רצף הדור הבא לצורך זיהוי של מוטציות שניתן לפעול ב מוצק לנוזל גידולים

המטרה הכוללת של בדיקת Amplicon ממוקדת ריצוף מהדור הבא היא לזהות מוטציות פתוגניות בגידולי חולים לשימוש טיפולי, כולל אבחון, פרוגנוזה ותגובה לטיפול ממוקד. שיטה זו עונה על שאלות מפתח, כגון האם לחולה יש מוטציה בגן שיכולה להפיק תועלת מטיפול ממוקד או אלטרנטיבי. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שניתן לזהות מוטציות הניתנות לפעולה, שכיחות ונדירות כאחד, על פני גנים רבים בכל רקמת גידול באמצעות בדיקה אחת.

מכיוון שהטכניקות והטכנולוגיה כל כך מורכבות והשלבים כל כך קשים ללמידה, זה קריטי להדגים את השיטה הזו באופן ויזואלי. זהו רגע מכונן בקידום אונקולוגיה רפואית. עם אימוץ ריצוף הדור הבא במרפאה, יהיו לנו יותר טיפולי סרטן טובים יותר עבור המטופלים שלנו.

טכנולוגי ה-CPD שלנו, ברנט לי, פטריק קנדריאה, קרתיק גנפתי וג'ו גראב ידגימו הליך זה. אני גם אסייע בתהליך זה כדי להראות את החלקים המורכבים יותר של הבדיקה. לאחר חילוץ DNA גנומי על פי פרוטוקול הטקסט, בהתאם לפרוטוקול היצרן, הפעל שני מיקרוליטרים של ה-DNA המופק על פלואורומטר כדי לקבל את ריכוז העבודה של הדגימה.

כדי ליצור ספריית Amplicon, בצלחת חצאית למחצה של 96 בארות הנקראת Hyb Plate, הוסף את הנפח הדרוש של EDTA TE נמוך, חמישה מירקוליטרים של צינור האוליגו של הפאנל, הוסף 100 עד 250 ננוגרם של DNA גנומי לכל באר מתאימה. זהו הצעד החיוני ביותר, שכן לכל ערבוב כאן יהיו השלכות חמורות. לאחר הוספת ההיברידיזציה של Oligo לרצף מגיב 1, וסיבוב לפי פרוטוקול הטקסט, דגרו את לוחית ה-Hyb בחממת ההכלאה שחוממה מראש ב-95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.

לאחר קירור איטי של החממה ל -40 מעלות צלזיוס, הסר את הצלחת מהחממה והעביר את כל הנפח של כל דגימה מלוח ה- Hyb למרכז יחידת צלחת הסינון המתאימה שטופה מראש, או FPU. מכסים את ה- FPU, ואת הצנטריפוגה ב -2, 250 פעמים G ו -20 מעלות צלזיוס של שלוש דקות. לאחר מכן, הוסף 45 מיקרוליטר SW1, וצנטריפוגה שוב.

לאחר שטיפה שנייה עם SW1 ושטיפה עם UB1, הוסיפו 45 מיקרוליטר של Extension Ligation Mix 3 לכל דגימה היטב, וצנרו אותה למעלה ולמטה שלוש פעמים לערבוב. השתמש בנייר אלומיניום דביק כדי לאטום את הצלחת, ודגר את כל מכלול ה- FPU בחממה מראש של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. כדי להוסיף לאינדקס את ה-PCR Amplification, סדר את הפריימרים ב-Index Amplification Plate, או IAP Fixture, וחלק את האינדקסים המשמשים לבארות המתאימות בצלחת, ולאחר מכן הוסף 22 מיקרוליטר של PCR Master Mix, 2E12, וצנר אותו למעלה ולמטה שלוש פעמים.

לאחר מכן, לאחר סיבוב תגובת קשירת ההארכה של 45 דקות על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף 25 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד 50 מילי-מולרי לכל באר דגימה של ה-FPU, וצנר אותו למעלה ולמטה לפחות שש פעמים, כדי להבטיח שקצה הפיפטה יבוא במגע עם הממברנה. לאחר מכן, כשהצלחת מוטה מעט ופיפטה רב-ערוצית מוגדרת ל-20 מיקרוליטר, פיפטה את הנתרן הידרוקסיד בצלחת ה-FPU למעלה ולמטה לפחות שש פעמים. העבר את הפליטה מה-FPU לעמודה המתאימה של ה-IAP.

פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לשלב היטב את ה-DNA עם PCR Master Mix לפני הפעלת תוכנית ה-PCR המתוארת בפרוטוקול הטקסט. לאחר אימות תפוקת הספרייה ודגירה של הדגימות עם חרוזי טיהור מגנטיים על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף 30 מיקרוליטר של EBT לכל באר של חרוזים שטופים. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי להבטיח שהחרוזים יורדים מהצד של הצינור.

לאחר שהצלחת הודגרה עם ולאחר מכן ללא טלטול, הניחו את הצלחת על המעמד המגנטי והעבירו 20 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצלחת חדשה לגמרי הנקראת לוחית נורמליזציה של הספרייה, או LNP. לאחר הכנת תערובת הנורמליזציה, עם היפוך לסירוגין, ומערבולת של התמיסה, הוסף 45 מיקרוליטר לכל דגימה של ה-LNP. לאחר מכן, השתמש בסרט דבק שקוף כדי לאטום את הצלחת, ונער במהירות של 1,800 סל"ד למשך 30 דקות.

