פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T
18 בספטמבר 2016
במודל קוליטיס מונע אנטיגן זה, תאי OT-II CD4+ T המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום הועברו באופן מאומץ לעכברי RAG-/- המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בפגוציטים חד-גרעיניים (MPS). המארחים אותגרו עם Escherichia coli (E.coli) המבטא את חלבון האובאלבומין (OVA) שהתמזג לחלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP).
המטרה הכוללת של מודל קוליטיס מוכוון-אנטיגן זה היא לקבוע האם פגוציטים חד-גרעיניים חיוביים ל-CX3 ו-CR1 מקיימים אינטראקציה עם תאי T חיוביים ל-CD4 ומפעילים אותם במהלך קוליטיס ספציפית לאנטיגן, והאם התרחבות תאי T אפקטורית זו, התלויה בפגוציטים חד-גרעיניים, מתרחשת בתוך הלמינה פרופריה (lamina propria) של המעי. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום מחלות מעי דלקתיות, כגון אילו סוגי אינטראקציות מתרחשים בין תאים מציגי אנטיגן לבין תאי T אפקטורים בלמינה פרופריה של המעי הגס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחקור את האינטראקציה בין תאי חיסון ואת הגורמים המובילים לפתוגניות של מחלות מעי דלקתיות.
שיטה זו משתמשת במודל קוליטיס של העברת תאי T, שבו תאי CD4 T נאיביים ספציפיים לאנטיגן עם פלואורסצנציה אדומה מועברים למארח עם חסר חיסוני, המבטא חלבון פלואורסצנציה ירוק בתאים חד-גרעיניים. לאחר העברת התאים מתבצעת הזנה פהית (oral gavage) של חיידקים המבטאים אנטיגן עם פלואורסצנציה כחולה. ניתן לנטר את האירועים החיסוניים המתרחשים ב-lamina propria של המעי במארחים בשלבים שונים של התפתחות המחלה.
השתמשו במספרי ניתוח כדי לפתוח את המעי הגס לאורכו ושטפו את הרקמה בצלחת פטרי המכילה 25 מיליליטר של PBS להסרת שאריות וריר. חתכו את המעי הגס לחתיכות של חמישה עד שמונה מילימטרים והניחו את המקטעים שהתקבלו ב-20 מיליליטר של DPBS טרי ללא סידן ומגנזיום, מועשר ב-10 מילימול HEPES ו-5 מילימול EDTA. ערבבו את המבחנה עם הדגימה ב-Vortex למשך 30 שניות במהירות מקסימלית.
לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך עשר דקות עם ניעור עדין להסרת האפיתליום. בתום הדגירה, בצעו שוב Vortex למשך 30 שניות. לאחר מכן, השליכו את supernatant המכיל את התאים האפיתליאליים.
העבירו את חתיכות הרקמה למבחנה חדשה המכילה 20 milliliters של תמיסת PBS, HEPES ו-EDTA רעננה, וחזרו על שלבי האינקובציה עם שלבי השCvortexing לפני ואחרי. לאחר החזרה השלישית, כל התאים האפיתליאליים יוסרו והנוזל העליון יהיה צלול. שטפו בעדינות את שברי הרקמה ב-PBS כדי להסיר תאים אפיתליאליים שנותרו.
חתוך את רגשויות הרקמה לחתיכות של שני על שני מילימטרים והעבר אותן לעיכול ב-10 מיליליטר של מצע RPI, בתוספת 0.5 מיליגרם למילליליטר של collagenase type eight ו-10 יחידות למילליליטר של DNAse one. ערבל את הדגימות במכשיר vortex למשך 30 שניות. לאחר מכן, הדגר את חתיכות הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך 30 עד 35 דקות, ובצע ערבול ב-vortex למבחנה בכל חמש דקות במהלך ההדגרה.
לאחר עיכול הרקמה, סננו את התמיחה המתקבלת דרך מסנן תאים של 70 micron אל תוך מבחנה קונית של 50 milliliter. שטפו את מסנן התאים פעם אחת והפרידו את תרחיף התאים הבודדים באמצעות צנטריפוגה. לבסוף, שטפו את התאים פעם אחת ב-PBS וסובבו בצנטריפוגה.
לאחר מכן, קבעו את מספר התאים החיוניים באמצעות הדחה של trypan blue. חיידק e. coli המייצר חלבון ovalbumin עם חלבון פלואורסצנטי כחול (Cyan fluorescent protein) מפעיל ייצור של interferon gamma בתאי OT-II in vitro, בניגוד ל-e.
