אירידיום (III) פלורסנט בדיקה לאיתור של חלבון המלריה ביומרקר היסטידין העשיר החלבון-II

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות נוכחות של סמן ביולוגי של חלבון מלאל עשיר בהיסטידין בדגימה באמצעות בדיקת אירידיום זרחנית. זה מושג על ידי סינתזה ראשונה של קומפלקס אירידיום מתילציה של ציקלון. לאחר פיצול מהיר של גשר כלוריד של קומפלקס הדימר האב, ניתן לבודד ולטהר את קומפלקס האירידיום שעבר מתילציה של ציקלו על ידי שימוש בבדיקה.

השלב השני הוא לאמת את האינטראקציות של הגשושית עם חומצות אמינו שונות כדי להבטיח את הספציפיות שלה. עבור היסטמין בלבד, האות הזרחני מופעל רק בנוכחות היסטמין ונצפה על ידי זוהר. ספקטרוסקופיה. לאחר מכן, כהוכחת רעיון, בדיקת האירידיום עוברת טיטרציה עם חיקוי פפטיד של הסמן הביולוגי של המלריה, חלבון עשיר בהיסטידין 2, כדי לקבוע את גבולות הזיהוי בתמיסה.

בנוסף, הקינטיקה של האינטראקציה של הגשושית עם הפפטיד מובהרת באמצעות אינטרפרומטריית שכבה ביולוגית. השלב האחרון הוא לשתק חלבון עשיר בהיסטידין רקומביננטי על פני החלקיקים המגנטיים של ניקל NTA ולהעריך את גבול הזיהוי של החלבון באמצעות הבדיקה. בסופו של דבר, לומינס וספקטרוסקופיה משמשים כדי להראות כיצד ניתן לזהות חלבונים על פני השטח של תומך מוצק באמצעות סוג חדש של בדיקות אירידיום זרחניות.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תיוג חלבונים פלואורסצנטיים ובדיקות חיסוניות, הם שהבדיקה חזקה. יש לו קינטיקה אסוציאטיבית מהירה, והוא אינו רגיש לפוטוהלבנה. בנוסף, טכניקה זו אינה דורשת זמן רב כמו בדיקות חיסוניות.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון זיהום במלריה? הסיבה לכך היא תכולת ההיסטידין הגבוהה של הסמן הביולוגי של החלבון לזיהום פלסמודיום SRO הנקרא חלבון עשיר בהיסטדין 2. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כששמנו לב שפורסם מאמר שהשתמש בבדיקת אירידיום עם מתילציה של ציקלו כדי לצבוע תאים חיים.

במאמר זה הם ציינו כי הגשושית נכנסה לתא החי והאירה את הגרעינים על ידי קשירה לחלבונים העשירים שנראו לו. בהתחשב בטבעו של הסמן הביולוגי המאלאי, החלבון העשיר בסין 2 שלו, החלטנו להשתמש בבדיקה זו כדי לזהות את החלבון המעניין שלנו. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית בשל מורכבות הבדיקה ושלבי השטיפה וההעברה הרבים הדרושים לאיתור חלבון מטרה זה על החלקיק כדי להתחיל את הדרך החוצה, 53.6 מיליגרם של דימר אירידיום האב ולהתמוסס בחמישה מיליליטר של מתילן כלוריד.

הוסף פתרון זה לבקבוק לומי בנפח 50 מיליליטר המצויד בסרגל כוכבים. לאחר מכן שוקלים 26.2 מיליגרם FL כסף וממיסים בחמישה מיליליטר מתנול. מוסיפים את ה-FL הכסוף המומס לתמיסת דימר האירידיום האב ומערבבים במשך שעה.

תרחיץ בצבע שמנת אמור להיווצר לאחר שעה, לסנן את התרחיץ דרך סיליקה ג'ל לתוך מסנן. בקבוק מעביר את המוצר המסונן לבקבוקון DRAM בגודל 25 על 95 מילימטר מתאדה מהממס שנותר באמצעות מאייד סיבובי למשך חמש עד 10 דקות. לאחר הסרת רוב הממס, בדוק שנותרו שאריות צהובות שמנוניות בבקבוקון.

לשאריות אלה, הוסף מיליליטר אחד של מתנול למוצר. השבת את ize למשך יום עד יומיים כדי להניב מוצק צהוב ולאפיין את המוצר כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לחקור את האינטראקציות של בדיקת האירידיום עם חומצות אמינו שונות. פיפטה 100 מיקרוליטר מכל תמיסת חומצת אמינו לצלחת שחורה של 96 בארות.

