מולקולרי הבדיקה אופטימיזציה לקביעת תמותת תא באורגניזם פוטוסינתזה (
29 בינואר 2016
אוכלוסיות חיידקים מכילות ההטרוגניות תא משמעותית, אשר יכול להכתיב התנהגות כוללת. ניתוח בדיקה מולקולרי באמצעות cytometry זרימה יכול לקבוע מדינות פיסיולוגיות של תאים, עם זאת היישום שלה משתנה בין מינים. מחקר זה מספק פרוטוקול לקבוע תמותת תאים בתוך אוכלוסיית cyanobacterium במדויק, בלי להמעיט או הקלטת תוצאות חיוביות שגויות.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד ליצור פרוטוקול המסוגל לנתח ביעילות את המצב הפיזיולוגי של ציאנובקטריה, באמצעות ציטומטריית זרימה וגששים מולקולריים. פרוטוקול זה יכול לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח לגבי הפיזיולוגיה התאית של קהילות מיקרוביאליות. היתרון העיקרי של פרוצדורה זו הוא שפרוטוקול אופטימלי של גשש פלואורסצנטי יכול להבחין בין מצבים פיזיולוגיים של ציאנובקטריה ברמת התא הבודד בזמן אמת.
מי שידגים את ההליך הוא דייוויד הארטנל, סטודנט לדוקטורט העובד במעבדת הציטומטריה באוניברסיטת בורנמות'. לפני תחילת הניסוי, הנח שפופרת המוליזה ריקה על מחט הזרקת הדגימות. לחץ על unclog.
לאחר מכן בצעו שטיפה לאחור (back flush) כדי להתחיל בתהליך ניקוי ציטומטריית הזרימה. בסיום השטיפה לאחור, טענו למחט הזרקת הדגימה (SIP) מבחנה המוליזה חדשה המכילה 2 mL של מים מזוקקים ומסוננים (ultra pure filtered water), הגדירו את הגבלת הזמן ל-10 עד 15 דקות, ואת מהירות הזרימה למהירה (fast). לאחר מכן, בחרו תא נתונים חדש והגדירו את ספי המדידה הרלוונטיים של הפלואורסצנציה ופיזור האור כדי להפחית את רעשי הרקע.
לאחר מכן לחצו על run. אם סך האירועים לשנייה אינו נמוך מההמלצת היצרן, העבירו שני מיליליטר של תמיסת דה-קונטמינציה למשך שתי דקות במהירות גבוהה (fast). חזרו על שלבי השטיפה לאחור ושטיפת המים אולטרה-טהורים.
להכנת תרבית מונו-קלטור ראשונית של M.aeruginosa, בצעו עיקור באוטוקלאב ל-98 milliliters של מים מסוננים בדרגת טהרה גבוהה (ultra pure), המעורבבים עם שני milliliters של מצע אצות (algal medium), בבכור של 250-milliliters למשך 20 דקות בטמפרטורה של 120 degrees Celsius. כאשר התרבית נמצאת במצב צפיפות יציב גבוה (high steady state density), פרוקו שני milliliters של תאים באמצעות וורטקס (vortexing). לאחר מכן, העבירו את התאים אל מתחת לגשושית הזרקת הדגימה.
יש לוודא באמצעות מיקרוסקופיה של אור שהתאים מפוזרים באופן אחיד. לאחר מכן, יש לבחור בתוכנת הסייטומטר הזרימתי בתרשים היסטוגרמה להקלטת נתוני פיזור האור קדימה (forward light scatter). יש ללחוץ על log כדי להציג את הנתונים בסולם לוגריתמי בציר ה-x.
בפלט נפרד, הגדירו היסטוגרמה עם ציר לוגריתמי נוסף כדי לתעד את הפלואורסצנציה הטבעית של תאי ה-M.aeruginosa. לאחר מכן, בחרו מקור אור המסוגל לעורר פיקוציאנין, וגלאי המסוגל לסנן את הפליטות מהפלואורסצנציה שנוצרה. כדי לבצע תיעוד ברזולוציה הגבוהה ביותר, בחרו בהגדרות הקרובות ביותר לגודל הליבה של האורגניזם המטרה.
הגדירו קצב זרימה איטי יחסית. לפני רכישת הנתונים, הגדירו סף (threshold) כדי לסנן (gate out) אותות פיזור אור ופלואורסצנציה הנגרמים מרעש רקע אלקטרוני או משאריות דגימות תאים. לאחר מכן, בחרו תא נתונים חדש.
