פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

המטרה הכוללת של מודל קוליטיס מונע אנטיגן זה היא לקבוע אם פגוציטים חד-גרעיניים חיוביים CX3, CR1 מקיימים אינטראקציה עם תאי T חיוביים CD4 ומפעילים אותם במהלך קוליטיס ספציפית לאנטיגן והאם התרחבות תאי T תלוית פגוציטים חד-גרעיניים מתרחשת בתוך למינה פרופריה במעי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות המעי הדלקתיות, כגון אילו סוגי אינטראקציה מתרחשים בתוך תאים מציגי אנטיגן ותאי T אפקטורים בלמינה פרופריה של המעי הגס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לחקור את האינטראקציה של תאי החיסון ואת האלמנטים המובילים לפתוגן של מחלות מעי דלקתיות.

שיטה זו משתמשת במודל קוליטיס העברת תאי T, שבו תאי CD4 T נאיביים ספציפיים לאנטיגן פלואורסצנטי אדום מועברים למארח חסר חיסוני, ומבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק בתאים חד-גרעיניים. העברת התאים מלווה בתנועה אוראלית של החיידקים הכחולים המבטאים אנטיגן פלואורסצנטי. ניתן לעקוב אחר האירועים החיסוניים המתרחשים בלמינה פרופריה של המעי של המארחים בשלבים שונים של התפתחות המחלה.

השתמש במספריים לדיסקציה כדי לפתוח את המעי הגס לאורך ולשטוף את הרקמה בצלחת פטרי המכילה 25 מיליליטר PBS כדי להסיר פסולת וריר. חותכים את המעי הגס לחתיכות של חמישה עד שמונה מילימטר ומניחים את השברים המתקבלים ב -20 מיליליטר של DPBS טריים ללא סידן ומגנזיום, בתוספת עשרה מילי-מולרי HEPES וחמישה מילי-מולרי EDTA. מערבולת את הצינור עם הדגימה למשך 30 שניות במהירות מרבית.

לאחר מכן, דגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך עשר דקות עם ניעור עדין כדי להסיר את האפיתל. בתום הדגירה, וורטקס שוב למשך 30 שניות. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט המכיל את תאי האפיתל.

העבירו את חלקי הרקמה לצינור חדש המכיל 20 מיליליטר של PBS, HEPES ו-EDTA טריים, וחזרו על הדגירה עם שלבי המערבולת לפני ואחרי. לאחר החזרה השלישית, כל תאי האפיתל מוסרים והסופרנטנט צלול. שטפו את שברי הרקמה בעדינות ב-PBS כדי להסיר שאריות של תאי אפיתל.

חותכים את שברי הרקמה לשניים על שני חתיכות מילימטר ומעבירים את החלקים לעיכול בעשרה מילימטרים של מדיום RPI, בתוספת 0.5 מיליגרם למיליליטר של קולגנאז מסוג שמונה ועשר יחידות למיליליטר של DNAse אחד. מערבולת את הדגימות למשך 30 שניות. לאחר מכן, דגרו על חתיכות הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך ניעור במשך 30 עד 35 דקות ומערבלו את הצינור כל חמש דקות במהלך הדגירה.

כאשר הרקמה מתעכלת, מסננים את התרחיץ המתקבל דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. שטפו את מסננת התאים פעם אחת וסובבו את מתלה התא היחיד על ידי צנטריפוגה. לבסוף, שטפו את התאים פעם אחת ב- PBS ובצנטריפוגה.

לאחר מכן, קבע את מספר התאים ברי קיימא על ידי אי הכללה של טריפן כחול. חלבון פלואורסצנטי ציאן המייצר חלבון אובאלבומין המייצר e. coli מפעיל ייצור אינטרפרון גמא בתאי OT-II במבחנה בניגוד ל-e.

קולי המבטא CFP בלבד. הדמיה קונפוקלית תלת מימדית Ex vivo של רקמת המעי הגס של עכברים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק טרנסגני, המוזנים בביציות E. coli PCFP מדגימה את נוכחותם של החיידקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בתוך קריפטות המעי הגס ליד תאי האפיתל של המעי וממוקמים במשותף עם פגוציטים במעי המארח.

בבעלי חיים אדומים OT-II, תאי T חיוביים ל-CD4 מאופיינים בביטוי משותף של חלבון פלואורסצנטי אדום ו-V בטא חמש נקודה אחת. כאשר מאותגרים עם ביציות e. coli PCFP, עכברים טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק חסר לימפוציטים BNT שהושתלו באימוץ עם תאי T חיוביים CD4 חיוביים לליגנד CD62 OT-II מאבדים במהירות את משקל הגוף ומפתחים סימנים קליניים של קוליטיס.

שבעה ימים לאחר העברת התאים, רק כמה פגוציטים מארחים דגמו ביציות e. coli PCFP ותאים חיוביים אדומים OT-II אינם מזוהים. 14 יום לאחר העברת התאים, פגוציטים מארחים שדגמו את ה-e.

ביציות קולי PCFP ממוקמות בסמיכות לתאים האדומים החיוביים OT-II המועברים באימוץ. עד 21 יום לאחר העברת התאים, מספר גבוה של תאים מארחים דגמו את ביציות ה-e. coli PCFP והתאים האדומים החיוביים OT-II התורמים, הנמצאים מפוזרים ברחבי הלמינה פרופריה של המעי הגס, נמצאים במגע הדוק עם פגוציטים במעי המארח.

כאשר שולטים בה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צביעה של לימפוציטים במעי וניתוח ציטוקינים בסרום כדי לענות על שאלות נוספות לגבי מצב ההפעלה של תאי CD4 T ולאשר את חומרת הקוליטיס. לאחר כל פיתוח, טכניקה זו סוללת את הדרך למחקר בתחום ובאימונולוגיה כדי לחקור את האירועים הקטנים המובילים למחלות מעי דלקתיות במודל העכבר.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי חיסון של למינה פרופריה במעי הגס לניתוח ex vivo במורד הזרם.