רצף הדור הבא לצורך זיהוי של מוטציות שניתן לפעול ב מוצק לנוזל גידולים
20 בספטמבר 2016
כתב יד זה מתאר פרוטוקולים קליניים עבור שני לוחות ריצוף מהדור הבא. פאנל אחד חוקר ממאירויות המטולוגיות ואילו הפאנל השני מתמקד בגנים שעברו מוטציה בדרך כלל בגידולים מוצקים. סיווג מולקולרי של מוטציות מניעות בגידולים ממאירים אנושיים מציע מידע פרוגנוסטי וחיזוי רב ערך.
המטרה הכוללת של בדיקת Amplicon ממוקדת ריצוף מהדור הבא היא לזהות מוטציות פתוגניות בגידולי חולים לשימוש טיפולי, כולל אבחון, פרוגנוזה ותגובה לטיפול ממוקד. שיטה זו עונה על שאלות מפתח, כגון האם לחולה יש מוטציה בגן שיכולה להפיק תועלת מטיפול ממוקד או אלטרנטיבי. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שניתן לזהות מוטציות הניתנות לפעולה, שכיחות ונדירות כאחד, על פני גנים רבים בכל רקמת גידול באמצעות בדיקה אחת.
מכיוון שהטכניקות והטכנולוגיה כל כך מורכבות והשלבים כל כך קשים ללמידה, זה קריטי להדגים את השיטה הזו באופן ויזואלי. זהו רגע מכונן בקידום אונקולוגיה רפואית. עם אימוץ ריצוף הדור הבא במרפאה, יהיו לנו יותר טיפולי סרטן טובים יותר עבור המטופלים שלנו.
טכנולוגי ה-CPD שלנו, ברנט לי, פטריק קנדריאה, קרתיק גנפתי וג'ו גראב ידגימו הליך זה. אני גם אסייע בתהליך זה כדי להראות את החלקים המורכבים יותר של הבדיקה. לאחר חילוץ DNA גנומי על פי פרוטוקול הטקסט, בהתאם לפרוטוקול היצרן, הפעל שני מיקרוליטרים של ה-DNA המופק על פלואורומטר כדי לקבל את ריכוז העבודה של הדגימה.
כדי ליצור ספריית Amplicon, בצלחת חצאית למחצה של 96 בארות הנקראת Hyb Plate, הוסף את הנפח הדרוש של EDTA TE נמוך, חמישה מירקוליטרים של צינור האוליגו של הפאנל, הוסף 100 עד 250 ננוגרם של DNA גנומי לכל באר מתאימה. זהו הצעד החיוני ביותר, שכן לכל ערבוב כאן יהיו השלכות חמורות. לאחר הוספת ההיברידיזציה של Oligo לרצף מגיב 1, וסיבוב לפי פרוטוקול הטקסט, דגרו את לוחית ה-Hyb בחממת ההכלאה שחוממה מראש ב-95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
לאחר קירור איטי של החממה ל -40 מעלות צלזיוס, הסר את הצלחת מהחממה והעביר את כל הנפח של כל דגימה מלוח ה- Hyb למרכז יחידת צלחת הסינון המתאימה שטופה מראש, או FPU. מכסים את ה- FPU, ואת הצנטריפוגה ב -2, 250 פעמים G ו -20 מעלות צלזיוס של שלוש דקות. לאחר מכן, הוסף 45 מיקרוליטר SW1, וצנטריפוגה שוב.
לאחר שטיפה שנייה עם SW1 ושטיפה עם UB1, הוסיפו 45 מיקרוליטר של Extension Ligation Mix 3 לכל דגימה היטב, וצנרו אותה למעלה ולמטה שלוש פעמים לערבוב. השתמש בנייר אלומיניום דביק כדי לאטום את הצלחת, ודגר את כל מכלול ה- FPU בחממה מראש של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. כדי להוסיף לאינדקס את ה-PCR Amplification, סדר את הפריימרים ב-Index Amplification Plate, או IAP Fixture, וחלק את האינדקסים המשמשים לבארות המתאימות בצלחת, ולאחר מכן הוסף 22 מיקרוליטר של PCR Master Mix, 2E12, וצנר אותו למעלה ולמטה שלוש פעמים.
