מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשיג כמויות של מיליגרם של חלבוני חבית בטא של הממברנה החיצונית שיתגבשו ויתפרקו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הקיפול וההובלה של חלבון הממברנה, כגון כיצד מוחדרים חלבוני חבית בטא לקרומי התאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא חזקה עבור חלבוני חבית בטא.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, מכיוון שבחירת חומרי ניקוי לטיהור, התגבשות ושבירה היא מאתגרת. ג'רמי גרין, פוסט-דוקטורנט ממעבדתה של סוזן ביוקנן, ידגים את ההליך, בנוסף אלי ולעמיתים במעבדה. התחל הליך זה בבניית וקטור ביטוי T7 המכיל את חלבון הממברנה החיצונית האופטימלי של הקודון, או גן OMP, לביטוי in vivo לממברנה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הפוך את המבנה לזן ביטוי של חיידקים לביטוי על ידי פיפטינג מיקרוליטר אחד של פלסמיד ל-50 מיקרוליטר של תאים בעלי יכולת כימית BL21(DE3), וערבב בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. דגירה על קרח למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, יש לחמם בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות באמצעות אמבט מים, ולאחר מכן להניח בחזרה על הקרח למשך דקה אחת.

הוסף מיליליטר אחד של מדיה SOC מחוממת מראש ונער בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה ב-1000 סל"ד באמצעות חממת שייקר ספסל. לאחר הדגירה, צלחו 100 מיקרוליטר של תאים על לוחות LB Agar המכילים אנטיביוטיקה מתאימה ודגרו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, הפוך. לאחר מכן, בצע בדיקות ביטוי בקנה מידה קטן על ידי חיסון חמישה מיליליטר של LB המכיל תרבית אנטיביוטיקה עם מושבה אחת.

חזור על הפעולה במשך חמש עד 10 מושבות. לגדול ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר של כ-0 נקודה שש. לגרום לביטוי של OMP המטרה על ידי הוספת חמישה מיקרוליטר של IPTG טוחנת אחת לכל צינור תרבית ולאפשר לגדול שעה עד שעתיים נוספות.

כדי להשוות את רמות הביטוי עבור כל המושבות, צנטריפוגה מיליליטר אחד מכל תרבית למשך דקה אחת ב-15,000 פעמים G, באמצעות מיקרו-צנטריפוגה. הסר את ה-supernatant והשהה מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר טעינה של 1X SDS-PAGE. מחממים בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ואז שוב צנטריפוגה בחום של 15, 000 פעמים G למשך חמש דקות.

נתח את הדגימות באמצעות SDS-PAGE על ידי פיפטינג של 20 מיקרוליטר לכל באר של ג'ל של עשרה אחוזים. הפעל את הג'ל למשך 35 דקות ב -200 וולט קבוע. לבסוף, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה ב 6000 פעמים G למשך עשר דקות.

השעו מחדש את התאים במאגר ליזה ביחס של חמישה מיליליטר לגרם משחת תאים. ליזה את התאים באמצעות מכבש צרפתי או הומוגנייזר תאים. לאחר מכן, סובב את התאים הליזים ב-15,000 פעמים G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר תאים לא ליזים ופסולת תאים.

העבירו את הסופרנטנט לצינור נקי וצנטריפוגה שוב במהירות גבוהה למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. הגלולה המתקבלת היא חלק הממברנה המכיל את החלבון המעניין. בעזרת הומוגנייזר Dounce, השעו מחדש את שבר הממברנה.

ראשית, העבירו את הממברנות ולאחר מכן הוסיפו מאגר מסיס בריכוז פי 2 ללא חומר ניקוי. יוצקים את הממברנות התלויות לגליל מדורג ומוסיפים מים עד לריכוז סופי של מאגר מסיסות פי 1. העבירו את הדגימה לכוס והוסיפו חומר ניקוי לאט לריכוז סופי של בערך פי 10 מריכוז המיצלה הקריטי.

לאחר מכן, מערבבים במשך 0.5 עד 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס, תלוי באיזו קלות חלבון המטרה מופק מהממברנות. לבסוף, צנטריפוגה את הדגימה המסיסה ב-300,000 פעמים G למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. הכן עמודת IMAC של מיליליטר אחד עד חמישה מיליליטר או השתמש בעמודה ארוזה מראש.

בצע את שלבי הכרומטוגרפיה הבאים בארבע מעלות צלזיוס. יש לשטוף במים כדי להסיר עקבות של חומרים משמרים. אם אתה משתמש במערכת טיהור אוטומטית, התקן את העמודה בהתאם להוראות היצרן.