צרו תרשים צפיפות עם פרמטרי פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור צידי (side scatter) בסולם לוגריתמי, ולחצו על run. כעת הפילו את השער (gate) של פיזור אור קדימה ופלואורסצנציה טבעית על נתוני הפיזור הקדימה מול הפיזור הצידי כדי להוציא אותות פיזור ברמה נמוכה, ולהכליל רק את אותות הפיקוציאנין בעלי הפלואורסצנציה היחסית הגבוהה יותר. לאחר מכן, אספו אירועים עד לסיום הדגימה, והשתמשו בנתונים כדי לקבוע את ספירת התאים הראשונית.
כדי למטב את ספיגת הגשוש המולקולרי לתאים, חשפו מחצית מהמונו-קלטור שהוכן קודם לכן לתנאים המתאימים ליצירת בקרת תאים מתים. בדקו את השינויים במיקרו-סביבה של הדגימה כדי לאשר את מות התרבית. לאחר מכן, פרקו את התגבשים של הקולוניות כפי שהודגם זה עתה.
בשלב הבא, בחרו לייזר של 488-nanometer לצד גלאי המסוגל לתעד פלואורסצנציה מהגששים של חומצות הגרעין בצבעי ירוק וכתום. ובחרו את הלייזר של 640-nanometer כדי לתעד את אותות ה-phycocyanin דרך הגלאים המתאימים להם. בגיליון נתונים חדש, הגדירו תרשים צפיפות (density plot) עם פרמטרי פיזור קדמי וצידי (forward and side scatter).
לאחר מכן, צור היסטוגרמה אחת באמצעות ערוץ הגילוי האופטי של הגשש המולקולרי המתאים. היסטוגרמה אחת לזיהוי פליטות של phycocyanin, והיסטוגרמה אחת לאירועי פיזור קדמי (forward scatter), כולן בסולם לוגריתמי. הרץ את דגימות הציאנובקטריה בריכוזים ובזמני אינקובציה שונים.
צרו שער (gate) בהיסטוגרמה של הפיזור קדימה (forward scatter) כדי לכלול אירועים שגודל התאים שלהם תואם לאורגניזם המטרה, והפילו אותו על ערוץ גשש הפלואורסצנציה המתאים. לאחר מכן, בערוץ גשש הפלואורסצנציה, צרו שער תוכנה כולל נוסף על הפסגה הגבוהה ביותר בהיסטוגרמה.
לאחר מכן, בצעו gating של פלואורסצנציית הגשש החיובית המתאימה על גרף הצפיפות (density plot). השוו את מספר אותות הפלואורסצנציה למספר תאי הביקורת המתים, במקום שבו אחוז ספיגת הגשש הגרעיני בתאים הוא הגבוה ביותר מבלי לייצר צביעה לא ספציפית. לבדיקת חפיפת הפרעה פלואורסצנטית מצביעה תאית פנימית או לא ספציפית, בחרו את נתוני התרבית המעורבת של 50% תאים חיים ו-50% תאים מתים.
והסר את השערים הפלואורסצנטיים. החל שערים כך שייכללו רק ההיסטוגרמה של הפיזור הקדמי (forward scatter) עבור גודל התא של האורגניזם המטרה בהיסטוגרמה של ערוץ הפיקוציאנין (phycocyanin). הגדר שערים עבור שיאי הפיקוציאנין הגבוהים והנמוכים ביותר, וסמן אותם כ"חיים" ו"מתים", בהתאמה.
לאחר מכן, החילו בנפרד את השערים (gates) על אותות הפייקוסיינין של התאים החיים והמתים, ורשמו את שני אורכי הגל הממוצעים. כדי לקבוע את רגישות הפרוטוקול, חשבו את היחס בין אורך הגל הממוצע של הפלורסצנציה החיובית של הגשש המולקולרי לתאים מתים, לבין האות החי הבלתי-ספציפי העצמי.
לבסוף, בחרו את הפרוטוקול האופטימלי שבו נצבעה הכמות הגבוהה ביותר של תאים מתים ללא הופעת צביעה לא ספציפית. בגרפים אלה מוצגים פלטי פיזור אור קדמי (forward scatter) וצידי (side scatter) מייצגים, עבור גודל תאי ומורכבות פנימית של תרבית אצומה של *M.aeruginosa* בשלב הלוגריתמי. ניתן לבצע סינון (Gating) על ידי עידון הנתונים בין נקודות מסוימות של פלט פיזור האור הקדמי.
