גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

שלום וברוכים הבאים לקבוצת הביולוגיה המבנית והפונקציונלית של ממברים. שמי מרטין קאפרי. מוקד המחקר שלנו הוא הממברנה הביולוגית, שהסכימה שלה מוצגת בשקף הראשון; הממברנה המקיפה את התא ואת האברונים התת-תאיים, כאשר הם קיימים, היא מבנה דק מבחינה מולקולרית, המורכב משתי מולקולות ליפיד בלבד ומשובץ בחלבונים.

אנו מעוניינים במבנה ובפונקציות החלות הן על ליפידים והן על חלבונים. עם זאת, לצורך סדרת JO זו, אגביל את המיקוד שלי לחלבונים ממברנתיים. אנו שואפים להבין כיצד חלבונים ממברנתיים אלה פועלים ברמה המולקולרית משתי סיבות.

ראשית, קיים הסיפוק האינטלקטואלי הנובע מהבנה כיצד דבר מה פועל. שנית, על ידי הבנת אופן הפעולה, בדומה לאופן שבו מבינים את פעולת האופניים או המכונית, קיימת האפשרות לתקן את הדבר במקרה של תקלה. עיצוב תרופות הוא תוצאה מובהקת של סוג זה של עבודה.

הגישה שאנו נוקטים כדי להבין כיצד חלבון ממברנה פועל ברמה המולקולרית היא קביעת המבנה הקריסטלוגרפי שלו. תהליך זה כולל קביעת המיקום במרחב תלת-ממדי של כל האטומים, או לפחות כל האטומים שאינם מימן, המרכיבים את החלבון. השיטה שבה אנו משתמשים למטרה זו נקראת קריסטלוגרפיה של קרני X למקרומולקולות, או בקיצור MX.

כאן אנו רואים דוגמה לחלבון ממברנה שמבנהו נקבע באמצעות MX, כאשר נדרש קריסטל של החלבון באיכות שברית כדי לבצע mx. כפי שניתן לדמיין, קביעת מבנה באמצעות קריסטלוגרפיה של מקרו-מולקולות כפי שמוצג כאן, כוללת שלבים רבים. בדרך כלל אלה כוללים זיהוי של חלבון ממברנה כמטרה, ולאחר מכן ייצור, טיהור והגשתו לקריסטליזציה.

מדידות דיפרקציה מבוצעות על הגביש באמצעות מקור קרני X ביתי או סינכרוטרון. נתוני הדיפרקציה מעובדים ומניבים מפת צפיפות אלקטרונים, אשר לאחר מכן מותאם אליה מודל מולקולרי. לאחר זיכוך המודל, ניתן להשתמש בו כדי לחקור את מנגנון הפעולה של החלבון ולתכנון תרופות מבוסס מבנה.

מיקודו של מאמר JoVE זה הוא להראות לכם כיצד אנו מפיקים גבישים באיכות גבוהה של חלבונים ממברנתיים באמצעות מזו-פאזות של ליפידים, בשיטה המכונה "in meso". סקירה עדכנית של השיטה והיקפה זמינה באסמכת אחת. הפרוטוקול השלב-אחר-שלב שבו ננחה כאן מתואר באסמכת שתיים, ותרשים זרימה המסכם את השלבים המעורבים ואת הזמן הנדרש להקמת ניסוי לגבישה של חלבון ממברנתי בשיטת in meso מוצג כאן.

סרטון זה מכסה את השלבים המוקפים בקוים אדומים מקווקווים. הפריטים הדרושים לביצוע גבישה מזוסקופית במצב ידני מוצגים כאן. אלו כוללים תמיסה מרוכזת של חלבון ממברנה מנוקה ושומן ליצירת המזוסו המארח, בדרך כלל mono ole כדי להפוך את השומן לבולט יותר.

בסרטון זה, נעשה שימוש בפתרונות משקיפי צבע אדום, במכשירים למילוי צינורות מים מזוקקים ובטיפים חד-פעמיים, ובמגוון מזרקי Hamilton אטומים לגז, חלקם עם מחטים נשלפות, מחבר בעל קוטר צר המשמש לערבוב תמיסת החלבון עם הליפיד להפקת ה-mease. דספנסר חוזר מבית Hamilton, תבניות זכוכית למיקרוסקופ וכיסויים. סרט מרחקים דו-דבק מנקבים שסולטט באופן אידיאלי ליצירת בארות, פינצטה, קרח גרוס, נייר סופג, מחשבון, והחשוב מכל, מחברת המעבדה שלכם.