הכן 500 מיליליטר של מאגר IMAC A ללא אימידיזול ו-250 מיליליטר של מאגר IMAC B עם אימידיזול טוחנת אחת. איזון עמודת ה-IMAC באמצעות 10 נפחי עמודות של מאגר IMAC A. הוסף אימידיזול לדגימת החלבון לריכוז סופי של 25 מילי-מולרי וערבב. לאחר מכן, טען את הדגימה על עמודת ה-IMAC המאוזנת בשני מיליליטר לדקה.

אסוף את הזרימה. לאחר מכן, שטפו את עמודת ה-IMAC עם חמישה נפחי עמודות כל אחד של ריכוזים הולכים וגדלים של אימידיזול, באמצעות מאגר B.אסוף את השטיפות בשני שברים של מיליליטר. יש להוציא את הדגימה בריכוז סופי של 250 מילימולר עבור חמישה נפחי עמודות ולאסוף את הדגימה המנופחת בשני שברים של מיליליטר.

נתח את הזרימה, שברי הכביסה ושברי הפליטה באמצעות ניתוח SDS-PAGE בהתבסס על הספיגה שלהם ב-280 ננומטר. אסוף את השברים המכילים את ה-OMP של חבית הבטא היעד כפי שאומת על ידי ניתוח SDS-PAGE. לאחר מכן, הסר את תג ההיסטדין 6X על ידי הוספת פרוטאז TEV לדגימה המאוגדת ודגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין.

טען שוב את תמיסת הפרוטאז לדוגמה על עמודת IMAC כדי להפריד את ה-OMP של חבית הבטא היעד מהתגים המפוצלים וכל דגימה לא מחורצת. הזרימה תכיל את הדגימה המפוצלת שחסרה את התג. כדי להתכונן להתגבשות, טען את הדגימה על עמוד סינון ג'ל לתוך מאגר המכיל את חומר הניקוי שישמש להתגבשות.

אסוף שברים של מיליליטר אחד ונתח באמצעות ניתוח SDS-PAGE על סמך הספיגה שלהם ב-280 ננומטר. אסוף את השברים המכילים את חלבון המטרה, ולאחר מכן רכז לכ-10 מיליגרם למיליליטר. לפני הכנת הדגימות, הרכיבו את מכשיר הג'ל.

השתמש במאגר ריצת ג'ל מקורר מראש או הפעל את הג'ל בחדר הקירור. סנן את הדגימה באמצעות מסנן צנטריפוגלי של 0.22 מיקרון כדי להסיר חלקיקים ומשקעים. לאחר מכן, פיפטה 0.25 מיקרוליטר מהדגימה לשני צינורות מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

סמן אחד כמבושל"והשני כ-RT"לאחר מכן, הוסף 9.75 מיקרוליטר ממאגר הדגימה לכל צינור וערבב על ידי פיפטינג. לשתי הדגימות, הוסף גם 10 מיקרוליטר של מאגר טעינה 2X SDS וערבב בעדינות על ידי פיפטינג. מרתיחים את הדגימה המבושלת בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, תוך השארת דגימת ה- RT בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, סובב את הדגימה המבושלת בקצרה. לאחר מכן, טען 20 מיקרוליטר משתי הדגימות על הג'ל המקורי שהורכב מראש. לאחר הפעלת הג'ל במשך 60 דקות ב-150 וולט קבועים, הסר את הג'ל והשרה בתמיסת מכתים כדי לדמיין את התוצאות.

המשך בניסויי התגבשות בחומרי ניקוי, דו-תאים ופאזה מעוקבת ליפידית, תוך שימוש בשיטות Jove שפורסמו בעבר. ראשי התגבשות מוצגים תחת מיקרוסקופ UV כדי לוודא שהגבישים הם אכן חלבון ולא פתורים, שומנים או חומר ניקוי. גבישי עופרת נבדקים באמצעות מקור ביתי או בסינכרוטרון כדי לראות אם הגבישים נשברים.

לאחר איסוף נתונים של גבישים שמתפרקים היטב, מעבדים את הנתונים באמצעות תוכנת עיבוד, כגון HKL2000. העבר את הקבצים המתקבלים לחבילת תוכנה לקביעת מבנה, כגון Phoenix Suit, ובצע החלפה מולקולרית עבור שלבים ראשוניים וקביעת מבנה. המבנה הגבישי של YIUR נקבע ברזולוציה של 2.6 אנגסטרום בשיטה זו.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבועיים, אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבטא ולטהר חלבוני ממברנה חיצונית חיידקית למחקרים מבניים.