לאחר מכן, לאחר סיבוב תגובת קשירת ההארכה של 45 דקות על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף 25 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד 50 מילי-מולרי לכל באר דגימה של ה-FPU, וצנר אותו למעלה ולמטה לפחות שש פעמים, כדי להבטיח שקצה הפיפטה יבוא במגע עם הממברנה. לאחר מכן, כשהצלחת מוטה מעט ופיפטה רב-ערוצית מוגדרת ל-20 מיקרוליטר, פיפטה את הנתרן הידרוקסיד בצלחת ה-FPU למעלה ולמטה לפחות שש פעמים. העבר את הפליטה מה-FPU לעמודה המתאימה של ה-IAP.
פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לשלב היטב את ה-DNA עם PCR Master Mix לפני הפעלת תוכנית ה-PCR המתוארת בפרוטוקול הטקסט. לאחר אימות תפוקת הספרייה ודגירה של הדגימות עם חרוזי טיהור מגנטיים על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף 30 מיקרוליטר של EBT לכל באר של חרוזים שטופים. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי להבטיח שהחרוזים יורדים מהצד של הצינור.
לאחר שהצלחת הודגרה עם ולאחר מכן ללא טלטול, הניחו את הצלחת על המעמד המגנטי והעבירו 20 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצלחת חדשה לגמרי הנקראת לוחית נורמליזציה של הספרייה, או LNP. לאחר הכנת תערובת הנורמליזציה, עם היפוך לסירוגין, ומערבולת של התמיסה, הוסף 45 מיקרוליטר לכל דגימה של ה-LNP. לאחר מכן, השתמש בסרט דבק שקוף כדי לאטום את הצלחת, ונער במהירות של 1,800 סל"ד למשך 30 דקות.
לאחר שטיפת החרוזים, הסר את ה-LNP מהמעמד המגנטי וכדי להוציא את הדגימה, הוסף 30 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד טרי 0.1 רגיל לכל באר. לאחר מכן, יש לנער את ה-LNP ב-1,800 RMP למשך חמש דקות. הנח את ה-LNP בחזרה על המעמד המגנטי, ולאחר פינוי ה-supernatant, העבר 30 מיקרוליטר של הפליטה למאגר אחסון נורמליזציה של ספרייה שהוכן קודם לכן בלוחית האחסון.
כופפו את הצלחת, ולאחר מכן הוסיפו חמישה מיקרוליטר מכל דגימה לרצף לספריית אמפליקון מאוחדת, או PAL, צינור של 1.5 מיליליטר. בהתאם לכימיית הריצוף המשמשת, הוסף ארבעה עד 10 מיקרוליטר של ה-PAL ל-590 עד 596 מיקרוליטר של Buffer HT1. נקה וטען את תא הזרימה.
טען את הריאגנטים. בנוסף, עקוב אחר ההנחיות שעל המסך כדי להתחיל את ריצת הרצף. לאחר השלמת ריצת הרצף, הפעל את צינור הביואינפומטיקה.
נתח את סטטיסטיקת הריצה כדי לוודא שספריית הרצף עברה את מדדי בקרת האיכות שנקבעו על ידי המעבדה. לבסוף, במציג נתונים גנומיים, סקור ידנית כל וריאנט על ידי צפייה בקבצי ה-BAM. זהו סיכום של סטטיסטיקת הריצה החשובה ביותר, לא כולל הכיסוי הממוצע, המשמש כדי לקבוע אם דגימת הכנה לספרייה עברה QC.As שנראה כאן עבור מקרה ראשון, ביואינפורמטיקה זיהתה ארבע מוטציות הקשורות ל-AML הניתנות לדיווח.
חובה שגויה ב-FLT3, מוטציה שגויה ב-IDH2 ומוטציה בשינוי מסגרת ב-NPM1. מוטציות ב-FLT3 נצפות בכ-25% מהחולים הבוגרים עם AML. למשמעות הפרוגנוסטית של מוטציות בנקודת התחום של FLT3 Kinase, כפי שניתן לראות בחולה AML זה, יש השפעה לא ברורה על הפרוגנוזה.
איזוציטראט דהידרוגנאז 2, או IDH2, מקודד שינוי אפיגנטי שבדרך כלל עובר מוטציה ב-AML. מוטציות בגן של נוקלאופוסמין, או NPM1, הן אחת המוטציות הנרכשות הנפוצות ביותר ב-AML. טבלה זו מפרטת את כל הגרסאות האקסוניות עבור מקרה שני.
זוהו שתי מוטציות הקשורות למחלה. הכנסה בתוך המסגרת באקסון 20 של ERBB2, ומוטציה שגויה ב-TP53. HER2/neu, או ERBB2, מקודד קולטן טירוזין קינאז.
