אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר מערכת מקיפה לריצוף דגימות סרטן מאתגרות המשלבת ריאגנטים במעבדה רטובה, בקרות סטנדרטיות וחבילת ביואינפורמטיקה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסרטן, כגון כיצד לרצף ביופסיות גידול בכמות נמוכה ובאיכות נמוכה כדי להשיג ניתוחים ופרשנויות מדויקות של וריאנטים של DNA. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שדגימות שקשה לרצף הן אלה שפשוט יש להן כמויות DNA מוגבלות זמינות שניתן לנתח במהירות ובאמינות באמצעות ריאגנטים ובקרות ממקור יחיד ותוכנת ביואינפורמטיקה משולבת במלואה.

בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל המורכבות של NGS ממוקד, ששיטה זו מפשטת. עם זאת, ההליכים לכימות ספריות ואיגום דגימות דורשים תשומת לב מיוחדת כדי להשיג כיסוי אחיד בכל ספריות המדגם. פרוטוקול זה משלב תהליכי ספסל רטובים ויבשים לריצוף דגימות סרטן מאתגרות.

השלב הראשון הוא כימות והסמכה של DNA כדי לקבוע את מספר עותקי תבנית ה-DNA שניתן להגביר על ידי PCR בזמן אמת. התחל את ההליך לכימות דגימה ובקרת איכות על ידי הכנת כמות מספקת של תערובת מאסטר בצינור מיקרוצנטריפוגה. השתמש בנפחים הבאים לכל דגימה, 5 מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2x, 0.5 מיקרוליטר תערובת בדיקה פריימר, 0.5 מיקרוליטר תערובת בדיקה פריימר עיכוב, 0.05 מיקרוליטר ROX ו-2.95 מיקרוליטר מדלל.

הוסף תשעה מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל באר של צלחת 96 באר. הוסף מיקרוליטר אחד של תקני ה-DNA בשכפול וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש פעמים. לאחר שווידאתם שדגימת חומצת הגרעין מעורבבת היטב, הוסיפו מיקרוליטר אחד מהדגימה לתערובת המאסטר וערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש פעמים.

הנח את הצלחת האטומה במערכת ה-PCR. בצע מחזורי PCR של 10 דקות ב-95 מעלות צלזיוס ולאחר מכן 40 מחזורים של 15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס ודקה אחת ב-60 מעלות צלזיוס. נתח את נתוני ה-qPCR על ידי יצירת עלילת רגרסיה ליניארית עבור כל אחד מתקני ה-DNA הכפולים.

ריכוז ה-DNA הלא ידוע במספר עותק פונקציונלי או ניתן להגברה למיקרוליטר מחושב לאחר מכן כמתואר בטקסט הפרוטוקול. השלב הבא לאחר כימות הדגימה ובקרת האיכות, הוא העשרת רצפי הנקודות החמות של הסרטן על ידי PCR מרובה צינור יחיד. גנים ספציפיים או gsPCR, יבוצעו להעשרה של 46 מיקומים ב-21 גנים סרטניים.

הכן כמות מספקת של תערובת מאסטר gsPCR בצינור מיקרוצנטריפוגה באמצעות הנפחים הבאים לדגימה, חמישה מיקרוליטר של תערובת מאסטר הגברה פי 2, ומיקרוליטר אחד של פאנל פריימר פאן-סרטני. יש לשים שישה מיקרוליטר של תערובת המאסטר gsPCR לכל באר של צלחת של 96 בארות. הוסף ארבעה מיקרוליטרים מכל דגימת חומצת גרעין לבארות בודדות.

מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש פעמים. כלול את הפקדים המתאימים. הנח את הצלחת האטומה בתרמו-סייקלר עבור מחזורי ה-PCR הבאים.

חמש דקות ב-95 מעלות צלזיוס. 15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס ואחריהם ארבע דקות ב-60 מעלות צלזיוס למשך שני מחזורים. 15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס ואחריהם ארבע דקות ב-72 מעלות צלזיוס למשך 23 מחזורים.

