר מתעכל דקות 3 (תת מערכת העיכול) הניב התא נמוכה המספר הכולל (איור 2 ד) ו - DCS ספורים ובכך ומקרופגים זמינים לאפיון (איור 2 א). עיכול רקמת דקות 11 המיוצר על תשואה יציבה של תאים חיים (2E איור) עם אוכלוסיות של DCS ומקרופגים שהביעו רמות גבוהות של CD11b ו CD11c והיו ברורים phenotypically (איור 2 ג). לעומת זאת, עיכול דקות 50 (יתר מערכת העיכול) הביא תשואה התא דומה כאשר שיתוףmpared לעיכול אופטימלי (2E F איור ו), עם זאת, סימון של אוכלוסיות תאים שונות באמצעות CD11b ו CD11c הפך מעורפל יותר כביטוי של פחתה CD11c (איור 2 ג) ואת מספר התאים המתים גדל (מידע לא מוצג).

<ol><li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li>
<li>Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+antigen+presentation+and+the+control+of+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity.</a> Trends Immunol. 22, 120-122 (2001).</li>
<li>Abraham, C., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+host+innate+immune+system+and+microbes+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Interactions between the host innate immune system and microbes in inflammatory bowel disease.</a> Gastroenterology. 140, 1729-1737 (2011).</li>
<li>Macdonald, T. T., Monteleone, I., Fantini, M. C., Monteleone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regula+tine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Regula tine.</a> Gastroenterology. 140, 1768-1775 (2011).</li>
<li>Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal dendritic cells.</a> Adv. Immunol. 107, 109-138 (2010).</li>
<li>Platt, A. M., Bain, C. C., Bordon, Y., Sester, D. P., Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+independent+subset+of+TLR+expressing+CCR2-dependent+macrophages+promotes+colonic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">An independent subset of TLR expressing CCR2-dependent macrophages promotes colonic inflammation.</a> J. Immunol. 184, 6843-6854 (2010).</li>
<li>Coombes, J. L., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+intestinal+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in intestinal immune regulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 435-446 (2008).</li>
<li>Kelsall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+understanding+the+phenotype+and+function+of+intestinal+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in understanding the phenotype and function of intestinal dendritic cells and macrophages.</a> Mucosal Immunol. 1, 460-469 (2008).</li>
<li>Pulendran, B., Tang, H., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor%2C+plasticity%2C+and+crosstalk+between+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Division of labor, plasticity, and crosstalk between dendritic cell subsets.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 61-67 (2008).</li>
<li>Denning, T. L., Wang, Y. C., Patel, S. R., Williams, I. R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamina+propria+macrophages+and+dendritic+cells+differentially+induce+regulatory+and+interleukin+17-producing+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lamina propria macrophages and dendritic cells differentially induce regulatory and interleukin 17-producing T cell responses.</a> Nat. Immunol. 8, 1086-1094 (2007).</li>
<li>Niess, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1-mediated+dendritic+cell+access+to+the+intestinal+lumen+and+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance.</a> Science. 307, 254-258 (2005).</li>
<li>Milling, S. W., Cousins, L., MacPherson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+DCs+interact+with+intestinal+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">How do DCs interact with intestinal antigens.</a> Trends Immunol. 26, 349-352 (2005).</li>
<li>Bilsborough, J., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+dendritic+cells+play+a+role+in+immunity%2C+tolerance%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal dendritic cells play a role in immunity, tolerance, and disease.</a> Gastroenterology. 127, 300-309 (2004).</li>
<li>Stagg, A. J., Hart, A. L., Knight, S. C., Kamm, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+cell%3A+its+role+in+intestinal+inflammation+and+relationship+with+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria.</a> Gut. 52, 1522-1529 (2003).</li>
<li>Medina-Contreras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+regulates+intestinal+macrophage+homeostasis%2C+bacterial+translocation%2C+and+colitogenic+Th17+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 regulates intestinal macrophage homeostasis, bacterial translocation, and colitogenic Th17 responses in mice.</a> J. Clin. Invest. 121, 4787-4795 (2011).</li>
<li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Specializations+of+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+That+Control+Th17+and+Regulatory+T+Cell+Responses+Are+Dependent+on+the+T+Cell%2FAPC+Ratio%2C+Source+of+Mouse+Strain%2C+and+Regional+Localization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional Specializations of Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets That Control Th17 and Regulatory T Cell Responses Are Dependent on the T Cell/APC Ratio, Source of Mouse Strain, and Regional Localization.</a> J. Immunol. , 187-733 (2011).</li>
<li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nod2+sensor+promotes+intestinal+pathogen+eradication+via+the+chemokine+CCL2-dependent+recruitment+of+inflammatory+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Nod2 sensor promotes intestinal pathogen eradication via the chemokine CCL2-dependent recruitment of inflammatory monocytes.</a> Immunity. 34, 769-780 (2011).</li>
<li>Schulz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+CD103%2B%2C+but+not+CX3CR1%2B%2C+antigen+sampling+cells+migrate+in+lymph+and+serve+classical+dendritic+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intestinal CD103+, but not CX3CR1+, antigen sampling cells migrate in lymph and serve classical dendritic cell functions.</a> J. Exp. Med. 206, 3101-3114 (2009).</li>
<li>Jaensson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestinal+CD103%2B+dendritic+cells+display+unique+functional+properties+that+are+conserved+between+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Small intestinal CD103+ dendritic cells display unique functional properties that are conserved between mice and humans.</a> J. Exp. Med. 205, 2139-2149 (2008).</li>
<li>Uematsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+humoral+and+cellular+gut+immunity+by+lamina+propria+dendritic+cells+expressing+Toll-like+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of humoral and cellular gut immunity by lamina propria dendritic cells expressing Toll-like receptor 5.</a> Nat. Immunol. 9, 769-776 (2008).</li>
<li>Schenk, M., Bouchon, A., Seibold, F., Mueller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1--expressing+intestinal+macrophages+crucially+amplify+chronic+inflammation+in+experimental+colitis+and+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">TREM-1--expressing intestinal macrophages crucially amplify chronic inflammation in experimental colitis and inflammatory bowel diseases.</a> J. Clin. Invest. 117, 3097-3106 (2007).</li>
<li>Sun, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestine+lamina+propria+dendritic+cells+promote+de+novo+generation+of+Foxp3+T+reg+cells+via+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid.</a> J. Exp. Med. 204, 1775-1785 (2007).</li>
<li>Kamada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormally+differentiated+subsets+of+intestinal+macrophage+play+a+key+role+in+Th1-dominant+chronic+colitis+through+excess+production+of+IL-12+and+IL-23+in+response+to+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Abnormally differentiated subsets of intestinal macrophage play a key role in Th1-dominant chronic colitis through excess production of IL-12 and IL-23 in response to bacteria.</a> J. Immunol. 175, 6900-6908 (2005).</li>
<li>Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+Th+cells+resembling+regulatory+T+cells+that+inhibit+chronic+colitis+differentiate+in+the+absence+of+interactions+between+CD4+and+class+II+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+ Th cells resembling regulatory T cells that inhibit chronic colitis differentiate in the absence of interactions between CD4 and class II MHC.</a> J. Immunol. 171, 2279-2286 (2003).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

