פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T
18 בספטמבר 2016
במודל קוליטיס מונע אנטיגן זה, תאי OT-II CD4+ T המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום הועברו באופן מאומץ לעכברי RAG-/- המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בפגוציטים חד-גרעיניים (MPS). המארחים אותגרו עם Escherichia coli (E.coli) המבטא את חלבון האובאלבומין (OVA) שהתמזג לחלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP).
המטרה הכוללת של מודל קוליטיס מונע אנטיגן זה היא לקבוע אם פגוציטים חד-גרעיניים חיוביים CX3, CR1 מקיימים אינטראקציה עם תאי T חיוביים CD4 ומפעילים אותם במהלך קוליטיס ספציפית לאנטיגן והאם התרחבות תאי T תלוית פגוציטים חד-גרעיניים מתרחשת בתוך למינה פרופריה במעי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות המעי הדלקתיות, כגון אילו סוגי אינטראקציה מתרחשים בתוך תאים מציגי אנטיגן ותאי T אפקטורים בלמינה פרופריה של המעי הגס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לחקור את האינטראקציה של תאי החיסון ואת האלמנטים המובילים לפתוגן של מחלות מעי דלקתיות.
שיטה זו משתמשת במודל קוליטיס העברת תאי T, שבו תאי CD4 T נאיביים ספציפיים לאנטיגן פלואורסצנטי אדום מועברים למארח חסר חיסוני, ומבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק בתאים חד-גרעיניים. העברת התאים מלווה בתנועה אוראלית של החיידקים הכחולים המבטאים אנטיגן פלואורסצנטי. ניתן לעקוב אחר האירועים החיסוניים המתרחשים בלמינה פרופריה של המעי של המארחים בשלבים שונים של התפתחות המחלה.
השתמש במספריים לדיסקציה כדי לפתוח את המעי הגס לאורך ולשטוף את הרקמה בצלחת פטרי המכילה 25 מיליליטר PBS כדי להסיר פסולת וריר. חותכים את המעי הגס לחתיכות של חמישה עד שמונה מילימטר ומניחים את השברים המתקבלים ב -20 מיליליטר של DPBS טריים ללא סידן ומגנזיום, בתוספת עשרה מילי-מולרי HEPES וחמישה מילי-מולרי EDTA. מערבולת את הצינור עם הדגימה למשך 30 שניות במהירות מרבית.
לאחר מכן, דגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך עשר דקות עם ניעור עדין כדי להסיר את האפיתל. בתום הדגירה, וורטקס שוב למשך 30 שניות. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט המכיל את תאי האפיתל.
העבירו את חלקי הרקמה לצינור חדש המכיל 20 מיליליטר של PBS, HEPES ו-EDTA טריים, וחזרו על הדגירה עם שלבי המערבולת לפני ואחרי. לאחר החזרה השלישית, כל תאי האפיתל מוסרים והסופרנטנט צלול. שטפו את שברי הרקמה בעדינות ב-PBS כדי להסיר שאריות של תאי אפיתל.
חותכים את שברי הרקמה לשניים על שני חתיכות מילימטר ומעבירים את החלקים לעיכול בעשרה מילימטרים של מדיום RPI, בתוספת 0.5 מיליגרם למיליליטר של קולגנאז מסוג שמונה ועשר יחידות למיליליטר של DNAse אחד. מערבולת את הדגימות למשך 30 שניות. לאחר מכן, דגרו על חתיכות הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך ניעור במשך 30 עד 35 דקות ומערבלו את הצינור כל חמש דקות במהלך הדגירה.
כאשר הרקמה מתעכלת, מסננים את התרחיץ המתקבל דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. שטפו את מסננת התאים פעם אחת וסובבו את מתלה התא היחיד על ידי צנטריפוגה. לבסוף, שטפו את התאים פעם אחת ב- PBS ובצנטריפוגה.
לאחר מכן, קבע את מספר התאים ברי קיימא על ידי אי הכללה של טריפן כחול. חלבון פלואורסצנטי ציאן המייצר חלבון אובאלבומין המייצר e. coli מפעיל ייצור אינטרפרון גמא בתאי OT-II במבחנה בניגוד ל-e.
קולי המבטא CFP בלבד. הדמיה קונפוקלית תלת מימדית Ex vivo של רקמת המעי הגס של עכברים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק טרנסגני, המוזנים בביציות E. coli PCFP מדגימה את נוכחותם של החיידקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בתוך קריפטות המעי הגס ליד תאי האפיתל של המעי וממוקמים במשותף עם פגוציטים במעי המארח.
בבעלי חיים אדומים OT-II, תאי T חיוביים ל-CD4 מאופיינים בביטוי משותף של חלבון פלואורסצנטי אדום ו-V בטא חמש נקודה אחת. כאשר מאותגרים עם ביציות e. coli PCFP, עכברים טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק חסר לימפוציטים BNT שהושתלו באימוץ עם תאי T חיוביים CD4 חיוביים לליגנד CD62 OT-II מאבדים במהירות את משקל הגוף ומפתחים סימנים קליניים של קוליטיס.
שבעה ימים לאחר העברת התאים, רק כמה פגוציטים מארחים דגמו ביציות e. coli PCFP ותאים חיוביים אדומים OT-II אינם מזוהים. 14 יום לאחר העברת התאים, פגוציטים מארחים שדגמו את ה-e.