הארכה אחרונה של 10 דקות ב-72 מעלות צלזיוס, ולאחריה החזקה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר PCR ספציפי לגן, בצע 10 מחזורים של tag-PCR כדי לשלב מתאמים ספציפיים לפלטפורמה לתאימות לריצוף הדור הבא. הוסף 7.5 מיקרוליטר של תערובת מאסטר אינדקס 2x ו-5.5 מיקרוליטר של קוד אינדקס לבאר מוגדרת בצלחת של 96 בארות וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש פעמים.

פתח בזהירות את צלחת ה-gsPCR והוסף שני מיקרוליטר של מוצר gsPCR לצלחת החדשה עם תערובת המאסטר. הנח את הצלחת האטומה בתרמו-סייקלר למחזורי ה-PCR הבאים, חמש דקות ב-95 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב-55 מעלות צלזיוס, ודקה אחת ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 מחזורים, והארכה סופית של 10 דקות ב-72 מעלות צלזיוס. לאחר מכן החזקה בארבע מעלות צלזיוס.

בעקבות תג-PCR, טיהור הספרייה ובחירת הגודל מתבצעים באמצעות כימיה של חרוזים מגנטיים. התחל הליך זה על ידי הוספת 11 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים טהורים להכנה לבארות נפרדות של צלחת 96 בארות. פתח את צלחת ה-tag-PCR והוסף 10 מיקרוליטר של מוצר tag-PCR לחרוזים וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש פעמים.

דגרו על התערובת במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר. הניחו את צלחת 96 הבאר על מעמד מגנטי למשך ארבע דקות. כשצלחת 96 הבאר עדיין על המעמד, הסר והשליך את הסופרנטנט בעזרת פיפטה.

לאחר שטיפת החרוזים פעמיים עם מאגר כביסה המכיל אתנול כמתואר בטקסט הפרוטוקול, יבש את החרוזים במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הסר את הצלחת מהמעמד. השעו מחדש את החרוזים על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של מאגר פליטה לכל באר ופיפטינג למעלה ולמטה חמש פעמים. דוגרים שתי דקות בטמפרטורת החדר.

הנח את צלחת 96 הבארות בחזרה על המעמד המגנטי למשך ארבע דקות והסר בזהירות והעביר 18 מיקרוליטר של הסופרנטנט השקוף לבאר בצלחת חדשה של 96 בארות. השלב הבא בפרוטוקול זה הוא כימות של כל ספריית דגימות מטוהרות על ידי PCR תחרותי יחסית בזמן אמת. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו כמות מספקת של תערובת המאסטר LQ בצינור מיקרוצנטריפוגה באמצעות הנפחים הבאים לכל דגימה, חמישה מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2x LQ, שני מיקרוליטר של תערובת בדיקה פריימר LQ, 0.5 מיקרוליטר של תקן LQ ו-0.5 מיקרוליטר של LQ ROX.

הוסף 8 מיקרוליטר מתערובת המאסטר LQ לבאר של צלחת אופטית של 96 בארות. בבארות נפרדות, הוסף שני מיקרוליטר של דילול סדרתי של הספרייה, שני מיקרוליטר של בקרה חיובית LQ ושני מיקרוליטר של מדלל LQ וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש פעמים. הכנס את הצלחת האטומה למערכת ה-PCR והקצה גלאי FAM ו-VIC עבור כל דגימה.

בצע הגברת PCR באמצעות תנאי הרכיבה הבאים, חמש דקות ב-95 מעלות צלזיוס, ו-15 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן דקה אחת ב-60 מעלות צלזיוס למשך 40 מחזורים. לאחר מכן מחושב הריכוז של כל דגימה כמתואר בטקסט הפרוטוקול. לאחר כימות הספרייה, כל ספריית דגימות מנורמלת על סמך הריכוז הנמדד שלה ונאגדת לצינור יחיד לריצוף.