הוסף 100 מיקרוליטר של מי מלח או HBS לצלחת כדי לשמש כריק. לאחר מכן הוסף 2.5 מיקרוליטר מתמיסת בדיקת האירידיום המוכנה של שני מילי-מולרית לכל דגימה ונער את הצלחת על שייקר צלחת למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, רכשו את ספקטרום הפליטה של הדגימות באמצעות קורא צלחות 96 בארות.

לשם כך, הנח את הצלחת במכשיר ופתח את תוכנת קורא הלוחות כדי להגדיר ניסוי חדש. לאחר מכן, העבירו את הדגימות לצלחת שקופה של 96 בארות ודמו את הפליטה באמצעות מאיר טרנס UV כדי לבצע טיטרציה של בדיקת האירידיום עם חיקוי הפפטיד המסועף של הסמן הביולוגי למלריה, חלבון עשיר בהיסטמין שני BNT שתיים. ראשית הכינו תמיסת מלאי מילי-טוחנת אחת של BNT 2 ב-HBS.

לאחר מכן יש לדלל באופן סדרתי את תמיסת BN T two כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 100 מיקרוליטר מכל דילול בשלוש פעמים כאשר HBS משמש כריק לבארות של צלחת של 96 בארות לכל דגימה, הוסף 2.5 מיקרוליטר של בדיקת אירידיום של שני מילי-מולריות. נענע את הצלחת במשך 10 דקות על שייקר צלחת לאחר הטלטול, קרא את עוצמת הפליטה ב-510 ננומטר באמצעות קורא צלחות 96 בארות.

לבסוף, העבירו את הדגימות לצלחת ברורה של 96 בארות ותמונה של הטיטרציה באמצעות תאורת טרנס UV לביצוע ניתוח קינטי בזמן אמת באמצעות אינטרפרומטריית שכבה ביולוגית. ראשית, הוסף 200 מיקרוליטר של חיץ קינטי לשמונה בארות בעמודה הראשונה של צלחת שחורה של 96 בארות. לאחר הכנסת הצלחת למחזיק חיישן הפלסטיק, העבירו בזהירות שמונה חיישנים ביולוגיים של ניקל לעמודה הראשונה במחזיק הפלסטיק כך שהקצות תלויים בבארות החיץ.

לאחר מכן החכירו את מחזיק הפלסטיק בצד שמאל של מכשיר האינטרפרומטריה לפיפטה שחורה חדשה של 96 בארות, 200 מיקרוליטר KB לכל שמונה הבארות בעמודות 1 ו-3 באותה צלחת, אני מהמר על 200 מיקרוליטר של 0.5 מיקרו-מולר BNT שתי תמיסה לבארות בעמודה שתיים. ואז אני מהמר על 200 מיקרוליטר מכל דילול של בדיקת האירידיום לעמודה ארבע, החל מ-KB כריק בבאר A ארבע. הוסף את הדילולים כך שהבארות יגדילו את ריכוז בדיקת האירידיום במורד העמוד.

הנח צלחת זו במכשיר מימין לצלחת המכילה את חיישני ההרטבה המוקדמת בתוכנת האינטרפרומטריה של השכבה הביולוגית. הגדר ניסוי קינטי בסיסי על ידי הגדרת בדיקת הצלחת וקצות החיישן להגדרת הצלחת, הגדר עמודה על המסך לחץ לחיצה ימנית ובחר את ההגדרה המתאימה. עבור הבארות בחר חיץ.

עבור עמודות אחת ושלוש, טען עבור עמודה שתיים ודוגמה. עבור עמודה 4, הגדר את הבדיקה בכרטיסיה הבאה על-ידי לחיצה תחילה על הוסף שיווי משקל. 60 שניות טעינה 120 שניות.

אסוציאציה 120 שניות ודיסוציאציה 300 שניות. בחר את שלב שיווי המשקל ולחץ פעמיים על העמודה הראשונה. לאחר מכן בצע את אותו הדבר עבור טעינה לעמודה שתיים, קו בסיסי לעמודה שלוש, שיוך לעמודה ארבע ודיסוציאציה לעמודה שלוש.

לבסוף, בחר את חיישני הניקל NTA. ודא שהניסוי מתואר כהלכה. הוסף שם קובץ.

