הערכת דו מימדי ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה קטנים ללימודי לביולוגיה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות את תנאי ההתגבשות הדו-ממדיים האופטימליים ביותר לקביעה מובנית של חלבוני ממברנה על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונית. זה מושג על ידי שימוש תחילה בחומר ניקוי תואם במהלך הטיהור כדי להמיס את החלבון משכבת השומנים הדו-שכבתית המקומית. השלב השני של ההליך הוא הוספת שומנים אקסוגניים והסרת חומר ניקוי באמצעות דיאליזה של תערובת חומרי הניקוי של שומני החלבון, וכתוצאה מכך גבישים דו-ממדיים בתנאים מבוקרים בקפידה.

השלב השלישי בהליך הוא להבהב, להקפיא את הדגימות למצב זגוגית. השלב האחרון של ההליך הוא איסוף נתונים על ידי cryo em. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המניבות את המבנה הסופי של החלבון באמצעות עיבוד תמונה חישובי של הנתונים.

היי, אני מהמעבדה. אני קובר את בית הספר לביולוגיה במכון הטכנולוגי של ג'ורג'יה. היי, אני טינה מפחדת.

אני ממעבדת ברי בבית הספר לכימיה וביוכימיה ומעבדת שמידט קריי בבית הספר לביולוגיה במכון הטכנולוגי של ג'ורג'יה. ואני מאט ג'ונסון מהמעבדה של אינגלבורג שמידט קריי בבית הספר לביולוגיה במכון הטכנולוגי של ג'ורג'יה. היום נראה לך נוהל להערכת ניסויי מקהלה דו-ממדיים על ידי em.

אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדה שלנו כדי לזהות ולייעל תנאי התגבשות דו-ממדיים. אז בואו נתחיל כדי להתחיל בהליך זה, מכינים דגימות מוכתמות לרעה על מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת נחושת 400 רשת מצופה פחמן או רשתות TEM. יש לזרוק שני מיקרוליטרים של דגימת הליפוזום של הפרוטאה מתחת לרשת TEM מכוסה פחמן ולדגור למשך 60 שניות.

אם הדגימה אינה מתפזרת באופן שווה, החלק אותה בעדינות עם הצד של קצה הפיפטה. הבלוק הבא מהקצה עם חתיכת נייר סינון ווטמן מספר ארבע. זה מבטיח הסרה אופטימלית של נוזלים ללא הסרה מוגזמת של ליפוזומי פרוטיאה, ומסייע בשימור שכבת הפחמן העדינה.

מיד לאחר הספיגה. מרחו שני מיקרוליטר של כתם אצטט המשתנה 1% לאחר 30 שניות, כתם מקצה הרשת. שוב, אם הדגימה מכילה ריכוזים גבוהים של גליצרול צמיג או סוכרוז, בדרך כלל בטווח של 10 עד 20%, מספר מחזורים של שטיפה של הרשת עם מאגר ללא גליצרול או סוכרוז לפני צביעה שלילית יכולים להועיל כדי לאפשר צביעה נכונה עם תמיסת הטייט המשתנה.

לאחר הכנת הרשתות, נעשה שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים כדי להמחיש את הדגימה בהגדלה נמוכה כדי להעריך את התפלגות מופע הממברנה והמורפולוגיה ואיכות הרשת הכוללת. לאחר מכן משתמשים בהגדלה גבוהה כדי להשיג תמונות ולבצע טרנספורמציות RIA של התמונות לזיהוי גבישים דו-ממדיים. כדי להתחיל רשת נמוכה במחזיק הדגימה של מיקרוסקופ האלקטרונים, כדי לקבל רושם ראשוני של התפלגות הממברנה הממוצעת, השתמש בהגדלת ביניים של 2000 עד 10,000 x.

שימו לב למידת התפוצה של הממברנות, המורפולוגיה שלהן וגודלן במחברת מעבדה. הקלט תצוגות מייצגות עם מצלמת CCD. לאחר מכן, במידת הצורך, התבונן בדגימות עם הגדלה נמוכה בטווח של בערך 400 עד 800 x כדי לקבל סקירה כללית של הרשתות.

זה יכול לספק מידע רב ערך להערכת הכנת הרשת על ידי חשיפת בעיות בריכוז הדגימה, פרוטיאה לא אחידה, פיזור ליפוזום ושבירה חלקית של סרט פחמן. זהה אזור עניין ברשת בהגדלה נמוכה או בינונית. לאחר מכן השתמש בהגדלה גבוהה כדי להעריך סדר אפשרי בממברנות שונות.

זה קריטי בשלבים המוקדמים של ניסויי התגבשות דו-ממדיים. על מנת לזהות ליפוזומי פרוטיאה מבטיחים עם אזורים מסודרים היטב וכדי לוודא את יכולת השחזור במהלך ניסויים מאוחרים יותר כדי לקבוע את הגדרת ההגדלה הגבוהה האופטימלית לסינון גבישים דו-ממדיים מתחילים בהגדלה בין 50,000 ל-60,000 x. בהתאם למידות הגביש הדו-ממדי וגודל תא היחידה, הגדרת ההגדלה הגבוהה עשויה להיות מופחתת עד 30,000 או להעלות עד 80,000.