ביציות קולי PCFP ממוקמות בסמיכות לתאים האדומים החיוביים OT-II המועברים באימוץ. עד 21 יום לאחר העברת התאים, מספר גבוה של תאים מארחים דגמו את ביציות ה-e. coli PCFP והתאים האדומים החיוביים OT-II התורמים, הנמצאים מפוזרים ברחבי הלמינה פרופריה של המעי הגס, נמצאים במגע הדוק עם פגוציטים במעי המארח.
כאשר שולטים בה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צביעה של לימפוציטים במעי וניתוח ציטוקינים בסרום כדי לענות על שאלות נוספות לגבי מצב ההפעלה של תאי CD4 T ולאשר את חומרת הקוליטיס. לאחר כל פיתוח, טכניקה זו סוללת את הדרך למחקר בתחום ובאימונולוגיה כדי לחקור את האירועים הקטנים המובילים למחלות מעי דלקתיות במודל העכבר.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי חיסון של למינה פרופריה במעי הגס לניתוח ex vivo במורד הזרם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מחקר זה משתמש במודל קוליטיס המונע על ידי אנטיגן כדי לחקור את האינטראקציות בין פגוציטים מונונוקלאריים חיוביים CX3, CR1 ותאי T חיוביים ל-CD4. המודל מאפשר ניטור של אירועים חיסוניים בלמינא פרופריה של המעי במהלך התפתחות המחלה.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- מחלת מעי דלקתית
- אינטראקציות תאיות
רקע
- הבנת תפקידם של פגוציטים מונונוקלאריים בהפעלת תאי T.
- חקירת אינטראקציות תאי חיסון בלמינא פרופריה של המעי הגס.
- חקירת מנגנונים פתוגניים במחלת מעי דלקתית.
- שימוש בחלבונים פלואורסצנטיים למעקב אחר תגובות חיסוניות.
מטרת המחקר
- לקבוע את האינטראקציה בין פגוציטים מונונוקלאריים ותאי T מסוג CD4.
- להעריך את התרחבות תאי T אפקטורים בלמינא פרופריה של המעי.
- לספק תובנות לגבי מנגנוני מחלת מעי דלקתית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- העברה אדפטיבית של תאי T CD4+ OT-II לעכברים RAG -/-.
- שימוש בחלבונים פלואורסצנטיים לסימון תאי חיסון.
- נתינה דרך הפה של E.coli המבטא אוואלבומין מותמר ל-CFP.
- מעקב אחר אירועים חיסוניים בשלבי מחלה שונים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי אינטראקציות בין פגוציטים מונונוקלאריים לתאי T.
- עדות להתרחבות תאי T אפקטורים בלמינא פרופריה של המעי.
- תובנות לגבי הפתוגניות של מחלת מעי דלקתית.
- הוכחת התועלת של מודל הקוליטיס להעברת תאי T.
מסקנות
- המחקר מדגיש אינטראקציות קריטיות בתגובה החיסונית במהלך קוליטיס.
- הממצאים תורמים להבנת מנגנוני מחלת מעי דלקתית.
- המודל מספק מסגרת למחקרים עתידיים בתחום האימונולוגיה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This antigen-driven colitis model enables mechanistic interrogation of antigen-presenting cell and T cell interactions in a defined immunological context, supporting target validation in inflammatory bowel disease research. By providing a reproducible system to study pathogenic immune cell crosstalk in the lamina propria, it enhances predictive confidence in preclinical de-risking of immunomodulatory candidates. The model aligns with early discovery workflows focused on pathway clarification and biological target engagement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding antigen-specific T cell activation by mononuclear phagocytes.
- Operational Value: Provides a defined antigen-driven system to clarify biological pathways involved in colitis pathogenesis.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by isolating effector T cell expansion events in intestinal tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems with fluorescently labeled immune cells for downstream ex vivo analysis.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of immune cell interactions and cytokine production in response to defined antigen exposure.
- Reproducibility: Standardized cell isolation and tissue processing support consistent immune event monitoring across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antigen-driven intestinal inflammation to study mechanisms relevant to subsets of inflammatory bowel disease.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase immune interaction data with preclinical validation of therapeutic candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates evaluation of target engagement and mechanistic effects prior to lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports early discovery biology by enabling hypothesis testing of antigen-presenting cell functions in T cell activation, positioning it before lead identification stages. It generates quantitative immune event data useful for analytics-driven comparison of experimental conditions in immunology screening. The system is designed as a reusable platform for studying immune-mediated pathways across multiple target validation campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification of antigen-specific immune responses in the gut.
- Screening: Delivers reproducible immune cell isolation and stimulation protocols for compound or modulator evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts such as interferon gamma production and immune cell localization for condition comparison.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to preclinical continuity through defined antigen-driven disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for studying APC-T cell interactions applicable to multiple immunology targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in immune cell interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined antigen challenge and cell transfer protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target-mediated biological effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on lamina propria immune event data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, flow cytometry, and fluorescent microscopy for immune cell isolation and analysis.
- Dependent on access to transgenic mouse models, fluorescent protein-expressing bacteria, and intestinal tissue processing equipment.
- Necessitates cross-team standardization of cell transfer timing, antigen dosing, and tissue harvest schedules.
- Adaptation considerations include model system compatibility with different antigen-specific T cell receptors and phagocyte markers.
- Practical limitations include the technical complexity of lamina propria cell isolation and the need for multi-day disease development monitoring.
