מולקולרי הבדיקה אופטימיזציה לקביעת תמותת תא באורגניזם פוטוסינתזה ( Aeruginosa Microcystis) שימוש cytometry הזרימה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד ליצור פרוטוקול שיכול לנתח את המצב הפיזיולוגי הציאנובקטריאלי ביעילות, באמצעות ציטומטריית זרימה ובדיקות מולקולריות. פרוטוקול זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הפיזיולוגיה של התא של קהילות מיקרוביאליות. היתרון העיקרי בהליך זה הוא שפרוטוקול בדיקה פלואורסצנטי אופטימלי יכול להבחין בין המצבים הפיזיולוגיים של ציאנובקטריה ברמת התא הבודד בזמן אמת.

מי שידגים את ההליך הזה יהיה דיוויד הארטנל, דוקטורנט שעובד במעבדת הציטומטריה באוניברסיטת בורנמות'. לפני תחילת הניסוי, הנח צינור המוליזה ריק על בדיקת הזרקת הדגימה. לחץ על פתיחת סתימה.

ואז שטוף בחזרה כדי להתחיל בתהליך ניקוי ציטומטריית הזרימה. בסוף השטיפה האחורית, טען צינור המוליזה חדש המכיל שני מיליליטר מים מסוננים טהורים במיוחד על בדיקת הזרקת הדגימה, או SIP, והגדר את מגבלת הזמן ל-10 עד 15 דקות, ואת מהירות הנוזל למהיר. לאחר מכן, בחר תא נתונים חדש, והגדר את סף הקרינה ופיזור האור הרלוונטיים כדי להפחית את רעשי הרקע.

לאחר מכן לחץ על הפעל. אם סך האירועים בשנייה אינו נופל מהמלצת היצרן, הפעל שני מיליליטר של תמיסת טיהור למשך שתי דקות במהירות. וחזור על שלבי ההדחה האחורית ושטיפת מים טהורים במיוחד.

להכנת מונוקולטורה ראשונית של M.aeruginosa, חיטוי 98 מיליליטר מים מסוננים טהורים במיוחד, מעורבבים עם שני מיליליטר מדיום אצות, בכוס של 250 מיליליטר למשך 20 דקות בטמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס. כאשר תרבית נמצאת בצפיפות מצב יציב גבוהה, פרק שני מיליליטר תאים על ידי מערבולת. ואז להעביר את התאים מתחת לבדיקת הזרקת הדגימה.

ודא שהתאים מפוזרים באופן שווה על ידי מיקרוסקופ אור. לאחר מכן בחר עלילת היסטוגרמה בתוכנת ציטומטר הזרימה כדי להקליט את נתוני פיזור האור קדימה. ולחץ על יומן כדי להציג את הנתונים בסולם יומן על ציר ה-x.

בפלט נפרד, הגדר היסטוגרמה נוספת של ציר לוג כדי לתעד את הקרינה הטבעית של תאי M.aeruginosa. לאחר מכן, בחרו מקור אור שיכול לעורר פיקוציאנין, וגלאי שיכול לסנן את הפליטות מהפלואורסצנטיות שנוצרה. להקלטה ברזולוציה הגבוהה ביותר, בחר את ההגדרות הקרובות ביותר לגודל הליבה של אורגניזם המטרה.

והגדר קצב זרימה איטי יחסית. לפני רכישת הנתונים, הגדר סף לשער כל פיזור אור ואותות פלואורסצנטיים הנגרמים על ידי רעשי רקע אלקטרוניים או פסולת דגימת תא. לאחר מכן בחר תא נתונים חדש.

צור תרשים צפיפות עם פרמטרים של פיזור קדימה וצדדית בקנה מידה של יומן, ולחץ על הפעל. כעת החל את פיזור האור קדימה ושער הקרינה הטבעי על נתוני הפיזור קדימה זה לצד זה כדי לא לכלול אותות פיזור ברמה נמוכה, ולכלול רק את אותות הפיקוציאנין הקרינה היחסית הגבוהים יותר. לאחר מכן אסוף אירועים עד לסיום הדגימה, והשתמש בנתונים כדי לקבוע את ספירת התאים הראשונית.

כדי לייעל את ספיגת תאי הבדיקה המולקולרית, חשוף מחצית מהמונוקולטורה שהוכנה בעבר לתנאים המתאימים ליצירת בקרה מתה. בדוק את הווריאציות בסביבת המיקרו של הדגימה כדי לאשר את מותה של התרבית. ואז לפרק את היווצרות המושבה כפי שהודגם זה עתה.

לאחר מכן, בחר לייזר של 488 ננומטר לצד גלאי שיכול לתעד פלואורסצנטיות מבדיקות חומצות הגרעין הירוקות והכתומות. והלייזר של 640 ננומטר כדי להקליט את אותות הפיקוציאנין דרך הגלאים שלהם. בגיליון נתונים חדש, הגדר תרשים צפיפות עם פרמטרים של פיזור קדימה וצדדית.

