שיטות כדי להגדיל את הרגישות של רזולוציה גבוהה התכה יחידה נוקלאוטיד פולימורפיזם Genotyping במלריה

המטרה הכוללת של ניסוי ההיתוך הבא ברזולוציה גבוהה היא להגביר את הרגישות לזיהוי אללים מוטנטיים הנמצאים בריכוזים נמוכים עם דגימות בודדות. זה מושג על ידי הכנת DNA מופק תחילה על ידי דילול התבנית לנפחים והריכוזים הדרושים. השלב השני הוא הכנת הבדיקות עם פרופורציות אסימטריות של פריימר קדימה ואחורה כדי להגדיל את מוצר בדיקת התבנית.

לאחר הכנת התגובות, טמפרטורת החישול נקבעת בין טמפרטורות ההיתוך של הגשושית כאשר היא קשורה לסוג הפראי או לתבנית המוטנטית. השלב האחרון הוא ניתוח המוצרים המוגברים בפלטפורמת HRM המתאימה. בסופו של דבר, הטיית הגברת אלל מוטנטית ו-PCR אסימטרי מבוסס בדיקה מאפשרים זיהוי רגיש יותר של מוטציית SNP מאתגרת בריכוזים נמוכים הקיימים בדגימות.

רגישות מוגברת זו שימושית למעקב אחר מוטציות באוכלוסיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו התכה סטנדרטית ברזולוציה גבוהה או גנוטיפ טק מן, הוא שהיא מאפשרת רגישות מוגברת לאללים הקיימים בריכוזים נמוכים, וגם מאפשרת גנוטיפ של SNPs הממוקמים קרוב זה לזה בגנום. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התפשטות העמידות לתרופות בטפיל המלריה.

ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון מעקב אחר סוגי מחלות זיהומיות אחרות כגון HIV או איתור וריאנטים סרטניים נדירים באוכלוסיית תאים. מי שתדגים את ההליך תהיה קייטלין דורפי. טכנאי מהמעבדה שלנו.

תבניות להתכה ברזולוציה גבוהה או HRM מוכנות מדגימות פלסמודיום פלציפרום המתקבלות ישירות מדמם של חולים המשתתפים במחקרי אתרי שדה. ניתן לאחסן את הדגימות על נייר פילטר, בבדיקות זיהוי מהירות או כדגימות כדוריות דם אדומות עשויות להיות מותאמות לגידול במבחנה. ניתן להזמין כמה זני מעבדה סטנדרטיים לניתוח ממחקר המלריה ומרכז משאבי ריאגנטים ייחוס ניתן לחלץ דגימות מדם מלא, כדוריות דם אדומות או נייר סינון, או להשתמש ישירות מתאי דם אדומים או תרבית להגברה ישירה מתאי דם אדומים מכדורים.

ראשית קבע את הפרה של כדוריות הדם האדומות באמצעות מיקרוסקופ מריחה דק בעקבות ההליך של המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן. תאי דם אדומים עם פרות מעל 0.5% מדוללים לאחר מכן 1 עד 400. ב-TE שלושה מיקרוליטרים של כדוריות דם אדומות מדוללות ישמשו לכל תגובה של 5 עד 10 מיקרוליטר עקב שונות אחת בקרות חיוביות ושליליות חייבות תמיד להיכלל בניתוחי HRM.

הכן 10 פיקוגרם עד 10 ננוגרם למיקרוליטר אחד דילול של פלסמיד או סטנדרטים עם גנוטיפים מאומתים של חיתוך כטרולים חיוביים. השתמש במים בדרגת PCR כבקרה שלילית ללא תבנית לתגובות ההגברה. התחל הליך זה על ידי הכנת 10 x מלאי עבודה של הפריימרים והבדיקות.

אותו פרוטוקול חל על בדיקות המשתמשות ב-96 לוחות בארות, 384 לוחות בארות, שמונה רצועות צינור או נימי זכוכית. אך לצורך הדגמה זו ישמשו רק 96 צלחות באר ונימי זכוכית. טבלה זו מציגה ריכוזי מלאי עבודה מומלצים פי 10 וכן ריכוזים סופיים עבור גנוטיפ HRM מבוסס בדיקה חסומה.

הכן תערובות תגובה לכל אחד מהם. ובכן, הוסף מיקרוליטר אחד מכל אחד מ-10 x פריימרים ובדיקות קדימה ואחורה. ארבעה עד חמישה מיקרוליטר של מאסטר HRM מערבבים מיקרוליטר אחד של תבנית ומים בדרגת PCR לנפח תגובה כולל של 10 מיקרוליטר.

עשו את אותו הדבר עבור כל נימי זכוכית. מכסים את הצלחות ונימי הזכוכית. השתמש באטמי לוחות אופטיים להגברה מבוססת צלחת ומכסי פלסטיק למערכות מבוססות נימים.

ודא שהכיסוי מלא והצלחות והמכסים אטומים ומאובטחים לחלוטין כדי למנוע אידוי. במהלך הגברה. סובב את הדגימות כדי להסיר בועות אוויר.