ודא שניסוי ההשהיה נבדק, ולחץ על go. לאחר השלמת הריצה הקינטית, עבד את הנתונים בתוכנת העיבוד המסופקת כדי לבצע זיהוי חרוזים של BNT 2 ו-HRP רקומביננטי 2 עם בדיקת האירידיום. הכן דילול סדרתי של BNT 2 ו-HRP רקומביננטי 2 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן iPet 100 מיקרוליטר מכל דילול משולש לצלחת לבנה של 96 בארות עם הדילול על מנת מהריכוז הנמוך ביותר לגבוה ביותר במורד פיפטה עמודה 10 מיקרוליטר של 50 מיקרון ניקל NTA חלקיקים מגנטיים עלו לכל דילול. ובכן, שימו לב שהחלקיקים המגנטיים נשארים תלויים בזמן הפיפטינג. אם הם מתחילים להתיישב מעורבבים על ידי פיפטה או על ידי מערבולת, הניחו את הצלחת על שייקר צלחת למשך 15 דקות כדי לדגור את הדגימות עם החלקיקים לאחר תקופת הדגירה הזו, הניחו את הצלחת על מגנט של 96 בארות והמתינו 30 שניות עד שהחלקיקים יישלפו מהתמיסה.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית, משוך את הדגימה המקורית והשליך כפסולת לאחר הוצאת הצלחת מהמגנט ב-200 מיקרוליטר HBS עם טווין או HBST לכל באר. בעזרת הפיפטה הרב-ערוצית, שאב את המאגר למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לשטוף את החלקיקים המגנטיים. בסס את הצלחת בחזרה על המגנט והמתן 30 שניות עד שהחלקיקים יישלפו מהתמיסה.

בעזרת הפיפטה הרב-ערוצית, משוך את 200 המיקרוליטר של המאגר והשליך כפסולת. הסר את הצלחת מהמגנט לפני שתחזור על שלבי הכביסה פעמיים כדי להשלים שלוש כביסות של החלקיקים. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של HBST לכל באר המכילה חלקיקים מגנטיים, ואחריהם 2.5 מיקרוליטר מתמיסת בדיקת האירידיום של שני מילי-מולריות.

דגרו את החלקיקים בעזרת בדיקת האירידיום על שייקר צלחת למשך שעה. אחרי שעה. קרא את עוצמת הפליטה ב-510 ננומטר באמצעות קורא צלחות 96 בארות.

לאחר הסינתזה והאפיון של בדיקת האירידיום המתיליציקלית, נבדקות חומצות אמינו שונות לתגובתיות עם הקומפלקס. רק היסטידין מעורר תגובת אות ביחידות פלואורסצנטיות יחסיות עם טיטרציה של הגשושית. עם שני היסטמין המכילים פפטידים בתמיסה, נצפית תגובה תלוית ריכוז.

ניתן לראות את התגובה הזו כאן תחת אור UV בפס רחב. אינטרפרומטריית שכבה ביולוגית לניתוח קינטי של ריכוזים שונים של בדיקת האירידיום הנקשרת ל-BNT 2 על פני ניקל. נ.ט. חיישן זכוכית מגלה כי בדיקת האירידיום היא זיקה מיקרומולרית, ההיסטידין המכיל פפטידים.

גבול הזיהוי של החלבון העשיר בהיסטידין באמצעות הגשושית היה דומה כאשר החלבון היה משותק על פני חלקיק מגנטי. כמו בתמיסה, ניתן לדמיין תיוג זה של החלבון על פני החלקיקים עצמם לאחר שליטה. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנקוט משנה זהירות במהלך שלבי הכביסה וההעברה עם החלקיקים הקשורים לחלבון המגנטי. שטיפת חלבון לא קשור חשובה לזיהוי נכון של P-F-H-R-P משותק שתיים, תכנון אלמנט זיהוי מולקולרי שיכוון ספציפית לחלבון הקשור באמצעות אינטראקציות אנטיגן נוגדנים. תוך כדי שימוש בבדיקת האירידיום החזקה תאפשר זיהוי רגיש וספציפי יותר של חלבונים הקשורים על פני החלקיקים לאחר התפתחותו.

לטכניקה זו יש פוטנציאל לסלול את הדרך לחוקרים בתחום האבחון לחקור שימוש בריאגנטים כאלה שהם חזקים לא רק לגילוי מלריה, אלא למחלות זיהומיות אחרות.