<img src="/files/ftp_upload/4040/4040fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. גורמים חשובים עבור אופטימיזציה של התשואה התא אנטיגן ביטוי על פני השטח. תשואה תא אנטיגן ביטוי פני מושפעים ישירות על ידי כל תקופת עיכול רקמות, המאפיינים הספציפיים של collagenase, תואר של רקמות מיותרות, ונוכחות או העדר דלקת, אשר עשויים להשפיע על שלמות רקמות cellularity. עיכול רקמת ממושך עלול לגרום כדאיות התא ירד אנטיגן ביטוי פני השטח תוך כדי עיכול רקמות מספקת עלולה לגרום מיעוט של תאים לניתוח. ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 1X PBS, Ca 2 + - ו - Mg 2 + ללא </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> האנק של פתרון מאוזן מלח (HBSS) עם פנול אדום </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> SH3001603 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> סיגמא </td><td> S6014 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M ב NaCl 0.85% </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> העובר שור בסרום (FBS) </td><td> אטלנטה ביולוגיות </td><td> S11150H </td><td> חום מומת </td></tr><tr><td> 0.5m EDTA (pH 8.0) </td><td> Cellgro </td><td> 46-034-CI </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasה סוג השמיני </td><td> סיגמא </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> רוש </td><td> 14785000 </td><td> הפתרון במלאי: 100mg/ml </td></tr><tr><td> LIVE / מת קיט אפשר לתקן אקווה Cell המלח הכתם על עירור 405 ננומטר </td><td> Invitrogen </td><td> L34957 </td><td> השתמש ב 1:1000 </td></tr><tr><td> CD45-PerCP מב (30F11) </td><td> BD </td><td> 557235 </td><td> השתמש ב 1:100 </td></tr><tr><td> CD103-PE מב (M290) </td><td> BD </td><td> 557495 </td><td> השתמש ב 1:100 </td></tr><tr><td> FcγRIII / II מב (2.4G2) </td><td> BD </td><td> 553141 </td><td> השתמש ב 1:200 </td></tr><tr><td> CD11c-APC מב (N418) </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82 </td><td> השתמש ב 1:100 </td></tr><tr><td> MHC-II (I-AB), Alexa פלואוריד 700 MAB </td><td> eBioscience </td><td> 56-5321-82 </td><td> השתמש ב 1:100 </td></tr><tr><td> CD11b eFluor-450MAB (M1/70) </td><td> eBioscience </td><td> 48-0112-82 </td><td> השתמש ב 1:200 </td></tr><tr><td> F4/80-PE-Cy7 מב (BM8) </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801-82 </td><td></td></tr><tr><td> CD11b microbeads </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-049-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c microbeads </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי </td><td> BD פלקון </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td> רשת אחת חוט מסננת </td><td> Chefmate </td><td></td><td></td></tr><tr><td> קטן שוקל סירה </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 08-732-116 </td><td></td></tr><tr><td> תא 100 מיקרומטר מסננת </td><td> BD פלקון </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td> תא 40 מיקרומטר מסננת </td><td> BD פלקון </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 5 מ&quot;ל קלקר מסביב התחתונה צינורות </td><td> BD פלקון </td><td> 352235 </td><td> השתמש ב 1:100 </td></tr><tr><td> MaxQ 4450 benchtop מסלולית שאכר </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LS טור MACS </td><td> Miltenyi BIOTEC </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> LSR II </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FACSAria II </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

