Name: מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: למד שיטה לייצור חלבוני ממברנה חיצונית מסוג β-חבית בכמויות מיליגרם לצורך קריסטליזציה וקביעת מבנה. הטכניקה מאפשרת חקר קיפול והעברת חלבוני ממברנה בבקטריות גראם-שליליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות להרווי סיליה מ-CNRS על אספקת תמונות ה-UV ולכריס דטמר וגארת' סימפסון מהמחלקה לכימיה באוניברסיטת פרדו על אספקת תמונות SONICC. ברצוננו להודות למימון מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות ותוכנית המחקר התוך-כיתתי במכונים הלאומיים לבריאות. בנוסף, ברצוננו להכיר במימון נוסף מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (A.M.S. ו-C.J.), המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (N.N. 1K22AI113078-01), והמחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת פרדו (N.N.).

<ol><li>Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins+in+bacteria+and+eukaryotes%3A+evolutionary+conservation+and+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).</li>
<li>Ricci, D. P., Silhavy, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bam+machine%3A+A+molecular+cooper%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The Bam machine: A molecular cooper.</a> Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).</li>
<li>Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Barrel+membrane+protein+assembly+by+the+Bam+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Biochem%22%5BJournal%5D)">beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex.</a> Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins.</a> Nature. 501, 385-390 (2013).</li>
<li>Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+YaeT%3A+conformational+flexibility+and+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition.</a> Structure. 16, 1873-1881 (2008).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+an+essential+component+of+the+outer+membrane+protein+assembly+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine.</a> Science. 317, 961-964 (2007).</li>
<li>Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+energetic+basis+of+folded-protein+transport+by+the+FimD+usher%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher.</a> Nature. 496, 243-246 (2013).</li>
<li>Phan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+FimD+usher+bound+to+its+cognate+FimC-FimH+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate.</a> Nature. 474, 49-53 (2011).</li>
<li>van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+long-chain+fatty+acid+transporter+FadL%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL.</a> Science. 304, 1506-1509 (2004).</li>
<li>Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+biology+of+beta-barrel+membrane+proteins%3A+a+summary+of+recent+reports%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports.</a> Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-dependent+transporters%3A+regulation%2C+structure%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function.</a> Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).</li>
<li>Siburt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+transferrin+bound+iron%3A+protein-receptor+interactions+involved+in+iron+transport+in+N.+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae.</a> Metallomics. 1, 249-255 (2009).</li>
<li>Cornelissen, C. N., Hollander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-Dependent+Transporters+Expressed+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae.</a> Front in Micro. 2 (117), (2011).</li>
<li>Dautin, N., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+in+gram-negative+bacteria+via+the+autotransporter+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway.</a> Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).</li>
<li>Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+V+secretion%3A+mechanism%28s%29+of+autotransport+through+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane.</a> Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).</li>
<li>Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchanan%2C+SK+%22Comprehensive+Biophysics%22">Comprehensive Biophysics</a>. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).</li>
<li>Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+colicin+I+receptor+bound+to+the+R-domain+of+colicin+Ia%3A+implications+for+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import.</a> EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).</li>
<li>Yamashita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ail-mediated+adhesion+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis.</a> Structure. 19, 1672-1682 (2011).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).</li>
<li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li>
<li>Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+major+envelope+protein+from+Escherichia+coli.+Regular+arrangement+on+the+peptidoglycan+and+unusual+dodecyl+sulfate+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding.</a> J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).</li>
<li>Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarnard%2C+TJ+%22Curr+Prot+in+Prot+Science%22">Curr Prot in Prot Science</a>. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19(2007).</li>
<li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+using+the+lipidic+bicelle+method%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method.</a> JoVE. , e3383(2012).</li>
<li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , e4000(2012).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , (2011).</li>
<li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+refolding+of+an+80-kDa+iron+transporter+from+the+outer+membrane+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli.</a> Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).</li>
<li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-barrel+proteins+from+bacterial+outer+membranes%3A+structure%2C+function+and+refolding%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding.</a> Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).</li>
<li>Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+folding+proteins+into+membranes%3A+challenges+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+of+Biochem+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The process of folding proteins into membranes: challenges and progress.</a> Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).</li>
<li>Pautsch, A., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+outer+membrane+protein+A+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain.</a> Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).</li>
<li>Cowan, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+OmpF+porin+in+a+tetragonal+crystal+form%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form.</a> Structure. 3, 1041-1050 (1995).</li>
<li>Ujwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+A+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> PNAS. 105, 17742-17747 (2008).</li>
<li>Robert, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+factor+Omp85+recognizes+its+outer+membrane+protein+substrates+by+a+species-specific+C-terminal+motif%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Bio%22%5BJournal%5D)">Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif.</a> PLoS Bio. 4, e377(2006).</li>
<li>Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+C-terminal+insertional+signal+in+Gram-negative+bacterial+outer+membrane+proteins+species-specific+or+not%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?</a> BMC Genomics. 13, 510(2012).</li>
<li>Agah, S., Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in bicelles.</a> Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).</li>
<li>Ujwal, R., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles.</a> Methods. 55, 337-341 (2011).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cur+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).</li>
<li>Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacteriorhodopsin+at+1.55+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution.</a> J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).</li>
<li>Kato, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+channelrhodopsin+light-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel.</a> Nature. 482, 369-374 (2012).</li>
<li>White, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+agonist-bound+neurotensin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the agonist-bound neurotensin receptor.</a> Nature. 490, 508-513 (2012).</li>
<li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