מודול ניתוח פשוט משמש כדי להקל על החישובים לנורמליזציה של ספריות ואיגום דגימות. כדי לנרמל את הספרייה, קבע תחילה את הריכוז החציוני בננו-מולרי על פני כל הדגימות שכל אחת מהן מכילה אינדקס זוגי ייחודי שיש לאגד. לאחר מכן, קבע את נפח הדגימה הבודד במיקרוליטר לאגירה על ידי הכפלת הריכוז החציוני על פני כל הדגימות בחמש, ולאחר מכן חלוקה בריכוז האישי שלו.

הוסף את הנפח המנורמל עבור כל דגימה לצינור מיקרו-צנטריפוגה יחיד כדי ליצור את מאגר הדגימות. לדלל את מאגר הדגימה ל-1.25 ננו-מולרי באמצעות מדלל ריצוף. הכן את מאגר הדוגמאות לריצוף על ידי דנטורציה שלו בנוכחות בקרת phix V3. שלב את הדברים הבאים, 15 מיקרוליטר של מאגר דגימות של 1.25 ננו-מולרי, שלושה מיקרוליטרים של 0.5 ננו-מולרי פיקס ושני מיקרוליטרים של 1N נתרן הידרוקסיד.

לאחר מערבולת קצרה וצנטריפוגה, יש לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 8 מיקרוליטר מהספרייה המפורקת ל-992 מיקרוליטר של מאגר HT1 גבוה מקורר מראש בצינור מיקרו-צנטריפוגה. הוסף 600 מיקרוליטר מהספרייה המפורקת והמדוללת למיקום מספר 17 של מחסנית הריאגנט.

בצינורות מיקרו-צנטריפוגה, יש לדלל בנפרד ארבעה מיקרוליטר מכל פריימר ריצוף עם 636 מיקרוליטר של מאגר HT1 גבוה. הוסף 600 מיקרוליטר של פריימרים מדוללים לריצוף read-1 למיקום מספר 18 של מחסנית ריאגנט הרצף. 600 מיקרוליטר של פריימרים מדוללים לקריאת אינדקס למיקום מספר 19 ו-600 מיקרוליטר של פריימרים מדוללים לריצוף read-2 למיקום מספר 20.

טען את הריאגנטים על מכשיר הריצוף של הדור הבא ובצע קצה מזווג, ריצוף שניים על 150 מחזורים על פי הוראות היצרן. לבסוף נתח את נתוני הריצוף באמצעות תוכנת הביואינפורמטיקה הנלווית. ניתן היה לעבד בסך הכל 90 דגימות בריצת NGS אחת באמצעות רצף ספסל.

עבור מערך הנתונים המוצג, הדגימות כללו קו תאים, שיורי פרפין קליני רשמי וקבוע משובץ, או FFPE, ו-DNA תבנית סינתטי והביאו לריצוף עומק גבוה וכיסוי אחיד. חריגים לא היו מורכבים מבקרות תבנית, סדרת דילול של DNA קו תא אחד עם הגברה של מספר עותקים גדול, ו-DNA FFPE אחד שסומן לעיכוב PCR על ידי בדיקת QC מבוססת qPCR פרה-אנליטית. אחידות הכיסוי על פני 46 האמפליקונים נשמרה באמצעות שלושה מפעילים שונים ועבור דגימות DNA שונות באיכות נמוכה של FFPE.

בתערובת בקרת DNA של גידול FFPE המורכבת ממוטציה ידועה של 5% BRAF V600E דווח על מוטציית BRAF היעד בשכיחות ממוצעת של 5.2 פלוס מינוס 1.3 אחוז על ידי שלושה מפעילים באמצעות קלט של 400 עותקים הניתנים להגברה. דילולים של דגימות DNA של קו תאים ו-FFPE עם הגברת מספר עותקים שהודגמו עושים תלות בהגברה של EGFR ו-KRAS. באופן בלתי צפוי, ניתן להפחית את קלט ה-DNA של FFPE ל-50 עותקים הניתנים להגברה או 1.2 ננוגרם של DNA בתפזורת.

תוך שמירה על איתור מוטציות ידועות ללא קריאות חיוביות כוזבות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 11 שעות עם כשלוש וחצי שעות של ידיים בזמן עבור גודל אצווה של 24 דגימות בכל פעם, אם היא מבוצעת כראוי.