הפעלת החדרות HER2/neu Exon 20 נצפות בשניים עד 4% מהאדנוקרצינומות של הריאות ומהוות את רוב המוטציות HER2/neu שנצפו בסרטן הריאות. שינויים ב-TP53 שכיחים גם בסרטן. יש לשים לב היטב לאיכות ולכמות ה- DNA המופק.
זה חשוב במיוחד עבור דגימות FFPE. אנו מנסים לעתים קרובות מושפל מאוד עם משתנה תפוקת ה-DNA. במהלך תהליך האימות של הבדיקה הקלינית, יש לקבוע מדדים לאיכות וכמות ה-DNA לכל דגימה לפני קידום ה-DNA להכנת הספרייה.
בנוסף להכנת הספרייה, קריטי לאמת תוכנית ריגול ביואינפומטית, על ידי קביעת ערכי חיתוך לריצוף, סטטיסטיקות בקרת איכות, סטטיסטיקות הכנת ספרייה, עומק האומץ של Amplicon ותדירות האלל המינימלית הניתנת לדיווח. לאחר השליטה, ניתן לבצע את הכנת הספרייה ביום עבודה. אבל, זרימת העבודה הכוללת של הבדיקה דורשת יותר זמן לחילוץ DNA, ריצוף, עיבוד נתונים וסקירת וריאנטים.
הליך זה נועד להסתכל רק על מוטציות ה-DNA הגנומיות בנקודות מפתח מסוימות. ניתן לבצע מסות אחרות המשתמשות ב-RNA כדי לענות על שאלות נוספות כמו ביטוי דיפרנציאלי של גנים, לשייך את גידולי הסיכון והסידורים המבניים מחדש. התקדמות משמעותית נראית באופק.
אימוץ האוטומציה ושילוב ברקוד מולקולרי ייחודי יאפשרו למעבדות להפחית את זמן האספקה, להשתמש בפחות קלט דגימה ולזהות וריאנטים בתדר אלל נמוך מאוד. איתור מוטציות הקשורות למחלה בדגימות סרטן היה סטנדרט הטיפול במשך עשרות שנים. NGS היא גישה פחות מוטה לריצוף גנים מרובים הקשורים לסוגי סרטן רבים במקביל, מה שמוביל לזיהוי מוטציות מרובות וטיפולים טובים יותר לחולים.
תודה על הצפייה, ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה כללית
כתב יד זה מתאר פרוטוקולים קליניים עבור פאנלים של רצף גנומי מהדור הבא (Next-generation sequencing) המכוונים לממאירות המטולוגיות ולגידולים סולידיים. הסיווג המולקולרי של מוטציות מניעות מספק מידע פרוגנוסטי וחיזוי בעל ערך עבור הטיפול בסרטן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אונקולוגיה
- גנומיקה
- רפואה מותאמת אישית
רקע
- ריצוף מהדור הבא מאפשר זיהוי של מוטציות פתוגניות בגידולים.
- הבנת המוטציות יכולה להנחות החלטות טיפוליות.
- טכניקות מורכבות מחייבות הדגמות חזותיות ללמידה יעילה.
- התקדמות בטכנולוגיית הריצוף היא קריטית לשיפור טיפולים בסרטן.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקולים לזיהוי מוטציות בעלות משמעות טיפולית בחולי סרטן.
- שיפור היכולות האבחנתיות והפרוגנוסטיות בתחום האונקולוגיה.
- קידום השימוש בטיפולים ממוקדים המבוססים על מידע גנטי.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- מיצוי DNA גנומי מדגימות גידוליים.
- הכנת ספריות Amplicon באמצעות ריאגנטים ספציפיים.
- ביצוע פרוטוקולי הגברה ב-PCR וריצוף.
- ניתוח ביו-אינפורמטיקה להערכת תוצאות הריצוף וזיהוי וריאנטים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוטציות שניתן לדיווח הקשורות ללוקמיה מיאלואידית חריפה (AML).
- זיהוי מוטציות בגנים FLT3, IDH2 ו-NPM1.
- תובנות לגבי המשמעות הפרוגנוסטית של מוטציות אלו.
- הדגמה של יעילות השיטה בסביבות קליניות.
מסקנות
- ריצוף הדור הבא הוא כלי רב עוצמה לניתוח מוטציות בסרטן.
