Name: גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 22 min
Description: למד את שיטת in meso לגיבוש חלבוני ממברנה במזופזות ליפידיות לקביעת מבנה קריסטלוגרפי. הפרוטוקול מדגים ערבוב חלבונים וליפידים, הכנת צלחות גבישה ותנאי אינקובציה אופטימליים למחקר ביולוגיה מבנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ישנם רבים אשר תרמו לעבודה זו ורובם מן הקרום קאפרי לביולוגיה מבנית קבוצה פונקציונלית, שניהם חברים בעבר ובהווה. כדי להרחיב את כל מה שאנחנו החם תודה והערכה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי קרן המדע אירלנד (07/IN.1/B1836), המכונים הלאומיים לבריאות (GM75915), ואוניברסיטת לימריק.

<ol><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+diagram+of+the+monoolein%2Fwater+system%3A+metastability+and+equilibrium+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter%2C+BtuB%2C+at+1.95+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li>
<li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+to+move%3A+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li>
</ol>

השלב מעוקב היא סביבה עדין דינמי שיכול להשתנות עם שינוי דרסטי של מספר משתנים. אי אפשר לתת תיאור של תוכנית ההתקנה של ניסויים טווינה התגבשות במצב ידני המתאר את כל בעיות פוטנציאליות. עם זאת, קשיים רבים ניתן להימנע על ידי תרגול הטכניקה לפני החלת אותו חלבון פתרונות יקרים באמצעות התמתנות הלחץ המופעל על מזרקים במהלך ערבוב. בוצע כהלכה, שיטת טווינה יכולה להניב גבישים של מגוון רחב של חלבונים, מספר המהווה בהתמדה. התיאור שניתן כאן ההתקנה של ניסויים טווינה התגבשות מתמקדת במצב הידני. התהליך יכול להיות, ולעתים קרובות הוא שונה כדי להקל על ההתקנה האוטומטי של צלחות התגבשות באותם מקרים הדורשים בקנה מידה גדול הקרנה של התגבשות התנאים.

* פרטים נוספים עבור עיבוד משלו מצמד צמצם שלך בורה ניתנים הפניה 3.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות mesophases lipidic

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

פרוטוקול מפורט של גיבוש חלבונים בממברנה באמצעות mesophases lipidic מתואר. לשיטה זו היו שונות המכונה בשלב מעוקב lipidic או בשיטת טווינה. השיטה הוכח להיות צדדי למדי, כי זה כבר נעשה שימוש כדי לפתור רנטגן קריסטלוגרפיים מבנים של חלבונים ו אוקריוטים פרוקריוטים, חלבונים, כי הם monomeric, הומו ו הטרו multimeric, chromophore המכילים chromophore ו-בחינם, אלפא סליל ו - בטא חבית חלבונים. ההצלחות האחרונות משתמש התגבשות טווינה הם האנושי מהונדסים Beta2-adrenergic ו אדנוזין A2A G-חלבון בשילוב קולטנים. הפרוטוקולים מוצגים לשחזר את החלבון לתוך הממברנה mesophase monoolein מבוססות, ואת להקמת crystallizations במצב הידני. צעדים נוספים בתהליך הכולל, כגון קצירת גביש, יש לטפל במאמרים וידאו עתידיות. הזמן הדרוש כדי להכין את mesophase חלבון טעון להקים צלחת התגבשות ידני הוא כשעה.

בזאת הוא תיאר את ההליך מיושם קבוצת מבניים ותפקודיים ביולוגיה קאפרי ממברנה להגדיר באופן ידני ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה ב mesophases lipidic.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

מתואר פרוטוקול מפורט לגבי קריסטליזציה של חלבוני ממברנה באמצעות מזופאזות ליפידיות. שיטה זו כונתה בדרכים שונות כ-...

crystallizing-membrane-proteins-for-structure-determination-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הערכת דו ממדי (2D) ניסויים התגבשות להקמת מערכי חלבון הורה הממברנה היא משימה קריטית מאוד קשה קריסטלוגרפיה אלקטרונים. כאן אנו מתארים את הגישה שלנו ההקרנה וזיהוי 2D גבישים של חלבונים בממברנה קטן בעיקר בטווח של 15 - 90kDa.

