מערכות ביטוי חופשי הנייד מבוסס הלה לביטוי של Plasmodium Rhoptry חלבונים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לתרגם חלבוני פלסמודיום באמצעות מערכות ביטוי נטולות תאים מבוססות hela ולטהר את החלבונים מנפחי מיקרו של מוצר מתורגם. זה מושג על ידי שיבוט גנים של פלסמודיום להכנת פלסמידים רקומביננטיים לתרגום חוץ גופי של שני שלבים וצעד אחד, ביטוי נטול תאים של חלבוני עץ RT רקומביננטיים למלריה. כדי לתרגם את החלבונים הרקומביננטיים, הפלסמיד המוכן מודגר בתערובת שעתוק.

בעת שימוש במערכת הביטוי הדו-שלבית, המתמללת mRNA, ה-mRNA המתקבל מתווסף לאחר מכן לתמהיל התרגום לתרגום חלבון. תוך שימוש במערכת הביטוי החד-שלבית, הפלסמיד הרקומביננטי מודגר עם ליזאט תאי הלה לצורך שעתוק ותרגום של חלבונים רקומביננטיים. לאחר מכן מטוהרים חלבונים רקומביננטיים מנפחים זעירים של תוצר התרגום.

התוצאות מראות ביטוי וטיהור מוצלחים על סמך ניתוח כתמים מערביים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני אחרות, כמו מערכת ביטוי נבט החיטה ומערכת הליזאט של רשתית הארנב הוא שמערכת זו יכולה לבטא חלבונים תוך שלוש שעות. אין צורך באופטימיזציה של קידוד.

זה זול וקל לשימוש. ניתן לסנן אנטיגנים מרובים במיקרו-מערכים מה שמאפשר זיהוי אנטיגנים לטיפול ואבחון. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שמדובר בביטוי נטול תאים, המבטא חלבונים בנפחי מיקרו מה שמקשה מאוד על טיהור החלבון.

לראשונה היה לנו רעיון להשתמש במערכת זו מכיוון שלא יכולנו לפוצץ חלבוני ביטוי באמצעות אי קולי ומצאנו שמערכות ביטוי אחרות יקרות מדי וגוזלות זמן. החלטנו לחקור מערכת ביטוי נטולת תאים מבוססת הלה כמערכת חלופית. הכן 20 מיקרוליטר של תערובת שעתוק המכילה DNA וקטור פלסמיד רקומביננטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט לביטוי חלבון אנושי דו-שלבי במבחנה.

שימוש בתבניות DNA. מערבבים את הרכיבים בצינור מיקרו צנטריפוגה ודוגרים למשך 75 דקות בחום של 30 מעלות צלזיוס באמבט מים. לאחר מכן קחו שני מיקרוליטרים מתערובת השעתוק והוסיפו אותה ל-23 מיקרוליטר של תערובת תרגום המכילה ליזאט תאי הלה.

דוגרים את התערובת המתקבלת בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. אחסן את המוצרים המתורגמים במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו 25 מיקרוליטר מתערובת השעתוק והתרגום המכילה את וקטור הפלסמיד הרקומביננטי, DNA והוא ליזאט כמתואר בפרוטוקול הטקסט לביטוי חלבון תרגום אנושי בצעד אחד עבור תבניות DNA.

דגרו על תערובת תגובה זו למשך 90 דקות עד שש שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ואחסנו את תוצרי התרגום במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי לטהר את החלבונים הרקומביננטיים המתבטאים, הוסף 75 מיקרוליטר של מאגר טיהור X אחד ל-25 מיקרוליטר של מוצר תרגום כדי ליצור 100 מיקרוליטר של תערובת טיהור. שטפו את שרף הניקל פעמיים על ידי הוספת 300 מיקרוליטר מים מזוקקים ו-300 מיקרוליטר של מאגר הכריכה.

השעו מחדש את השרף והצנטריפוגה ב-14,000 גרם למשך דקה אחת כדי להסיר עודפי אתנול. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת הטיהור המוכנה ל -100 מיקרוליטר של שרף כלאט ניקל, ודגר את התערובת בקצה. יש לסיים את השייקר למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.

צנטריפוגה את התערובת ב-14,000 גרם למשך דקה אחת ואספו את הסופרנט לתוך צינור טרי שמסומן כזרימה. שוטפים את השרף עם 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה אחד, ואז צנטריפוגה ב-14,000 GS למשך דקה אחת ואוספים את הסופר בשם הסופר בשטיפה טרייה עם תווית. חזור על שלב זה פעמיים לאחר הכביסה.

הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר פליטה אחד לשרף ודגר על שייקר קצה למשך 15 דקות. ואז צנטריפוגה ב -14, 000 גרם למשך דקה אחת. בצע את הצעד האלוסיאני פעמיים בכל פעם.

אספו את הסופרנטנט לתוך שפופרת מיקרו צנטריפוגה טרייה וסמנו כ-eluate after ellucian. שוטפים את השרף פעמיים מבעבר ואז מאחסנים אותו בארבע מעלות צלזיוס. אחסן את הזרימה דרך שטיפות ודגימות פליטה במינוס 20 מעלות צלזיוס ומטה כדי לבצע כתמים מערביים.

ראשית, הכינו צינורות נפרדים של תמציות schon מ- P falsy parum e coli, ביטוי חלבוני R רקומביננטיים, החלבונים הרקומביננטיים המוכנים ומוצרי החלבון המטוהרים בשיטת הזיקה. לאחר מכן, הוסף מאגר דגימת אלקטרופורזה המכיל מרקפטואתנול לכל צינור לנפח סופי של 20 מיקרוליטר. כדי להכין דגימות חלבון מסיסות, הרתיחו את הצינורות למשך שתי דקות.

טען את דגימות החלבון המסיסות על ג'לים של 10% SDS כדי להפריד את החלבונים לאחר הפעלת הג'לים. העבירו את החלבונים המופרדים מג'לי הדף SDS לנייר ניטרוצלולוז על ידי אלקטרופורזה ב-35 מיליאמפר של זרם לג'ל בתא ספיגה מערבי יבש למחצה למשך שעתיים לאחר העברה וחסימה של נייר הניטרוצלולוזה עם חלב דל שומן 2%. דגרו את נייר הניטרוצלולוזה עם הנוגדנים הרב-שבטיים המפורטים בפרוטוקול הטקסט לבקרות שליליות.

כמו כן לדגור נייר ניטרוצלולוזה באחד עד 100 סרום עכבר וארנב רגיל מדולל ותרבית מבוזבזת בשם סופר משני תאי מיאלומה SB. לאחר הדגירה של נייר הניטרוצלולוזה בארבע מעלות צלזיוס נשטף למשך הלילה ארבע פעמים עם מאגר כתמים ודגירה עם נוגדנים משניים ספציפיים למין, מצומדים לפרוקסידאז צנון סוסים, מדולל 1 ל-1000 ב-2% חלב. לאחר מכן שטפו שוב את נייר הניטרוצלולוזה ארבע פעמים עם מאגר כתמים.

לבסוף דגרו את נייר הניטרוצלולוזה השטוף עם תמיסת פיתוח צבע, A פלוס B למשך 30 דקות בחושך, ביטוי מוצלח של חלבוני פלסמודיום באמצעות מערכות ביטוי ללא תאים אנושיים במבחנה אושר על ידי אנטיר ארנב ספציפי לעץ RT כפי שהוצג בעבר חלבונים רקומביננטיים שהובעו בעבר לא זוהו על ידי אנטיסרה נגד חלבוני טפילים vae מ- p FALs parem ו- P Yoi Lee, מדגים את הספציפיות של Rabbit Antisera 6 76 כנגד החלבונים המבוטאים. סרום ארנב רגיל לא הגיב עם חלבונים רקומביננטיים. תורגם באמצעות מערכת הביטוי הדו-שלבית ללא תאים אנושיים במבחנה ומערכת תרגום חד-שלבית משולבת במבחנה.

טיהור מוצלח של חלבונים מתורגמים מ-25 מיקרוליטר של מוצרי חלבון מתורגמים מוצג כאן. מוצג טיהור מוצלח במיוחד של החלבון הטרנסממברני השסוע של מארה. מוצג גם טיהור מוצלח של חלבון היפותטי מחלבון עץ פלסמודיום RT המקודד גנים.

לבסוף, מוצג טיהור מוצלח של חזרות ארמדילו המכילות חלבון עץ פלסמודיום RT. תפוקת החלבון לאחר הטיהור היא 3.5 מיקרוגרם ל -25 מיקרוליטר לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפרזיטולוגיה לאפיון חלבונים בטפילים, אינטראקציות חלבון-חלבון, מחקרים מעכבי נוגדנים ופיתוח חיסונים בתחום הפרזיטולוגיה.

לאחר צפייה בסרטון זה, עליך להבין כיצד להשתמש במערכת ביטוי התאים המבוססת על תאי מרפא כדי לבטא חלבוני פלסמודיום תוך שלוש שעות. תהיה לך גם הבנה כיצד לטהר את החלבונים מכרכי מיקרו של מוצר מתורגם.