פיקוכנין (Phycocyanin) מייצר אות חזק כאשר הוא נחקר באמצעות מקור אור אדום, שניתן להשתמש בו כדי לבצע סינון (gating) נוסף של האוכלוסיות הרלוונטיות. על בסיס פיזור האור קדימה (forward light scatter) והאותות הפלואורסצנטיים, ניתן לסנן את הנתונים מהפלט המקורי לנתונים ספציפיים של דגימת ה-M.aeruginosa לצורך ספירת תאים סופית. כאשר מערבבים בקרות חיות בעלות פיגמנט גבוה ובקרות מתות בעלות פיגמנט נמוך, ההסטה היורדת בפלואורסצנציה העצמית הופכת לברורה.
בתאים עם ממברנה פגומה, גששי חומצות הגרעין מייצרים אות נוסף שניתן להבחין בו באמצעות ציטומטריית זרימה ולאששו בהמשך באמצעות מיקרוסקופיית אפי-פלואורסצנציה. ההבחנה הפלואורסצנטית בין תאים חיים למתים עולה עם הזמן בין הריכוזים 0.05 ו-0.5 micromolar, אך יורדת בין הריכוזים one ו-100-micromolar עבור שני הגששים. למעשה, נראה כי הריכוז האופטימלי עבור גשש חומצות הגרעין הירוק הוא 0.5 micromolar עם זמן אינקובציה של 30 דקות.
עבור הגשושית לחומצות גרעיניות בצבע כתום, הריכוז האופטימלי הוא 1 µM לדגירה של 10 דקות. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים את האופטימיזציה עבור כל גשושית מולקולרית ביום אחד, במידה והיא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור את הגשושיות בסביבה יציבה, תחת תנאי טמפרטורה, pH ותאורה מתאימים.
לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום המיקרוביולוגיה לחקור את ההטרוגניות של קהילות פיטופלנקטון. לאחר צפייה בסרטון, אמורה להיות לכם כעת הבנה טובה לגבי הדרך לפיתוח פרוטוקול אופטימלי להערכת פיזיולוגיה תאית באמצעות ציטומטריית זרימה וגששים מולקולריים. זכרו כי עבודה עם גששים מולקולריים ואורגניזמים רעילים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה, כגון לבישת ציוד מגן אישי (P.P.E) מתאים והבנה מלאה של חומרי COSHH.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לניתוח מצבים פיזיולוגיים של ציאנובקטריות באמצעות ציטומטריה של זרימה וגששים מולקולריים. השיטה שואפת לקבוע במדויק את שיעור התמותה של תאים בתוך אוכלוסיות מיקרוביאליות, תוך התייחסות לאתגרים הנובעים מהטרוגניות של התאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ציטומטריה זרימה
רקע
- אוכלוסיות מיקרוביאליות מראות הטרוגניות תאית משמעותית.
- ציטומטריית זרימה יכולה להעריך מצבים פיזיולוגיים, אך התוצאות משתנות בין מינים שונים.
- מדידה מדויקת של תמותת תאים היא קריטית להבנת קהילות מיקרוביאליות.
- גשים פלואורסצנטיים מותאמים יכולים לשפר את הניתוח ברמת התא הבודד.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהימן להערכת פיזיולוגיה של ציאנובקטריות.
- שיפור הדיוק של קביעת תמותת תאים.
- הנגשת ניתוח בזמן אמת של מצבים פיזיולוגיים בציאנובקטריות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ציטומטריית זרימה לניתוח תאים.
- גששים מולקולריים להבחנה בין מצבים פיזיולוגיים.
- אופטימיזציה של הפרוטוקול להשגת תוצאות מדויקות.
- הדגמה על ידי סטודנט לדוקטורט במעבדת ציטומטריה.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מבדיל ביעילות בין מצבים פיזיולוגיים בציאנובקטריות.
- הושגה קביעה מדויקת של תמותיות התאים.
- ניתוח בזמן אמת סיפק תובנות לגבי התנהגות מיקרובית.
- התוצאות תומכות בהבנתה של אוכלוסיות ציאנובקטריות.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח משפר את ניתוח הפיזיולוגיה של ציאנובקטריות.