בתוך המעי מתגוררים אוכלוסיות ייחודיות של תאים חיסוניים מולד אדפטיבית המעורבים בקידום הסובלנות כלפי פלורה commensal ו אנטיגנים מזון תוך במקביל צפוי להישאר לעלות תגובות דלקתיות כלפי 1,2 פתוגנים פולשניים. תאים מציגי אנטיגן, במיוחד DCS ומקרופגים, ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על הומאוסטזיס החיסון במעי באמצעות יכולתם לחוש כראוי להגיב החיידקים 3-14. בידוד יעיל של DCS ומקרופגים מעיים הוא שלב קריטי לאפיון הפנוטיפ ותפקוד של תאים אלה. בעוד שיטות יעילות רבות של בידוד תאים חיסוניים מעיים, כולל DCS ומקרופגים, תוארו 6,10,15-24, רבים מסתמכים על פי digestions ארוכים שעלולים להשפיע לרעה על שטח פני התא אנטיגן הביטוי, כדאיות התא, ו / או תשואה התא. כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של מספר רב של viabl, דואר DCS מעיים ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע ישירות על ידי מכתים תאים במערכת העיכול מבודדים עם ספציפיים נוגדנים חד שבטיים הקרינה, שכותרתו עבור ניתוח רב צבע זרימת cytometric. יתר על כן, DC טהור מאוד מקרופגים אוכלוסיות מבודדות ללימודי תפקודית ניצול CD11c ו CD11b מגנטי פעילה חרוזים סלולריים מיון ואחריו מיון התא.

כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של המעיים עכבר תאים דנדריטים (DCS) ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע באמצעות ריבוי צבעים ניתוח תזרים cytometric תוך העשרת חרוז מגנטי ואחריו מיון התא משמש להניב אוכלוסיות טהורות ביותר ללימודי תפקודית.

בתוך המעי שוכנות אוכלוסיות ייחודיות של תאי מערכת חיסון מולדת ומסתגלת, המעורבים בקידום סבילות כלפי פלורה קומנסאלית ו...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד במהירות תאי דנדריטיים של המעי בעכבר (dcs) ומקרופאגים לצורך אפיון פנוטיפי ותפקודי. זאת מושג תחילה על ידי קצירת רקמת מעי. השלב השני הוא הפרדת אפיתל המעי מה-lamina propria.בשלב הבא, ה-Lamina Propria של המעי עוברת עיכול במהלך השלבים הסופיים של הפרוצדורה. תאי ה-Lamina propria נצבעים באמצעות פלואורסצנציה ונוגדנים מצומדים, ומסוננים (gated) לאוכלוסיות תאים ספציפיות. בסופו של דבר, ניתן לאפיין באופן מדויק יותר את אוכלוסיות ה-DC והמקרופאגים של המעי ולטהרן לצורך מחקרים פונקציונליים להערכת ייצור ציטוקינים, הצגת אנטיגן וויסות של תאי מערכת החיסון.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שמהירות עיכול הרקמה מבטיחה ביטוי אופטימלי של אנטיגנים על פני השטח של התא, חיוניות התאים, ו/או תקינות תאית. לאחר קריאת העכבר ואישור המוות באמצעות רפלקס צביטה באצבע, רסס 70%ethanol על הבטן והחזה של בעל החיים. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לבצע חתך אופקי קטן במרכז הבטן וקלף את העור כדי לחשוף את הפריטוניאום.פתחו את הפריטוניום באמצעות מספריים לאחר חיתוך בספינקטר הפילורי כדי להפריד את הקיבה מהמעי הדק העליון, והשתמשו בפינצטה להרחקה עדינה של המזנטריון. חתכו שוב בשסתום המעי הדק-מעי הגס (ileocecal valve) כדי לשחרר את כל המעי הדק מהמעי הגס. המשיכו להפריד בעדינות את המזנטריון מהמ