β-חבית OMPs משמש תפקידים חיוניים חיידקים גראם שלילי, מיטוכונדריה כלורופלסטים והם יעדים חשובים לניתוח מבני המציעים שפע של מידע על מנגנונים מולקולריים מהותיים שהוא ממברנות החיצוני של האברונים השונים הללו. עם זאת, מייצרת מספיק דגימה לצורך ביצוע אנליזה מבנית אינו תמיד ברור ולכן, צינור כללי מוצג לייצור כמויות מספיקות של OMPs היעד β-חבית לקביעת מבנה, המסביר בפירוט את התהליך בונה לגבישים. בעוד הפרוטוקולים הללו נבדקו ונמצאו שיתאים למרבית OMPs מן חיידקים גראם שליליים, קיימות מגבלות, כי יש ...

β-חבית OMPs ניתן למצוא רק את הקרומים החיצוניים של המיטוכונדריה, כלורופלסטים, וחיידקים גראם שליליים 1-3. בעוד הם משמשים תפקידים דומים כמו חלבוני הסליל α, יש להם קפל שונה מאוד מורכב תחום β-חבית קרום מוטבעת מרכזי החל 8-26 אנטי במקביל β-גדילים עם כל גדיל להיות מחובר בטבורו שני גדילים שהכנות (איורים 1 ו -2). הגדילים הראשונים והאחרונים של תחום β-החבית אז אינטראקציה זה עם זה, כמעט באופן בלעדי בצורה אנטי-מקבילה (למעט VDAC המיטוכונדריה), כדי לסגור ולאטום את תחום β-החבית מן הקרום שמסביב. כל β-חבית OMPs לולאות תאיות של רצף משתנה ואורך אשר ממלאות תפקיד חשוב באינטראקציות ליגנד ו / או אנשי קשר חלבונים, עם הלולאות אלה לפעמים להיות גדולות כמו 75 שאריות, כגון נמצא transferrin Neisserial מחייב פרוהחלבון A (TbpA) 4. β-חבית OMPs יכול גם יש N-terminal או C- מסוף רחבות periplasmic המשמשים תחומים נוספים כמו לצורך הפעילות של החלבון (למשל, במה 5-7, FimD 8,9, פאדל 10). בעוד סוגים רבים של OMPs β-חבית קיימים 11, שני הסוגים הנפוצים יותר מתוארים להלן כדוגמאות עבור אלה פחות שמכיר את השטח, (1) מובילי תלויי TonB ו (2) autotransporters. TonB תלוי מובילים (למשל, FepA, TbpA, BtuB, Cir, וכו &#39;) הם חיוניים עבור יבוא מזין ומכילים תחום תקע N-terminal מורכב ~ 150 שאריות כי הוא נמצא תחוב בתוך בטרמינל C-22 גדילי β- תחום החבית מוטבע לתוך הקרום החיצוני 12 (איור 3). בעוד תחום תוסף זה מונע מצע מלעבור בחופשיות דרך התחום לחבית, מצע מחייב גורם לשינוי קונפורמציה בתוך תחום התקע הב מוביל היווצרות נקבובית (בין אם על ידי סידור מחדש את רדיו או על ידי פליטה חלקית / מלאה של התקע) אז מה שיכול להקל תחבורת מצע דרך הממברנה החיצונית לתוך periplasm. מובילי TonB התלוי חשובים במיוחד להישרדותו של כמה זנים פתוגניים של חיידקים גראם שליליים כגון meningitidis Neisseria שהתפתח מובילים מיוחדים לחטוף חומרים מזינים כגון ברזל ישירות 4,13,14 חלבוני מארח אנושיים. Autotransporters השייכים למערכת הפרשת סוג V של חיידקים גראם שליליים והם בטא חבית OMPs המורכבות של תחום β-חבית (בדרך כלל 12-גדילי כמו עם אסטה ו ESPP) ואת תחום הנוסע כי הוא גם מופרש או שהוצג בכנס פני השטח של התא 15,16 (איור 3). OMPs β-החבית אלה לעתים קרובות משמש תפקידים חשובים בהישרדות תא ארסי עם תחום הנוסעים המשרת גם בתור פרוטאז, adhesin, ו / או EF אחרfector שמתווך בפתוגנזה. שיטות מבנית כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, ספקטרוסקופיה NMR, במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מאפשרים לנו לקבוע מודלים עבור OMPs ברזולוציה אטומית אשר בתורו יכול לשמש כדי לפענח בדיוק איך הם מתפקדים בתוך הממברנה החיצונית. מידע שלא יסולא בפז מצב זה יכול לשמש לפיתוח תרופות חיסון אם זה אפשרי. לדוגמה, חלבון מחייב transferrin (TbpA) נמצא על פני השטח של Neisseria והוא נחוץ לצורך בפתוגנזה כי הוא נקשר transferrin אדם ישירות ולאחר מכן