- הוא נותן מענה למגבלות קודמות במדידת תמותות של תאים.
- ניתן ליישם שיטה זו במגוון מחקרים מיקרוביאליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
הערכה מדויקת של חיוניות תאית במערכות מיקרוביאליות תומכת בתיקוף יעדים בשלב מוקדם, על ידי מתן אפשרות לסריקה פנוטיפית מהימנה והפחתת סיכונים מכניסטיים. ציטומטריה של זרימה (Flow cytometry) עם גששים מולקולריים אופטימליים מספקת נתונים כמותיים ברזולוציה של תא בודד, המשפרים את הביטחון החזוי במערכות לזיהוי מובילים (lead identification). גישה זו נותנת מענה לאתגרי ההטרוגניות בביולוגיה של גילוי, ומסייעת בקבלת החלטות מבוססות נתונים של go/no-go, ובכך מפחיתה סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים בקווי פיתוח של תרופות אנטי-מיקרוביאליות או אנטי-זיהומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינת היפותזות טיפוליות על ידי הבחנה בין תאים חיוניים לתאים שאינם חיוניים באוכלוסיות מיקרוביאליות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות הערכת שלמות הממברנה בעזרת גששי SYTOX Green ו-SYTOX Orange.
- ערך ניבוי: ריכוזי גששים אופטימליים (0.5 µM ירוק, 1.0 µM כתום) ממזערים תוצאות שגויות שליליות וצביעה לא ספציפית, ובכך משפרים את מהימנות הבדיקה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: יוצרת קריאות פלואורסצנציה סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור סריקת תרכובות בסריקה רחבה (high-throughput) בגילוי חומרים אנטימיקרוביאליים.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה מדויקת של ספיגת הגשש כמשתנה תלוי לצורך מידול תגובה למינון.
- قابליות להרחבה: אופטימיזציה של הפרוטוקול ב- Microcystis aeruginosa מספקת מסגרת ניתנת להעברה למערכות ציאנובקטריאליות או מיקרוביאליות אחרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תומך במידול פרה-קליני של יעילות אנטימיקרוביאלית על ידי כימות תמותה מושרית-תרכובת בפתוגנים המטרה.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין סריקת חיוניות בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות נקודות קצה עקביות המבוססות על פלווציטומטריה.
- קידום מותאם סיכון: מפחית עמימות מכניסטית באופטימיזציה של תרכובות מובילות על ידי אספקת נתונים פיזיולוגיים של תא בודד בזמן אמת.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת תובנות מכניסטיות המנחות החלטות לגבי קידום התרכובות.
- ביולוגיה של הגילוי: מסייעת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתאם בין טיפול בתרכובת לבין שינויים בחיוניות התאית.
- סריקה: מספקת סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות אופטימיזציה של פרמטרי ריכוז ודגירה של הגשוש.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות פלואורסצנציה כמותיות המאפשרות השוואה סטטיסטית בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: תומכת בהתאמה של סמנים ביולוגיים על ידי קישור קריאות של שלמות הממברנה למנגנון הפעולה של התרכובת.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה רב-שימושית של ציטומטריה הישמה על פני מטרות מיקרוביאליות בתוכניות אנטי-זיהומיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת קריאות שגויות של חיוניות באמצעות אופטימיזציה של הגשש.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה בין מעבדות באמצעות ריכוזי גשש וזמני דגירה מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של תרכובות חסרות פעילות ספציפית למטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכונים על ידי זיהוי תרכובות בעלות השפעות אנטי-מיקרוביאליות אמיתיות לעומת ארטיפקטים של הבדיקה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהפעלת ציטומטריה זרימה ובפיצוי פלואורסצנציה עבור גילוי רב-פרמטרי.
- תלוי בגישה לציטומטרים של זרימה התואמים לייזר של 488 nm ובערוצי גילוי מתאימים לצבעי SYTOX.
- מחייב סטנדרטיזציה של הפרוטוקול בין צוותים כדי להבטיח טיפול, אחסון ויישום עקביים של הגשושית.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת השיטה למודלים בקטריאליים גרם-חיוביים או גרם-שליליים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון רעילות של הגשושית והצורך בבידוד בטיחותי ביולוגית בעבודה עם אורגניזמים רעילים כמו Microcystis aeruginosa.