לאחר שטיפת החרוזים, הסר את ה-LNP מהמעמד המגנטי וכדי להוציא את הדגימה, הוסף 30 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד טרי 0.1 רגיל לכל באר. לאחר מכן, יש לנער את ה-LNP ב-1,800 RMP למשך חמש דקות. הנח את ה-LNP בחזרה על המעמד המגנטי, ולאחר פינוי ה-supernatant, העבר 30 מיקרוליטר של הפליטה למאגר אחסון נורמליזציה של ספרייה שהוכן קודם לכן בלוחית האחסון.

כופפו את הצלחת, ולאחר מכן הוסיפו חמישה מיקרוליטר מכל דגימה לרצף לספריית אמפליקון מאוחדת, או PAL, צינור של 1.5 מיליליטר. בהתאם לכימיית הריצוף המשמשת, הוסף ארבעה עד 10 מיקרוליטר של ה-PAL ל-590 עד 596 מיקרוליטר של Buffer HT1. נקה וטען את תא הזרימה.

טען את הריאגנטים. בנוסף, עקוב אחר ההנחיות שעל המסך כדי להתחיל את ריצת הרצף. לאחר השלמת ריצת הרצף, הפעל את צינור הביואינפומטיקה.

נתח את סטטיסטיקת הריצה כדי לוודא שספריית הרצף עברה את מדדי בקרת האיכות שנקבעו על ידי המעבדה. לבסוף, במציג נתונים גנומיים, סקור ידנית כל וריאנט על ידי צפייה בקבצי ה-BAM. זהו סיכום של סטטיסטיקת הריצה החשובה ביותר, לא כולל הכיסוי הממוצע, המשמש כדי לקבוע אם דגימת הכנה לספרייה עברה QC.As שנראה כאן עבור מקרה ראשון, ביואינפורמטיקה זיהתה ארבע מוטציות הקשורות ל-AML הניתנות לדיווח.

חובה שגויה ב-FLT3, מוטציה שגויה ב-IDH2 ומוטציה בשינוי מסגרת ב-NPM1. מוטציות ב-FLT3 נצפות בכ-25% מהחולים הבוגרים עם AML. למשמעות הפרוגנוסטית של מוטציות בנקודת התחום של FLT3 Kinase, כפי שניתן לראות בחולה AML זה, יש השפעה לא ברורה על הפרוגנוזה.

איזוציטראט דהידרוגנאז 2, או IDH2, מקודד שינוי אפיגנטי שבדרך כלל עובר מוטציה ב-AML. מוטציות בגן של נוקלאופוסמין, או NPM1, הן אחת המוטציות הנרכשות הנפוצות ביותר ב-AML. טבלה זו מפרטת את כל הגרסאות האקסוניות עבור מקרה שני.

זוהו שתי מוטציות הקשורות למחלה. הכנסה בתוך המסגרת באקסון 20 של ERBB2, ומוטציה שגויה ב-TP53. HER2/neu, או ERBB2, מקודד קולטן טירוזין קינאז.

הפעלת החדרות HER2/neu Exon 20 נצפות בשניים עד 4% מהאדנוקרצינומות של הריאות ומהוות את רוב המוטציות HER2/neu שנצפו בסרטן הריאות. שינויים ב-TP53 שכיחים גם בסרטן. יש לשים לב היטב לאיכות ולכמות ה- DNA המופק.

זה חשוב במיוחד עבור דגימות FFPE. אנו מנסים לעתים קרובות מושפל מאוד עם משתנה תפוקת ה-DNA. במהלך תהליך האימות של הבדיקה הקלינית, יש לקבוע מדדים לאיכות וכמות ה-DNA לכל דגימה לפני קידום ה-DNA להכנת הספרייה.

בנוסף להכנת הספרייה, קריטי לאמת תוכנית ריגול ביואינפומטית, על ידי קביעת ערכי חיתוך לריצוף, סטטיסטיקות בקרת איכות, סטטיסטיקות הכנת ספרייה, עומק האומץ של Amplicon ותדירות האלל המינימלית הניתנת לדיווח. לאחר השליטה, ניתן לבצע את הכנת הספרייה ביום עבודה. אבל, זרימת העבודה הכוללת של הבדיקה דורשת יותר זמן לחילוץ DNA, ריצוף, עיבוד נתונים וסקירת וריאנטים.

הליך זה נועד להסתכל רק על מוטציות ה-DNA הגנומיות בנקודות מפתח מסוימות. ניתן לבצע מסות אחרות המשתמשות ב-RNA כדי לענות על שאלות נוספות כמו ביטוי דיפרנציאלי של גנים, לשייך את גידולי הסיכון והסידורים המבניים מחדש. התקדמות משמעותית נראית באופק.

אימוץ האוטומציה ושילוב ברקוד מולקולרי ייחודי יאפשרו למעבדות להפחית את זמן האספקה, להשתמש בפחות קלט דגימה ולזהות וריאנטים בתדר אלל נמוך מאוד. איתור מוטציות הקשורות למחלה בדגימות סרטן היה סטנדרט הטיפול במשך עשרות שנים. NGS היא גישה פחות מוטה לריצוף גנים מרובים הקשורים לסוגי סרטן רבים במקביל, מה שמוביל לזיהוי מוטציות מרובות וטיפולים טובים יותר לחולים.

תודה על הצפייה, ובהצלחה בניסויים שלך.