Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנתח אינטראקציות חלבון RNA מתמציות תאים באמצעות בדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית. זה מושג על ידי הכנת תמצית חלבון מתאים או רקמות בשלב נפרד, בדיקת RNA ספציפית לגן מסונתזת ומטוהרת. לאחר מכן מערבבים את תמצית החלבון עם בדיקת ה-RNA המסומנת כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים ספציפיים של חלבון RNA.

לבסוף, תוצר התגובה נטען על ג'ל פולי אקרילאמיד שאינו דנטור ומנותח על ידי בדיקת RNA נטולת אלקטרופורזה מופרדת ממתחמי חלבון ה-RNA בזכות הניידות המהירה יותר שלו. בדיקת שינוי הניידות האלקטרופורטית נמצאת בשימוש נרחב לניתוח אינטראקציות חלבון RNA. יכולנו לנתח את הקישור של חלבונים מווסתים של ברזל, IRP 1 ו-IRP 2 ליסוד ה-RNA היעד שלהם.

אך ניתן ליישם את השיטה גם למחקר של חלבונים קושרי RNA אחרים המדגימים כי הליך זה ייעשה על ידי ד"ר קיין, עמית מחקר פיליפיני במעבדה שלי ועל ידי ד"ר ניקול וילקינסון, פוסט-דוקטורנטית לתאי דבק הגדלים בכלים. שטפו את התאים פעמיים עם PBS קר כקרח, ואז הוסיפו מיליליטר אחד של PBS קר כקרח וקצרו את התאים בעזרת מגרד תאים מפלסטיק. העבירו את תרחיף התאים הרופפים לצינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר.

הנח את הצינור במיקרו צנטריפוגה של ארבע מעלות צלזיוס מקוררת מראש. סובב במהירות נמוכה במשך חמש דקות ושאף את הסאפ נטנט. התאים יופיעו ככדור לבן בתחתית הצינור.

על כל 10 מיליון תאים שנקטפו, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה ציטופלזמי קר כקרח. שחרר את כדור התא על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים ולאחר מכן דגר את התרחיף על קרח למשך 20 דקות. זה יסיס את קרום התא וישחרר את כל התוכן הציטוזולי לתוך המאגר.

כדי לבודד את השבר הציטוזולי המסיס, סובב את הצינור במלוא המהירות למשך 10 דקות בצנטריפוגה של ארבע מעלות צלזיוס, העביר את הצינור המובהר לצינור חדש של 1.5 מיליליטר על קרח והשליך את הגלולה. לאחר מכן, קבע את ריכוז החלבון הכולל של התמצית הציטופלזמית המתקבלת באמצעות מבחן ברדפורד. יש לשים את התמצית הציטופלזמית המתקבלת לצינורות קטנים יותר ולאחסן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש לייצור תמציות ציטופלזמיות מרקמות טריות.

התחל את תהליך הקטיף על ידי הנחת החיה המורדמת על כרית נקייה מעל קרש חיתוך. פתח את הבטן במספריים. הסר את הכבד והטחול באמצעות מספריים ומלקחיים.

שטפו כל טישו בכ-50 מיליליטר PBS קר כקרח כדי למנוע פירוק רקמות. חותכים מיד רקמות לחתיכות קטנות בערך מילימטר עד שני מילימטר מעוקב בעזרת אזמל ללא דיחוי. הנח את הטישו בצינור קריו טרי והצמד

הקפיאו דגימה בחנקן נוזלי. אחסן את הטישו הקפוא במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה צורך בהן. התחל להכין את התמצית הציטופלזמית על ידי העברת דגימת הרקמה שהוקפאה בעבר לצינור של שני מיליליטר עם תחתית שטוחה המכילה 250 עד 500 מיקרוליטר של מאגר ליזיס קר כקרח.

הנח קצה הומוגנייזר רקמות לתוך הצינור והפעל את המכשיר בעוצמה בינונית. לאחר 10 שניות של הומוגניזציה, הנח מיד את הצינור על קרח למשך 20 דקות כדי למנוע דנטורציה של חלבון. כדי לבודד את השבר הציטוזולי, סובב את הצינור במלוא המהירות למשך 10 דקות בצנטריפוגה של ארבע מעלות צלזיוס, העביר את הסופרנטנט המובהר לצינור חדש של 1.5 מיליליטר על קרח והשליך את הגלולה.