שואבת ומייבא את ברזל להישרדות משלו. ללא TbpA, Neisseria לא יכול לחטט ברזל מהמארח האדם ניתנים שאינם פתוגניים. לאחר המבנה הגבישי של transferrin אדם כבול TbpA 4 נפתר, זה הפך להיות הרבה יותר ברור איך שני חלבונים הקשורים, באילו אזורים של TbpA בתיווך האינטראקציה, מה שאריות היו חשובים להפקת ברזל על ידי TbpA, ואיך אפשר לפתח תרופה נגד Neisseria מיקוד TbpA. לכן, בהתחשב בחשיבות של OMPs β-לחבית גראם שלילי חיידקים להישרדות בפתוגנזה, כמו גם במיטוכונדריה ותפקוד הכלורופלסט, ואת הצורך במידע מבני נוסף על מעמד ייחודי זה של חלבונים בממברנה ואת המערכות שבן הוא פועלים , מוצגים פרוטוקולים כללי כשהמטרה להביע וטיהור OMPs היעד ברמות גבוהות לאפיון על ידי שיטות מבניות.

<table><tbody><tr><td>רובוט התגבשות</td><td>TTP Labtech, ארט רובינס-כל</td><td></td> <td>אחד צריך לעבוד כאן, למעט התגבשות LCP</td></tr><tr><td>PCR thermocycler</td><td>Eppendorf, BioRad-Media</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>ניו ברונסוויק, Infors HT-UV-vis</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ספקטרומטר</td><td>Eppendorf-SDS-PAGE</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מכשיר</td><td>BioRad</td><td>1645050, 1658005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE וג'לים מקוריים</td><td>BioRad, Life Technologies</td><td>4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Prime</td><td>GE Healthcare-AkTA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מטהר</td><td>GE Healthcare-מיקרוצנטריפוגה</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>אפנדורף-צנטריפוגה</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(מהירות נמוכה-בינונית)</td>בקמן-קולטר-אולטרה-צנטריפוגה <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(גבוהה מהירות)</td> רוטור <td>בקמן-קולטר-SS34</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>רוטור</td><td>Sorvall-Type</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>45 Ti רוטור</td><td>בקמן-קולטר-סוג</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>70 Ti רוטור</td><td>בקמן-קולטר-דונס</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>הומוגנייזר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06 435C</td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td></td><td></td> אבסטין-דיאליזה <td></td></tr><tr><td></td><td>כלי סיגמא</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td>LCP</td><td>המילטון, TTP</td> <td>Labtech-VDX</td><td></td></tr> <tr><td>24 צלחות באר</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>צלחות סנדוויץ'</td><td>Hampton Research, מידות מולקולריות</td><td>HR3-151, MD11-50 (MD11-53)</td><td></td></tr> <tr><td>גיליונות התגבשות</td><td>גרייס Grace Bio-Labs</td><td>875238</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep S300 HR עמודה</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1167-01</td><td></td></tr><tr><td>Q-Sepharose column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td></td></tr><tr><td>מסכי התגבשות</td> Hampton <td>Research, Qiagen, מידות מולקולריות-מזרק</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>אטום לגז (100 מ"ל)</td><td>המילטון&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