חיידקי coli המבטאים CFP בלבד. הדמיה קונפוקלית תלת-ממדית ex vivo של רקמת המעי הגס של עכברים טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק, אשר הוכזנו עם e. coli PCFP ova, מדגימה את נוכחותם של החיידקים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי בתוך הקריפטות של המעי הגס, סמוך לתאי האפיתליה של המעי ובמיקום משותף עם פגוציטים של המעי של המארח.
בבעלי חיים מסוג OT-II אדומים, תאי T חיוביים ל-CD4 מאופיינים בביטוי משותף של חלבון פלואורסצנטי אדום ו-V beta 5.1. כאשר הם נחשפים ל-e. coli PCFP ova, עכברים טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק וחסרים לימפוציטים מסוג BNT, אשר הועברו להם באופן אדופטיבי תאי T חיוביים ל-CD4 וחיוביים ל-CD62 ligand מסוג OT-II אדום, מאבדים משקל גוף במהירות ומפתחים סימנים קליניים של קוליטיס.
שבעה ימים לאחר העברת התאים, רק מספר קטן של פגוציטים של המארח דגמו ביצי e. coli PCFP ותאי OT-II red positive אינם מזוהים. 14 ימים לאחר העברת התאים, פגוציטים של המארח שדגמו את ה-e.
חלבוני ה-ova של e. coli PCFP ממוקמים בקרבה רבה לתאי OT-II חיוביים לאדום שהועברו באופן אדופטיבי. עד ליום ה-21 לאחר העברת התאים, מספר רב של תאי מאחס דגמו את חלבוני ה-ova של e. coli PCFP, ותאי OT-II חיוביים לאדום מתורם, הנמצאים מפוזרים ברחבי ה-lamina propria של המעי הגס, נמצאים במגע הדוק עם הפגוציטים של המעי במאחס.
במידה ושולטים בטכניקה זו, ניתן להשלימה בארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון צביעה של לימפוציטים מעיים ואנליזה של ציטוקינים בסרום, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי מצב ההפעלה של תאי CD4 T ולהוכיח את חומרת הקוליטיס. לאחר כל פיתוח, טכניקה זו סוללת את הדרך למחקר בתחום האימונולוגיה כדי לחקור את האירועים המזעריים המובילים למחלה דלקתית של המעי במודל של עכברים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן בידולם של תאי מערכת החיסון מהלמינה פרופריה (lamina propria) של המעי הגס לצורך ניתוח ex vivo בהמשך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה עושה שימוש במודל קוליטיס המונע על ידי אנטיגן כדי לחקור את האינטראקציות בין פגוציטים מונונוקלאריים חיוביים ל-CX3 ו-CR1 לבין תאי T חיוביים ל-CD4. המודל מאפשר ניטור של אירועים חיסוניים בלמינה פרופריה של המעי במהלך התפתחות המחלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- מחלה דלקתית של המעיים
- אינטראקציות תאיות
רקע
- הבנת תפקידם של פגוציטים חד-גרעיניים בהפעלה של תאי T.
- בחינת אינטראקציות בין תאי מערכת החיסון ב-lamina propria של המעי הגס.
- חקירת מנגנונים פתוגניים במחלות מעי דלקתיות.
- שימוש בחלבונים פלואורסצנטיים למעקב אחר תגובות חיסוניות.
מטרת המחקר
- לקביעת האינטראקציה בין פגוציטים חד-גרעיניים לבין תאי CD4 T.
- להערכת ההתרחבות של תאי T אפקטורים בלאמינה פרופריה (lamina propria) של המעי.
- לספק תובנות לגבי המנגנונים של מחלות מעי דלקתיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- העברה אדופטיבית של תאי OT-II CD4 + T לעכברי RAG -/-.
- שימוש בחלבונים פלואורסצנטיים לסומון תאי מערכת החיסון.
- מתן E.coli המבטאת אובאלבומין המחובר ל-CFP באמצעות זריקה פורלית (Oral gavage).
- ניטור אירועי חיסון בשלבים שונים של המחלה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי אינטראקציות בין פגוציטים חד-גרעיניים לבין תאי T.
- ראיות להתרחבות של תאי T אפקטורים ב-lamina propria של המעי.
- תובנות לגבי הפתוגניות של מחלה דלקתית של המעי.
- הדגמה של התועלת במודל של קוליטיס המושרה על ידי העברת תאי T.
מסקנות
- המחקר מדגיש אינטראקציות קריטיות בתגובה החיסונית במהלך קוליטיס.