isolation-characterization-dendritic-cells-macrophages-from-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בידוד של לימפוציטים באמצעות MACS Miltenyi ערכת מהווה דרך אמינה לטהר תאים שלמים homogenates רקמת הלימפה. תאים מטוהרים באמצעות מערכת Miltenyi הם בדרך כלל ≥ 96% טהור. הנה, אנחנו מדגימים את הצעדים שננקטו כדי לבודד תאים מסוג CD4 + T, אחת ערכות רבים המוצעים על ידי Miltenyi.

בידוד של תאים מסוג CD4 + T מ בלוטות לימפה עכבר באמצעות טיהור Miltenyi MACS

הכנה מטוהרים של ריאות תאים דנדריטים עכבר מתואר. דגש ספציפי ניתנת הבידוד של תת קונבנציונאלי תאים דנדריטים.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

יש התעניינות הולכת וגובר בהבנת הפונקציות החיסוניות של אוכלוסיות מסוימות של תאים בתיקונים של Peyer (PPS), אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים כרוכות בכך. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לניתוח cytometric זרימה וcryosections PP לimmunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבודד תאי המציגים אנטיגנים מבלוטת התימוס אנושית דרך שלבים שונים של עיכול אנזימטי של הרקמה ואחריו צנטריפוגה צפיפות של ההשעיה התא בודדת ומיון לבסוף מגנטי ו / או FACS של אוכלוסיות התאים של עניין.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

יש עניין גובר באפיון הכמותי של לימפוציטים במעי עקב ההכרה הגוברת בכך שתאים אלה ממלאים תפקיד קריטי במגוון מחלות מעיים ומערכתיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד אוכלוסיות תאים בודדים מתאי מעי דק שונים לאפיון ציטומטרי זרימה לאחר מכן.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

נתאר כאן שיטה כדי לבודד ולטהר תאים דנדריטים שונים אנטומי בתאים אנושיים באיברי הרבייה הנקביים על ההערכה של תכונות פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונליים שלהם. בשיטה זו ניתן להתאים כדי לבודד תאים חיסוניים אחרים או תאים דנדריטים של רקמות הרירית אחרות.

בידוד של תאים דנדריטים האדם באיברי הרבייה הנקביים ללימודי פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונלי

נגזר מונוציט DC (MoDC) יכול לחוש כמויות זעירות של מולקולות הקשורות סכנה, ולכן טענתי בקלות. אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של MoDC של דם וגידולים שלהם הפעלה עם מכלולים חיסוניים תוך הדגשת מפתח הזהירות הנחשבות על-מנת למנוע הפעלה מוקדמת שלהם.

בידוד פרוטוקול של העכבר נגזר מונוציט תאים דנדריטים והפעלה שלהם עוקבות במבחנה עם מכלולים חיסוניים הגידול

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את התאים המונונרורים השוכנים בתוך המעי הגס של הנקודתיים על ידי העיכול אנזימטית של הרקמה באמצעות קולגן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל של תאים מוניוצלולים וכתוצאה מכך השעיית תא בודד אשר בתורו יכול לשמש עבור immunophenotyping קלדה חזקה.

בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז

מחקר זה משתמש cytometry זרימה ושתי אסטרטגיות gating שונות על עכברים מבודדים perfused מוח choroid plexuses; פרוטוקול זה מזהה את תתי-הערכות העיקריות של תאי החיסון המאכלסות מבנה מוח זה.

בידוד ואפיון של תאי מערכת החיסון מזכוכית זרחית עכבר מיקרוניתוח

למד שיטה לבידוד תאים דנדריטיים ומקרופגים מהמעי העכבר באמצעות עיכול רקמת למינה פרופריה וציטומטריית זרימה. השיטה מאפשרת איפיון פנוטיפי ופונקציונלי מדויק של תאי חיסון מעיים.

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

גלה סרטונים נוספים