חלבוני ממברנה משרתים פונקציות חשובות בתאים כגון הובלת חומרים מזינים, תנועתיות, איתות, הישרדות ואלימות, אך מהווים רק ~1% אחוז מהמבנים הידועים. ישנם שני סוגים של חלבוני ממברנה, α-סליל וחבית β. בעוד שניתן למצוא חלבוני ממברנה α-סליליים כמעט בכל ממברנות התאים, ניתן למצוא חלבוני ממברנה β-חבית רק בקרומים החיצוניים של מיטוכונדריה, כלורופלסטים וחיידקים גרם שליליים. צוואר בקבוק נפוץ אחד במחקרים מבניים של חלבוני ממברנה באופן כללי הוא קבלת מספיק דגימה טהורה לניתוח. בתקווה לסייע למעוניינים לפתור את המבנה של חלבון הממברנה החיצונית האהוב עליהם β חבית (OMP), מוצגים פרוטוקולים כלליים לייצור OMPs β חבית מטרה ברמות שימושיות לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ו/או ספקטרוסקופיה NMR. כאן, אנו מתארים עיצוב מבנה הן לביטוי טבעי והן לביטוי בגופי הכללה, טיהור באמצעות תג זיקה והתגבשות באמצעות טכניקות סינון חומרי ניקוי, ביסל ופאזה מעוקבת ליפידית. פרוטוקולים אלה נבדקו ונמצאו יעילים עבור רוב ה-OMPs מחיידקים גראם-שליליים; עם זאת, ישנן כמה מטרות, במיוחד עבור מיטוכונדריה וכלורופלסטים שעשויות לדרוש שיטות אחרות לביטוי וטיהור. ככזה, השיטות כאן צריכות להיות ישימות עבור רוב הפרויקטים הכוללים OMPs מחיידקים גראם-שליליים, אך רמות הביטוי וכמות הדגימה המטוהרת ישתנו בהתאם ל-OMP היעד.

YiuR הוא טרנספורטר ברזל תלוי TonB כי הוא מטרת חיסון משוערת נגד pestis Yersinia. זה זוהה במקור באמצעות assay microarray. הנה, את הצעדים שננקטו כדי לקבוע את המבנה של YiuR באמצעות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן מתוארים (איור 9). שיבוט, את רצף הדנ&quot;א של YiuR (מינוס רצף האות N-terminal) היה PCR מוגבר של הדנ&quot;א הגנומי subcloned לתוך וקטור המכיל רצף האות pelB N-מסוף תג זיקה 10x-היסטידין ואחריו אתר פרוטאז TEV. עבור ביטוי,...

β חלבוני ממברנה חיצונית (OMPs) משרתים פונקציות רבות בתוך הממברנות החיצוניות של חיידקים גראם-שליליים, מיטוכונדריה וכלורופלסטים. כאן, אנו מקווים להקל על צוואר בקבוק ידוע במחקרים מבניים על ידי הצגת פרוטוקולים לייצור OMPs של β חביות בכמויות מספיקות לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או ספקטרוסקופיה NMR.