לאחר מכן צור היסטוגרמה אחת באמצעות ערוץ הגלאי האופטי של הגשושית המולקולרית המתאימה. היסטוגרמה אחת לזיהוי פליטות פיקוציאנין, והיסטוגרמה אחת לאירועי פיזור קדימה, הכל בסולם לוג. הפעל את הדגימות הציאנובקטריאליות באמצעות ריכוזים וזמני דגירה שונים.

צור שער בהיסטוגרמה של פיזור קדימה כדי לכלול אירועים רק עם גודל התא של אורגניזם המטרה. והחל אותו על תעלת בדיקת הקרינה המתאימה. לאחר מכן, בערוץ בדיקת הקרינה, צור שער תוכנה כולל נוסף כנגד השיא הגבוה ביותר בהיסטוגרמה.

ולאחר מכן שער את הקרינה החיובית המתאימה לעלילת הצפיפות. השווה את מספר אותות הקרינה למספר תאי הבקרה המתים, שבהם האחוז הגבוה ביותר של קליטת גרעין התא אינו מייצר צביעה לא ספציפית. לבדיקת חפיפת הפרעות הקרינה מצביעה פנימית או לא ספציפית של תאים, בחר את נתוני התרבית המעורבת של 50 אחוז חיים ו-50 אחוז מתים.

והסר את שערי הפלורסנט. החל שערים כדי לכלול רק את היסטוגרמה של פיזור קדימה עבור גודל התא של אורגניזם המטרה בהיסטוגרמה של ערוץ פיקוציאנין. שער הפסגות הגבוהות והנמוכות ביותר של פיקוציאנין, ותייג אותן חיות ומתות, בהתאמה.

לאחר מכן החל בנפרד את השערים על אותות פיקוציאנין חיים ומתים. ורשום את שני אורכי הגל הממוצעים. כדי לקבוע את רגישות הפרוטוקול, יחסו בין אורכי הגל הממוצעים של הקרינה המולקולרית החיובית של הגשושית המתה, לבין האות החי הלא ספציפי הפנימי.

לבסוף, בחר את הפרוטוקול האופטימלי שבו הכמות הגבוהה ביותר של תאים מתים הוכתמה ללא התרחשות של צביעה לא ספציפית. בגרפים אלה מוצגים יציאות פיזור האור המייצגות קדימה וצדדית, עבור גודל התא והמורכבות הפנימית של תרבית אצווה M.aeruginosa בשלב האקספוננציאלי. ניתן לבצע שער על ידי זיקוק הנתונים בין נקודות מסוימות של תפוקת פיזור האור קדימה.

פיקוציאנין מייצר אות חזק כאשר הוא נחקר על ידי מקור אור אדום, שיכול לשמש כדי להגביר את האוכלוסיות המעניינות. מפיזור האור הקדמי והאותות הפלואורסצנטיים, ניתן לסגור נתונים מהפלט המקורי, לנתונים ספציפיים על דגימת M.aeruginosa לספירת תאים סופית. כאשר מערבבים בקרות חיות בעלות פיגמנט גבוה יותר ופיגמנט נמוך יותר, השינוי ההולך ופוחת בפלואורסצנטיות האוטומטית מתבהר.

בתאים שנפגעו על ידי הממברנה, בדיקות חומצות הגרעין מייצרות אות נוסף שניתן לצפות בו על ידי ציטומטריית זרימה ולאשר עוד יותר על ידי מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. הבחנה פלואורסצנטית בין תאים חיים ומתים עולה עם הזמן בין ריכוזי המיקרו-מולרים של 0.05 ל-0.5, אך יורדת בין ריכוז אחד ל-100 מיקרו-מולרי עבור שני הבדיקות. ואכן, נראה כי הריכוז האופטימלי עבור בדיקת חומצת הגרעין הירוקה הוא 0.5 מיקרומולר עם זמן דגירה של 30 דקות.

עבור בדיקת חומצת הגרעין הכתומה, הריכוז האופטימלי הוא מיקרו-מולרית אחת לדגירה של 10 דקות. לאחר השליטה, עבור כל בדיקה מולקולרית, ניתן להשלים את האופטימיזציה תוך יום, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את הבדיקות בסביבה יציבה, בתנאי הטמפרטורה, ה-pH והאור המתאימים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה לחקור הטרוגניות קהילתית בפיטופלנקטון. לאחר שצפית בסרטון, כעת אתה אמור להבין היטב כיצד לפתח פרוטוקול אופטימלי להערכת פיזיולוגיה תאית באמצעות ציטומטריית זרימה ובדיקות מולקולריות. אל תשכח שעבודה עם בדיקות מולקולריות ואורגניזמים רעילים עלולה להיות מסוכנת ביותר, וכי יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ה-PPE המתאים, והבנה מלאה של חומרי COSHH, בעת ביצוע הליך זה.