כאן במיקום סמוך לאזור העניין של התמונה, אנו מורידים את המיקוד בערך במינוס 400 ננומטר ומעלה אם יש אי ודאות אם אזור העניין הוא אכן ממברנה. בדוק את הדגימה לאיתור חתיכות של סרט פחמן MICA או חפצים אחרים שעלולים להיחשב בטעות לליפוזומי פרוטיאה. התבונן גם בקצוות כדי להבחין בקיפול ממברנה ומורפולוגיה אופייניים.

לאחר מכן, בדוק את אזור העניין באמצעות מצלמת CCD. על ידי איסוף תמונת CCD בהגדרת ההגדלה הגבוהה האופטימלית, ייתכן שלא ניתן יהיה לראות את הסריג של חלבון ממברנה קטן יותר או הידרופובי בעיקר על ידי הערכה חזותית של תמונת ה-CCD עצמה. במקרה זה, התמונה כולה משמשת לטרנספורמציה מקוונת או ft.

עם זאת, אם המערך המסודר קטן, FT זה יכיל כמות משמעותית של רעש כדי לשפר את יחס האות לרעש, להקטין את גודל התמונה בקופסה, להזיז את התיבה המוקטנת מעל התמונה ולבצע רגל חיה, להתאים את פונקציית הגמא של ה-FT החי לזיהוי אופטימלי של מערכים מסודרים. ערך גמא גבוה מדי יכול לטשטש כתמים עקב תרומות רעש בעוד שערך נמוך מדי ימנע זיהוי נקודות חלשות יותר. צפו שהרזולוציה של הגבישים הדו-ממדיים המוכתמים שלילית תהיה בערך 15 אנגסטרומים ב-DFO של מינוס 400 ננומטר.

צפו לזהות סדר אחד עד שלושה של נקודות. שימו לב לחדות הכתמים ולכל פסיפס. גבישים דו-ממדיים של חלבון ממברנה קטן של 18 קילודלטון הם בגודל של עד כמה מיקרונים.

כתמים על ה-FTS תנועה חדה וקלה לזיהוי של תיבת ה-FT החיה מראים שהסריג רציף ללא פסיפס. ניתן לזהות את הסריג של חלבון גדול יותר עם תחום מסיס נרחב יותר על המסך הקטן של אוסף התמונות T-E-M-C-C-D ו-FT נחוצים כדי לקבל הערכה טובה יותר של איכות הסריג, כולל מאפיינים כגון רעש פסיפס ב-FT של פרוטיאה לא מסודרת. ליפוזום עלול להיחשב בטעות כנקודות תורפה כדי לקבוע אם הכתמים נובעים מגבישי חלבון דו-ממדיים קטנים או מרעש.

הזיזו את התיבה עבור הרגל החיה. אם הכתמים נעלמים מיד הם רעש, אך אם נשארים ללא שינוי אפילו על פני שטח קטן, סביר להניח שגבישים קיימים מכיוון שגבישי שומנים מציגים מורפולוגיה ורגל מובחנים. ניתן לזהות את גבישי השומנים הללו גם על ידי בדיקה ויזואלית של תמונה וגדלי תאי יחידה עקביים.

משקעים יכולים להתרחש בניסויים ראשוניים. בדיקה בהגדלה גבוהה משמשת להבחנה בין משקעי חלבון לאגרגטים של שומנים. במקרה של אגרגטים של שומנים, ייתכן שבנייה מחדש אכן התרחשה, והניסויים הבאים ידרשו רק התאמה של הפרמטרים הדרושים כדי להגדיל את גודל הממברנה ולייצר סדר במקום לגרום לבנייה מחדש ב-30,000 עד 50,000 x.

הקצוות של מבנים כהים אלה מגלים שהם מורכבים מממברנות ללא חלבון. דגימות משקעים בתנאים אופטימליים יכילו אחוז גדול של גבישים דו-ממדיים. אין צורך לשאוף למראה הומוגני של ממברנות מכיוון שהגבישים הדו-ממדיים הגדולים והמסודרים ביותר נבחרים חזותית לאיסוף נתונים.

סוגים אלה של דגימות יזוהו בקלות כאשר התגבשות דגימות כאלה משמשות לאיסוף נתוני cryo EM כדי להביא למספר המרבי של תמונות ברזולוציה גבוהה. אנו רק נראה לך כיצד לסנן גביש דו-ממדי של חלבוני זיכרון קטנים על ידי TEM בעת ביצוע הליך זה. חשוב לזכור להיות יסודי כדי לא להתעלם ממצב התגבשות מבטיח מכיוון שכבר השקעת כמות משמעותית של זמן ומאמץ עד לנקודה זו.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.