קבע את ריכוז החלבון הכולל של התמצית הציטופלזמית המתקבלת באמצעות מבחן ברדפורד. אקווה את התמצית הציטופלזמית המתקבלת לצינורות קטנים יותר ושומרים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד לצורך. לפני שתמשיך בפרוטוקול, הגדר שולחן עבודה בטוח לקרינה עם מונה גייגר מגן פרספקס.

בצע תגי ניטור ציטומטריה על שכבות מעבדה ומיכלי פסולת ספציפיים לקרינה מתאימים ומיכלי פסולת שאינם חדים. החל מפלסמיד DNA דה-ליניארי המכיל אלמנט תגובת ברזל משובט. כתבנית, הגדר תגובת שעתוק RNA של 20 מיקרוליטר במבחנה על ידי ערבוב מאגר תגובת התבנית, נוקלאוטידים רדיואקטיביים חלקית ו-RNA פולימראז עם פיפטה בטמפרטורת החדר.

כדי להתחיל סינתזת RNA, דגרו את הדגימה ב-40 מעלות צלזיוס למשך שעה. סיים את תגובת השעתוק במבחנה על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של 0.5 מולרי EDTA pH 8.0. מערבבים פנימה את ה-EDTA על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

כעת השתמש בפרוטוקול משקעים אלכוהולי סטנדרטי כדי לטהר את מוצר ה-RNA. כדי להתחיל, הוסף 10 מיקרוליטר של TRNA ו-82.5 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט מולארי ב-pH 5.2 לתערובת ולמערבולת שלאחר הסינתזה. ערבוב ה-TRNA ישמש כנשא משקעים ויגדיל את תפוקת ה-RNA הסופית כדי לזרז את ה-RNA.

מוסיפים 273 מיקרוליטר של 95 עד 100% אתנול ומערבבים על ידי מערבולת. אפשר לתגובת המשקעים להמשיך על ידי השארת הצינור על הספסל למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לבודד את ה-RNA, סובב את הצינור כלפי מטה בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר במלוא המהירות למשך 10 דקות. בעזרת פיפטה, השליכו בזהירות את הסופרנטנט ואל תפריעו לגלולה.

ה-RNA המשקע עשוי להתקיים ככדור לבן קטן ליד תחתית הצינור או שהוא עשוי להיות בלתי נראה לעין בלתי. שטפו את הגלולה על ידי הוספת 100 עד 500 מיקרוליטר של 70% אתנול. סובב את הדגימה במלוא המהירות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן שפך את החריץ עם המכסה.

פתח יבש את כדור ה-RNA על ידי השארת הצינור פתוח על הספסל למשך 10 עד 15 דקות. הרכיבו מחדש את הרנ"א המוצק המסומן ברדיו על ידי הוספת 100 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. כמת את היקף שילוב הנוקלאוטידים הרדיואקטיביים על ידי הנחת תמיסת ה-RNA ב-Counter Eloqua נוזלי.

הרדיו שכותרתו RNA בדיקה לצינורות קטנים יותר ואחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לצורך. ניתן להשתמש באליקוטים קפואים עד שלושה שבועות לפני תחילת בדיקת הניידות האלקטרופורטית, הכינו ג'ל אקרילאמיד סטנדרטי של 6% ללא דנטורציה בגודל של לפחות 16 על 16 סנטימטרים כדי להקל על נפחי דגימה גדולים יותר לכל נתיב. וכדי לשפר את היציבות המכנית של ג'ל בגודל כזה.

השתמש במרווחי זכוכית ומסרקים בעובי של מילימטר אחד לפחות. כדי להתחיל בבדיקת שינוי הניידות האלקטרופורטית, יש להפשיר את הליזאט הציטופלזמי שהוקפא בעבר ואת בדיקות ה-RNA המסומנות ברדיו על העיניים עבור מרכיב החלבון של הניסוי. מדללים 25 מיקרוגרם מהתמצית הציטופלזמית עם מאגר הליזה הציטופלזמי לנפח כולל סופי של 10 מיקרוליטר.