- הממצאים תורמים להבנת המנגנונים של מחלות דלקתיות של המעי.
- המודל מספק מסגרת למחקר עתידי באימונולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל קוליטיס זה, המונע על ידי אנטיגן, מאפשר בירור מכניסטי של אינטראקציות בין תאי מצגים לאנטיגן לבין תאי T בהקשר אימונולוגי מוגדר, ובכך תומך בתיקוף מטרות במחקר של מחלות דלקתיות של המעי. על ידי אספקת מערכת הניתנת לשחזור לבדיקת תקשורת בין תאי מערכת חיסון פתוגניים ב-lamina propria, הוא מגביר את הביטחון החזוי בהסרת סיכונים פרה-קלינית של מועמדים לאימונו-מודולציה. המודל עולה בקנה אחד עם תהליכי גילוי מוקדמים המתמקדים בהבהרת מסלולים ובמעורבות מטרות ביולוגיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הנוגעות להפעלה של תאי T ספציפיים לאנטיגן על ידי פגוציטים חד-גרעיניים.
- ערך תפעולי: מספק מערכת מוגדרת המונעת על ידי אנטיגן להבהרת מסלולים ביולוגיים המעורבים בפתוגנזה של קוליטיס.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד של אירועי התרחבות של תאי T אפקטורים ברקמה של המעיים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: יוצר מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף עם תאי חיסון מסומנים פלואורסצנטית לצורך אנליזה תומכת ex vivo.
- תוצרים כמותיים: מאפשר מדידה של אינטראקציות בין תאי חיסון וייצור ציטוקינים בתגובה לחשיפה לאנטיגן מוגדר.
- שחזוריות: בידוד תאים ועיבוד רקמות סטנדרטיים תומכים בניטור עקבי של אירועי חיסון לאורך חזרות ניסיוניות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה דלקת מעיים מונעת אנטיגנים כדי לחקור מנגנונים הרלוונטיים לתתי-סוגים של מחלות מעיים דלקתיות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין נתונים של אינטראקציות חיסוניות משלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני של מועמדים טיפוליים.
- החלטות מותאמות סיכון: מסייע בהערכת מעורבות המטרה (target engagement) והשפעות מכניסטיות לפני אופטימיזציה של המולקולה המובילה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה תומכת בביולוגיה של גילוי מוקדם על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקה של השערות בנוגע לתפקודי תאי תצוגה של אנטיגן (antigen-presenting cell) בהפעלה של תאי T, ובכך היא ממוקמת לפני שלבי זיהוי המולקולות המובילות (lead identification). היא מייצרת נתונים כמותיים על אירועים חיסוניים המועילים להשוואה מבוססת-אנליזה של תנאים ניסויים בסינון אימונולוגי. המערכת תוכננה כפלטפורמה רב-פעמית ללימוד מסלולים בתיווך מערכת החיסון במספר קמפיינים של תיקוף מטרות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים של תגובות חיסוניות ספציפיות לאנטיגן במעי.
- סריקה: מספק פרוטוקולים הדירים לבידוד והפעלת תאי מערכת החיסון לצורך הערכת תרכובות או מודולטורים.
- אנליטיקה: מספק מדדים מדידים, כגון ייצור interferon gamma ומיקום של תאי מערכת החיסון, לצורך השוואת מצבים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תובנות מכניסטיות להמשכיות פרה-קלינית באמצעות מידול מחלה מוגדר המונחה על ידי אנטיגנים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה סטנדרטית לחקר אינטראקציות בין תאי APC לתאי T, הישימה למספר מטרות אימונולוגיות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באינטראקציות בין תאי מערכת החיסון.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות פרוטוקולים מוגדרים של אתגר אנטיגני והעברת תאים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי התאמה להערכה מוקדמת של השפעות ביולוגיות המתווכות על ידי המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לאימונומודולציה בהתבסס על נתוני אירועי חיסון ב-lamina propria.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באימונולוגיה, ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך בידוד וניתוח של תאי מערכת החיסון.
- תלוי בגישה למודלים של עכברים טרנסגניים, חיידקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי וציוד לעיבוד רקמת מעי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של עיתוי העברת תאים, מינוני אנטיגן ולוחות זמנים לאספירת רקמות.
- שיקולי התאמה כוללים תאימות של מערכת המודל לקולטני T cells ספציפיים לאנטיגנים שונים ולסמני פגוציטים.
- מגבלות מעשיות כוללות את המורכבות הטכנית של בידוד תאי lamina propria ואת הצורך בניטור התפתחות המחלה לאורך מספר ימים.