סובב צלחות בצנטריפוגה שולחנית למשך שלוש דקות ב -1, 800 פעמים G.סובב נימי זכוכית בפיקו פוגה למשך 10 עד 15 שניות. הנח את לוחית התגובה ונימי הזכוכית בבדיקה חסומה סטנדרטית של ריצת מחזור תרמי או פרוטוקולי הגברה של MAAB. לאחר הגברת PCR המשך לניתוח ההיתוך מממשק תוכנת המערכת.

ממיסים את הצלחת מ-40 מעלות צלזיוס ל-80 מעלות צלזיוס כדי לייצר שיאי התכה של בדיקה ואמפליקון. ניתוח ההיתוך של השלב הראשון במחזור האור 4 80 הוא נורמליזציה מהנגזרת השלילית של הקרינה המנורמלת ביחס לתצוגת הטמפרטורה. הזז את פסי הנורמליזציה כדי להקיף את אזור ההיתוך של הגשושית.

אזור ההיתוך של הגשושית הוא הטמפרטורה הנמוכה יותר של שני אזורי ההיתוך. מוטות הנורמליזציה צריכים להיות בבסיס פסגות ההיתוך. לאחר הנורמליזציה, בחר חשב קבוצות כדי להקצות באופן אוטומטי דגימות לקבוצות במידת הצורך, הקצה מחדש באופן ידני דגימות לקבוצות ספציפיות.

בחר דגימות שלא הגבירו או שיש להן שיאי התכה משוננים. לאחר מכן עבור לשיחה חדשה ובחר שלילי. לאחר בחירת הדגימות שנותרו שסווגו באופן שגוי, עבור אל שיחה חדשה, בחר את הקיבוץ המתאים ולחץ על החל שינוי הקצה גנוטיפים לכל קבוצה על סמך הסטנדרטים.

לאחר אישור שהקבוצות המחושבות נכונות, בחר ערוך שמות קבוצות תחת לשונית הקיבוץ. הזן את הגנוטיפים של התקנים בתיבה הצבעונית המתאימה. לדוגמה, אם לתקן 3D 7 יש גנוטיפ C ידוע והוא נמצא בקבוצה הראשונה, אז לכל הדגימות בקבוצה הראשונה יש תוצאות עיתונות של גנוטיפ C וגנוטיפים מוצגים לצד הדגימות.

לבסוף, ייצא את התוצאות כקובץ TXT להמשך ניתוח אוכלוסיית מדגם. לאחר סיום הריצה ב-Light Cycler 2.0, רשום את שמות הדגימות והמיקומים תחת נתוני הדגימה לפני תחילת הניתוח סמן את הבקרות השליליות ואת הגנוטיפים של תקני ההיתוך. התחל את ניתוח ההיתוך על ידי בחירת ניתוח, בחירת גנוטיפ תחת ניתוח עקומת התכה ולחיצה. בסדר.

כדי להגביר את הרגישות של הקיבוץ האוטומטי, בחר את כל הדגימות כך שהתצוגה בעקומות ההיתוך תתווה. החלק את סרגל הנורמליזציה לגבול העליון של פסגות ההיתוך של הבדיקה. ודא שהדגימות קובצו כראוי על-ידי בחירה בנפרד של כל קבוצה תחת שם הקבוצה.

ייצא את הגנוטיפים עבור כל דגימה על ידי בחירת כל הדגימות, העתקת הנתונים והדבקה לגליון עבודה. העלילה של הנגזרת השלילית של הקרינה המנורמלת ביחס לטמפרטורה היא בדרך כלל הדרך הפשוטה ביותר לדמיין שיאי התכה ולקבוע גנוטיפים. הגדרת חלון הניתוח לאזור בדיקה בלבד מביאה לבידול ברור של פסגות המתאימות ל-SNPs ספציפיים.

התאמות מושלמות מביאות לשיאי התכה גבוהים יותר המסומנים באדום. בעוד שלאי התאמות SNP יש טמפרטורות התכה נמוכות יותר המצוינות באפור כאשר שני האללים נמצאים בדגימה. ניתוח HRM מבוסס Prob מייצג את שני האללים כשתי עקומות שיא המוצגות בכתום עם פסגות התואמות לדגימות אלל בודדות המוצגות באדום ואפור, מה שמפחית בהדרגה את טמפרטורת האלל במהלך ההגברה מביא להטיה לכיוון האלל המוטנטי המיוצג על ידי שיא הצד השמאלי בדגימה פוליגנומית או פולי אללית.

הטיית הגברת אלל מוטנטית זו מביאה לרגישות HRM לאיתור אללים מינוריים הנמצאים בפחות מ-1% בדגימות פולי-גנומיות או פולי-אלליות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שאיכות הדגימה היא המפתח. הבדלים קלים בריכוזי המאגר יכולים להזיז את עקומות ה-HRM.

שימוש בפקדים הוא דרך שימושית לסטנדרטיזציה של תוצאות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש ב-PCR אסימטרי מבוסס בדיקה ובהטיית הגברת אלל מוטנטי כדי לגנוטיפ מדויק ורגיש SNPs של מלריה ממגוון סוגי דגימות.