במידת הצורך, הוסיפו לתערובת מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי שתיים ושמרו את דגימת החלבון על קרח. עבור רכיב ה-RNA, יש לדלל את בדיקת הרנ"א המסומנת ברדיו במים נטולי נוקלאז עד ל-200,000 ספירות לדקה לכל מיקרוליטר חום כדי לייצר את ה-RNA ב-95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ולקרר את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לפחות. כדי להתחיל את תגובת קשירת ה-RNA של החלבון, הוסף מיקרוליטר אחד של בדיקת RNA עם תווית רדיו לתמצית החלבון כדי לאפשר לקישור להתרחש במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

כדי להגדיל את הספציפיות של בדיקת שינוי הניידות האלקטרופורטית, הוסף מיקרוליטר אחד של מלאי הפרין לתגובה. אם בדיקות RNA עם תווית רדיו ארוכות מ-60 נוקלאוטידים, הוסף מיקרוליטר נוסף של RNAs T אחד. אפשר לתגובת הקישור להימשך עוד 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשפר עוד יותר את הספציפיות ולאפשר הפרדה טובה יותר של קומפלקס חלבון ה-RNA.

הוסף שלושה מיקרוליטר של מאגר טעינה ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. לאחר מכן טען את כל התגובה על ג'ל אקרילאמיד 6% והפעל את הג'ל בחמישה וולט לסנטימטר למשך 60 דקות. הקפד לכסות את המכשיר במיגון קרינה מתאים.

פרק את מנגנון הג'ל והעביר את הג'ל על נייר סינון גדול. יבש את הג'ל באמצעות מכשיר ואקום לייבוש ג'ל בחדר חשוך. הניחו את שילוב נייר הג'ל והפילטר על גבי חתיכה.

סרט לאחר חשיפה, פתח וייבש את הסרט באוויר. זמן החשיפה האופטימלי יכול לנוע בין שעה ללילה. ניתן להעריך את יכולת הקישור התלויה בברזל של I RRP אחד ו-I RRP שניים לבדיקות IRE רדיואקטיביות בתאי תרבית רקמה עם תכולת ברזל משתנה.

לפיכך, פעילות קשירת IRE מושרית בתאים מדוללי ברזל שטופלו בעבר בדפרוקסאמין K מאוחר יותר. לעומת זאת, פעילות הקישור של IRE מדוכאת בתאים טעוני ברזל שטופלו בעבר בהמן בתאים טעוני ברזל. פעילות קשירת ה-IRE של I RRP אחד אובדת לאחר הרכבה של אשכול גופרית ברזל ואילו I RRP 2 עובר פירוק תלוי ברזל.

ניתן להשמיד את אשכול תאי הברזל של IRP 1 על ידי טיפול בתמציות תאים עם 2%two me, המאפשר ניטור פעילות קשירת ה-IRE הרדומה שלו. הפעילות של I RRP 2 לא משוחזרת על ידי שני אני. בניסוי הבא הזה, פעילויות הקישור של IRE של I RRP אחד ו-IRP 2 כפונקציה של ריכוז הברזל התאי מוערכות בהקשר של רקמות כבד טריות מסוג I פראי, RRP אחד נוקאאוט ו-I RRP שני עכברי נוק-אאוט.

כאן הנתונים מראים כי האכלת עכברים בתזונה עשירה בברזל הידועה כמגבירה את עומס הברזל בכבד מקדמת הפחתה בפעילויות הקישור של IRE של I RRP one ו-IRP 2 בתמציות כבד מעכברים מסוג בר. אני rrp שני מתחמי IRE מוטים על ידי הנוכחות של I RRP אחד. הם נראים בקלות בתמציות כבד של עכברי נוקאאוט I RRP אחד.

כאן הדיאטה העשירה בברזל מובילה להשבתה מוחלטת של IRP 2. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח אינטראקציות של חלבון RNA על ידי בדיקת שינוי הניידות האלקטרופורטית. זכרו שאיכות בדיקת ה-RNA היא קריטית להצלחה.