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

המטרה הכללית של שיטה זו היא להשיג כמויות של מיליגרמים של חלבונים בעלי מבנה חבית-בטא (beta-barrel) מהממברנה החיצונית, אשר יתגבשו ויאפשרו עקיפה. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום קיפול והובלה של חלבוני ממברנה, כגון האופן שבו חלבוני חבית-בטא מוחדרים לממברנות של תאים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא יציבה (robust) עבור חלבוני חבית-בטא.בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים שיטה זו ייתקלו בקשיים, מכיוון שבחירת דטרגנטים לניקוי, לקריסטליזציה ולדה-פרקציה היא מאתגרת. ג'רמי גורין (Jeremy Guerin), פוסט-דוקטורנט מהמעבדה של סוזן ביוקנן (Susan Buchanan), ידגים את ההליך, יחד איתי ועם עמיתיי למעבדה. התחילו את ההליך בבנייה של וקטור ביטוי T7 המכיל את הגן של חלבון ממברנה חיצונית (OMP), המטרה המותאמת לקודונים, עבור ביטוי in vivo לממברנה, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.הפוך את הקונסטרקט לזן חיידקים להבעה על ידי העברת מיקרוליטר אחד של פלסמיד ל-50 מיקרוליטר של תאי BL21(DE3) כימית כשירים, וערבב בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. דגור על קרח למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, בצע הלם חום ב-42 °C למשך 30 שניות באמצעות מקבץ מים, ולאחר מכן החזר לקרח לדקה אחת.הוסיפו מיליליטר אחד של מצע SOC שחומם מראש ונערערו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת במהירות של 1000 RPM באמצעות אינקובטור עם נקנוע שולחני. לאחר הדגירה, העבירו 100 microliters של תאים לצלחות LB Agar המכילות אנטיביוטיקה מתאימה, והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, במצב הפוך. לאחר מכן, בצעו בדיקות ביטוי בקנה מידה קטן על ידי הזרקת מושבה בודדת לתוך 5 milliliters של תרבית LB המכילה אנטיביוטיקה.חזרו על הפעולה עבור חמישה עד 10 מושבות. גדלו בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור עד לצפיפות אופטית ב-600 nm של כ-0.6. השרו ביטוי של ה-OMP המטרה על ידי הוספת 5 µL של IPTG בריכוז 1 M לכל מבחנה של תרבית, ואפשרו גידול למשך שעה עד שעתיים נוספות.כדי להשוות את רמות הביטוי עבור כל המושבות, סבב במרכזית מיקרוצנטריפוגה מיליליטר אחד מכל תרבית למשך דקה אחת ב-15,000 ×g. הסר את הנוזל העליון (supernatant) ותלה את התאים מחדש ב-200 µL של תמיסת טעינה 1X SDS-PAGE. חמם בטמפרטורה של 100 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן סבב שוב במרכזית ב-15,000 ×g למשך חמש דקות.נתחו את הדגימות באמצעות SDS-PAGE על ידי פפיטציה של 20 µL לכל באר בג'ל של 10%. הריצו את הג'ל למשך 35 דקות במתח קבוע של 200 V. לבסוף, קצרו את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-6000 ×g למשך עשר דקות.יש להשהות מחדש את התאים בבופר ליזיס ביחס של חמישה מיליליטרים לגרם של משחת תאים. יש ל lysed את התאים באמצעות French press או הומוגניזר תאים. לאחר מכן, יש לסבב את התאים שעברו ליזיס ב-15,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר תאים שלא עברו ליזיס ושאריות תאים.העבירו את supernatant לשפופרת נקייה וסבבו שוב בצנטריפוגה במהירות גבוהה למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. המשקע שיתקבל הוא פראקציית הממברנה, המכילה את החלבון המבוקש. השתמשו בהומוגניזר Dounce כדי לסבב מחדש את פראקציית הממברנה.ראשית, העבירו את הממברנות ולאחר מכן הוסיפו באפר המסה (solubilization buffer) בריכוז 2X ללא דטרגנט. שפכו את הממברנות לאחר השסעסוּע (resuspended) למבחנה מדורגת והוסיפו מים עד להגעה לריכוז סופי של 1X של באפר ההמסה. העבירו את הדגימה לכוס כימית והוסיפו דטרגנט באיטיות עד לריכוז סופי של כ-10 פעמים ריכוז המיסלה הקריטי (critical micelle concentration).לאחר מכן, ערבבו למשך 0.5 עד 16 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, בהתאם לקלות שבה החלבון המטרה נחלץ מהממברנות. לבסוף, סבבו במערך צנטריפוגה את הדגימה המומסת ב-300,000 $\times$g למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הכינו עמודת IMAC של מיליליטר אחד עד חמישה, או השתמשו בעמודה מוכנה מראש.