הערכת דו מימדי ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה קטנים ללימודי לביולוגיה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונים

הפרוטוקולים מתארים את הצעדים החיוניים לקבלת איכות עקיפה גבישים של חלבון ממברנה החל הכינון מחדש של החלבון בשלב מעוקב lipidic (LCP), מציאת התנאים הראשוניים עם LCP-FRAP טרום התגבשות מבחני, הגדרת ניסויים התגבשות LCP וקריסטלים קציר .

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Bicelles הם תערובות שומנים / amphiphile כי לשמור על חלבונים בממברנה (הפרלמנט) בתוך bilayer השומנים אבל יש שלב התנהגות ייחודית המאפשרת תפוקה גבוהה סינון על ידי רובוטים התגבשות. טכניקה זו ייצרה בהצלחה מספר ברזולוציה גבוהה מבנים משני מקורות פרוקריוטים ו האיקריוטים. וידאו זה מתאר פרוטוקולים ליצירת תערובת lipidic bicelle, המאגדת חברי פרלמנט לתוך התערובת bicelle, הקמת crystallizations ניסויים (באופן ידני, כמו גם רובוט) וקריסטלים קצירת מן המדיום.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

במסמך מתואר גישה רובוטית להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בmesophases lipidic לשימוש בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular ה-X. שלושה רובוטים המסוגל להתמודד mesophase הצמיג ודביק חלבון העמוס האינטגרלי לשיטה הם הציגו.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

במסמך מתואר נהלים המיושמים בממברנה קבוצת ביולוגיה המבנית ופונקציונלית לגבישי חלבון קרום קציר וcryo-מגניב שגודלו בשלבים עוקבים וספוג lipidic לשימוש בקביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן קאפרי.

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

הליכים לכינון מחדש של אב טיפוס ערוץ אשלגן מתח מגודרת לממברנות שומנים בדם מלא מתוארים. הערוצים המשוחזרים מתאימים למבחנים ביוכימיים, הקלטות חשמל, הקרנת יגנד ומחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים. שיטות אלה עשויות להיות יישומים כלליים למחקרים המבניים ותפקודיים של חלבוני קרום אחרים.

כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים

β חלבוני ממברנה חיצונית (OMPs) משרתים פונקציות רבות בתוך הממברנות החיצוניות של חיידקים גראם-שליליים, מיטוכונדריה וכלורופלסטים. כאן, אנו מקווים להקל על צוואר בקבוק ידוע במחקרים מבניים על ידי הצגת פרוטוקולים לייצור OMPs של β חביות בכמויות מספיקות לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או ספקטרוסקופיה NMR.

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

אנו מתארים נהלים להכנה ואספקה של מיקרו-גבישי חלבון ממברנה בשלב מעוקב ליפידי עבור קריסטלוגרפיה סדרתית בלייזרים אלקטרונים חופשיים של קרני רנטגן ומקורות סינכרוטרון. ניתן ליישם פרוטוקולים אלה גם לשילוב ואספקה של מיקרו-גבישי חלבון מסיסים, מה שמוביל להפחתה משמעותית בצריכת הדגימה בהשוואה להזרקת נוזלים.

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

שומנים חד-שכבתיים שימשו כבסיס ליצירת גבישי חלבון דו-ממדיים (דו-ממדיים) למחקרים מבניים במשך עשרות שנים. הם יציבים בממשק מי האוויר ויכולים לשמש כחומר תומך דק להדמיית אלקטרונים. כאן אנו מציגים את הצעדים המוכחים על הכנת monolayers השומנים למחקרים ביולוגיים.

הכנה לדוגמה באמצעות שיטת חד שכבתית שומנים למחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר מערך להתגבשות של טרנספורטר הסטרול ABCG5/G8. ABCG5/G8 משוחזר לאופניים לצורך התגבשות טיפה תלויה. הפרוטוקול אינו דורש חומרים או מצעים מיוחדים, מה שהופך אותו לנגיש וקל להתאמה בכל מעבדה לקביעת מבנה החלבון באמצעות קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.

התגבשות ABCG5/G8 בסביבת ביצלה ליפידית לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן

למד את שיטת in meso לגיבוש חלבוני ממברנה במזופזות ליפידיות לקביעת מבנה קריסטלוגרפי. הפרוטוקול מדגים ערבוב חלבונים וליפידים, הכנת צלחות גבישה ותנאי אינקובציה אופטימליים למחקר ביולוגיה מבנית.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

גלה סרטונים נוספים