- מוטציות בעלות השפעה טיפולית יכולות להשפיע משמעותית על אסטרטגיות הטיפול.
- הדגמות חזותיות משפרות את ההבנה של מתודולוגיות מורכבות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
פאנלים של רצף דור הבא (NGS) עבור גידולים מוצקים ונוזליים מאפשרים זיהוי מקיף של מוטציות בעלות משמעות טיפולית, המנחים באופן ישיר אסטרטגיות טיפוליות והערכה פרוגנוסטית במסלולי עבודה אונקולוגיים. שילוב של זרימות עבודה חסונות של NGS עם בקרת איכות קפדנית ובדיקה ביו-אינפורמטית מגביר את הביטחון החזוי ותומך בהחלטות תיק ניסויים מותאמות סיכון. יכולות אלו הן קריטיות לקידום הרפואה המדויקת ולאופטימיזציה של הרצף התרגומי, מהשלב של הגילוי ועד ליישום קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר זיהוי סיסטמטי של מוטציות מניעות (driver mutations) לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות במודלים של סרטן.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת הנוף המוטציוני הרלוונטי להתקדמות המחלה.
- מסייע בתעדוף של היפותזות טיפוליות בהתבסס על שכיחות המוטציה והפתוגניות שלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פאנלים של מוטציות שעברו תיקוף לסריקה סטנדרטית של סוגי גידולים מגוונים.
- מבטיח הדירות ופלט כמותי באמצעות בקרות קפדניות לאיכות ושלמות ה-DNA.
- מאפשר זיהוי רב-ערוצי (multiplexed) וניתן להרחבה של וריאנטים נדירים ונפוצים במסלול עבודה יחיד.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את הפרופיל המולקולרי לסמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה לצורך רציפות במחקר תרגומי.
- תומכת בבחירת מודלים פרה-קליניים ובצמצום סיכונים מכניסטיים על בסיס סטטוס מוטציה בר-ביצוע.
- מספקת בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות שילוב נתונים גנומיים עם נקודות קצה קליניות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
זיהוי מוטציות מבוסס NGS מגשר בין תגליות מוקדמות, זיהוי מובילים (lead identification) ומחקר תרגומי, על ידי אספקת נתונים גנומיים ברמת ביטחון גבוהה לצורך קבלת החלטות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות והבהרה של מסלולים באמצעות פרופיל מוטציות מקיף.
- סריקה: מספקת זיהוי וריאנטים כמותי וניתן לשחזור עבור מוכנות של בדיקות והערכה בהמשך התהליך.
- אנליטיקה: מספקת זיהוי וריאנטים (variant calling) חסון, כימות תדירות אללים ומדדי QC עבור אנליזה השוואתית.
- מחקר תרגומי: מקשרת ממצאים מולקולריים למודלים של מחלה ואסטרטגיות של סמנים ביולוגיים כאשר הדבר נתמך על ידי נתוני מוטציות.
- שימוש חוזר בארגון: מכוננת זרימת עבודה של NGS הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להרחבה, הניתנת להתאמה לתיקי פוליס של אונקולוגיה המתפתחות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בבחירת המטרה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זיהוי מוטציות באמצעות פרוטוקולים הניתנים לשחזור ולהרחבה וצינורות ביואינפורמטיקה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשכה או הפסקה של פרויקטים (go/no-go) וניהול יעיל של תיק הנכסים מבחינת הון.
- השפעה על תיק הנכסים: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסים בתחום האונקולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות מקצועית בביולוגיה מולקולרית, ריצוף ואנליזה בביואינפורמטיקה.
- דורש מכשור באיכות גבוהה להפקת DNA, הכנת ספריות וריצוף.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדת בין צוותים של מדדי QC וספי סף לפרשנות של וריאנטים.
- חייבים להתאים את הפרוטוקולים לסוגי דגימות משתנים, במיוחד דגימות FFPE ודגימות בעלות תפוקה נמוכה.
- נסמך על צינורות עיבוד (pipelines) מאושרים בביואינפורמטיקה וערכי סף מוגדרים לצורך דיווח מהימן.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Genomic DNA Quality Control and Amplicon Library Preparation
3:23
Indexing and PCR Amplification
4:37
PCR Purification and Bead-based Normalization
6:33
Sequencing and Data Analysis
7:19
Results: Mutations Detected in Solid and Liquid Tumors Using Next Generation Sequencing
9:06
Conclusion