בצע את שלבי הכרומטוגרפיה הבאים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שטוף במים כדי להסיר עקבות של חומרים משמרים. במידה ונעשה שימוש במערכת טיהור אוטומטית, התקן את העמודה על פי הוראות היצרן.הכינו 500 מיליליטר של בופר IMAC A ללא אימידזול ו-250 מיליליטר של בופר IMAC B עם אימידזול בריכוז של מולרי 1. בצעו שיווי משקל לעמודת ה-IMAC באמצעות 10 נפחי עמודה של בופר IMAC A. הוסיפו אימידזול לדגימת החלבון עד לריכוז סופי של 25 מילימולרי וערבבו. לאחר מכן, העמיסו את הדגימה על עמודת ה-IMAC ששיוויה למשקל בקצב של שני מיליליטר לדקה.אספו את נוזל השטיפה (flow-through). לאחר מכן, שטפו את עמודת ה-IMAC בחמישה נפחי עמודה של ריכוזים עולים של imidizole, תוך שימוש בבופר B. אספו את השטיפות במנות של שני מיליליטר. אלוטו את הדגימה בריכוז סופי של 250 millimolar למשך חמישה נפחי עמודה, ואספו את הדגימה האלואוטידית במנות של שני מיליליטר.נתחו את ה-flow-through, את פראקציות השטיפה ואת פראקציות האלוציה באמצעות אנליזת SDS-PAGE בהתבסס על הבליעה שלהן ב-280 ננומטר. אספו את הפראקציות המכילות את ה-OMP beta-barrel המטרה, כפי שאושר באנליזת SDS-PAGE. לאחר מכן, הסירו את תג ה-6X histadine על ידי הוספת TEV protease לדגימה המאוצבת ודגירה למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תוך כדי נטילה עדינה.טען שוב את תמיסת הפרוטאז של הדגימה על עמודת IMAC כדי להפריד את ה-OMP מסוג beta-barrel המיועד מהתגים ששופרו ומכל דגימה שלא שופרה. החלק העובר (flow-through) יכיל את הדגימה ששופרה ושאינה כוללת את התג. כדי להתכונן לגביש, טען את הדגימה על עמודת סינון ג'ל לתוך בופר המכיל את הדטרגנט שישמש לגביש.אספו פרקציונים בנפח של מילליטר אחד ונתחו אותם באמצעות SDS-PAGE בהתבסס על בליעתם באורך גל של 280 ננומטר.אגדו את הפרקציונים המכילים את חלבון המטרה, ולאחר מכן רכזו אותם לכ-10 מיליגרם למילליטר. לפני הכנת הדגימות, הרכיבו את מכשיר הג'ל.השתמשו במקצב ריצה של ג'ל שקוירר מראש או הריצו את הג'ל בחדר קר. סננו את הדגימה באמצעות מסנן צנטריפוגלי של 0.22 מיקרון כדי להסיר חלקיקים ומשקעים. לאחר מכן, העבירו בפיפט 0.25 microliters מהדגימה לשתי מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter.סמנו את אחד כ-"boiled" ואת השני כ-"RT". לאחר מכן, הוסיפו 9.75 µL של תחבירי הדגימה לכל מבחנה וערבבו באמצעות פיפטינג. לשתי הדגימות, הוסיפו גם 10 µL של 2X SDS loading buffer וערבבו בעדינות באמצעות פיפטינג. הרתיחו את דגימת ה-"boiled" בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות, והשאירו את דגימת ה- "RT" בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, סובב את הדגימה המורתחת לזמן קצר. לאחר מכן, העמס 20 µL משתי הדגימות על ג'ל native שהורכב מראש. לאחר הרצת הג'ל במשך 60 דקות במתח קבוע של 150 volts, הוצא את הג'ל והשרה אותו בתמיסת צביעה כדי להציג את התוצאות.יש להמשיך בניסיונות התגבשות בדטרגנט, בתאי-דו-ממד (bi-cells) ובפאזה קובית ליפידית, תוך שימוש בשיטות Jove שפורסמו בעבר. ראשי התגבשות נבחנים תחת מיקרוסקופ UV כדי לוודא שהגבישים הם אכן חלבוניים ולא מלחים, ליפידים או דטרגנטים. גבישים מובילים נסרקים באמצעות מקור קרינה ביתי או בסינכרוטרון כדי לבדוק אם הגבישים מפיקים עקיפה.לאחר איסוף נתונים מקריסטלים בעלי עקיפה טובה, יש לעבד את הנתונים באמצעות תוכנת עיבוד, כגון HKL2000. העבירו את הקבצים שהתקבלו לחבילת תוכנה לקביעת מבנה, כגון Phoenix Suit, ובצעו החלפה מולקולרית (molecular replacement) לצורך שלב השבירה הראשוני וקביעת המבנה. המבנה הגבישי של YIUR נקבע ברזולוציה של 2.6 Angstrom באמצעות שיטה זו.לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה תוך שבועיים, אם היא מבוצעת כהלכה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הביטוי והטיהור של חלבוני ממбраנה חיצונית של חיידקים עבור מחקרים מבניים.

from-constructs-to-crystals-towards-structure-determination-barrel

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

בזאת הוא תיאר את ההליך מיושם קבוצת מבניים ותפקודיים ביולוגיה קאפרי ממברנה להגדיר באופן ידני ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה ב mesophases lipidic.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

הערכת דו ממדי (2D) ניסויים התגבשות להקמת מערכי חלבון הורה הממברנה היא משימה קריטית מאוד קשה קריסטלוגרפיה אלקטרונים. כאן אנו מתארים את הגישה שלנו ההקרנה וזיהוי 2D גבישים של חלבונים בממברנה קטן בעיקר בטווח של 15 - 90kDa.

הערכת דו מימדי ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה קטנים ללימודי לביולוגיה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונים

במסמך מתואר גישה רובוטית להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בmesophases lipidic לשימוש בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular ה-X. שלושה רובוטים המסוגל להתמודד mesophase הצמיג ודביק חלבון העמוס האינטגרלי לשיטה הם הציגו.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

במסמך מתואר נהלים המיושמים בממברנה קבוצת ביולוגיה המבנית ופונקציונלית לגבישי חלבון קרום קציר וcryo-מגניב שגודלו בשלבים עוקבים וספוג lipidic לשימוש בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן קאפרי.

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בפיתוח תרופה. רודף מטרות מרובות במקביל מגדיל מאוד את הסיכוי להצלחה לגילוי עופרת. המאמר הבא מדגיש עד כמה מרכז ג'נומיקס המבני סיאטל למחל זיהומיות מנצל גישה רב יעד לקביעת גן למבנה של שפעת PB2 מקטע.

גישת עיבוד מקביל רב היעד לקביעת גנטי למבנה של פולימראז שפעת PB2 מקטע

אנו מתארים מסגרת המשלבת ניתוח ביוכימי וחישובי פשוט כדי להנחות את האפיון וההתגבשות של תחומי סליל מפותלים גדולים. ניתן להתאים מסגרת זו לחלבונים כדוריים או להרחיב אותה כדי לשלב מגוון טכניקות בעלות תפוקה גבוהה.

שילוב רטוב טכניקות מעבדה יבשות כדי להנחות את ההתגבשות של חלבונים מפותל, סליל גדולים המכיל

שיטה זו מתאר את שיבוט, הביטוי, ואת טיהור של Nsa1 רקומביננטי לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, רנטגן זווית קטנה פיזור (SAXS), והוא רלוונטי לניתוח המבני היברידית של חלבונים אחרים שניהם הורו, מגרה תחומים.

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

פרוטוקול זה פותח כדי ללמוד את המעבר dimer-dodecamer של TmPep1050, M42 aminopeptidase, ברמה המבנית. זהו צינור פשוט החל מטיהור חלבונים לעיבוד נתוני רנטגן. Crystallogenesis, אינדקס סט נתונים, והחלפה מולקולרית הודגמו באמצעות מקרה של מחקר, TmPep1050H60A H307A משתנה.

קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

שומנים חד-שכבתיים שימשו כבסיס ליצירת גבישי חלבון דו-ממדיים (דו-ממדיים) למחקרים מבניים במשך עשרות שנים. הם יציבים בממשק מי האוויר ויכולים לשמש כחומר תומך דק להדמיית אלקטרונים. כאן אנו מציגים את הצעדים המוכחים על הכנת monolayers השומנים למחקרים ביולוגיים.

הכנה לדוגמה באמצעות שיטת חד שכבתית שומנים למחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר מערך להתגבשות של טרנספורטר הסטרול ABCG5/G8. ABCG5/G8 משוחזר לאופניים לצורך התגבשות טיפה תלויה. הפרוטוקול אינו דורש חומרים או מצעים מיוחדים, מה שהופך אותו לנגיש וקל להתאמה בכל מעבדה לקביעת מבנה החלבון באמצעות קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.

התגבשות ABCG5/G8 בסביבת ביצלה ליפידית לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן

למד שיטה לייצור חלבוני ממברנה חיצונית מסוג β-חבית בכמויות מיליגרם לצורך קריסטליזציה וקביעת מבנה. הטכניקה מאפשרת חקר קיפול והעברת חלבוני ממברנה בבקטריות גראם-שליליות.

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

גלה סרטונים נוספים