הפרוצדורה הבאה משמשת להכנת פלטת גבישה מסוג "סנדוויץ'" זכוכית. לצורך הטעינה, הניחו על השולחן למשקוף מיקרוסקופ שעבר סילוז (siloized). הסירו את כיסוי הנייר המגן מאחד משטחי רצועת סרט מרווח דו-צדדי מחורר.

הניחו את הסרט הדביק כלפי מטה במגע עם פני השקף. הדביקו את הסרט לשקף. ניתן להשתמש בגלגלת (brayer) או ברולר, כאשר ניתן להניח נייר אלומיניום בין הסרט לרולר כדי להגן על בסיס הבארות.

הסר את כיסוי הנייר השני מהסרט כדי לחשוף את פניו הדביקים העליונים. הליך זה יוצר פלטת זכוכית המוכנה להטענה ולסגירה לאחר השלמת ההטענה. הנח כיסויי זכוכית בודדים בקרבה לפלטה לצורך סגירה מהירה ויעילה של הבארות.

הניחו את הליפיד בבלוק עם בקרת טמפרטורה ב-45 °C למשך שלוש דקות כדי להמיס אותו. שימו לב כי הליפיד המשמש בדרך כלל הוא mono land. בסרטון זה, הוסף צבע אדום לליפיד לצורך נראות בזמן שהליפיד נמס.

הכינו שתי מזרקות Hamilton אטומות לגז בנפח 100 µL לשימוש בשלב ערבוב הליפידים והחלבון. הסירו את שמן הטפלון מהמזרקה שתכיל את תמיסת החלבון. הניחו לצידה את המזרקה שתכיל את הליפידים. במקרה זה, השמן נשאר במקומו.

מקמו את המחבר בעל הקוטר הצר בין שתי המזרקות ולאחר מכן חברו את המחבר למחץ של מזרקת הליפידים. הדקו את המחבר למזרקה, אך הימנעו מהדקה מרובה. הוציאו את הבוכנה מגוף מזרקת הליפידים.

וודאו שהליפיד נמצא במצב נוזלי. כוון את הפיפטה ל-30 µL ושאב באיטיות 30 µL של ליפיד נוזלי מהמכסה. מבחנת הליפיד.

יש לאחסן את הליפיד תחת חנקן או ארגון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. העבר לאט כמות גדולה ככל האפשר מהליפיד המומס אל הקצה הפתוח של המזרק, תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות או מרווחים של אוויר.

הנח את הבוכנה לתוך הגליל במגע עם הליפיד המומס והנע את הבוכנה לאט מעלה בגליל כאשר המזרק מוחזק בצורה אנכית. כפי שניתן לראות, בועת אוויר שנלכדה בטעות עולה בתהליך ומשתחררת. כעת יש לנו פקק של ליפיד מומס בגליל, שאת נפחו עליכם לקבוע במדויק.

ניתן לבצע זאת על ידי קריאת הסימונים על גוף המזרק. במקרה זה, הנפח הוא 23 microliters, שיירשם במחברת המעבדה. החלק את הפרווה על המחט הבולטת מהמחבר.

השתמשו בבוכנה כדי לדחוף את הליפיד הנוזלי במעלה הגליל, ובצורה איטית ועדינה, אל תוך המחט שבמרכז המחבר. אם המחט מלאה מעט מדי, ניתן יהיה לראות את הליפיד נשפך מקצה הפתוח שלה. על ידי נסיגה קלה של הבוכנה, ניתן לשאוב את עודפי הליפיד חזרה אל המחבר עד שיהיה בקו אחד עם קצה מחט המחבר.

במקרה זה, יחידת מחבר המזרק טעונה במלואה ומוכנה לחיבור למזרק החלבון. יש לסובב את התמיסה ב-14,000 G למשך 10 דקות, חמש עד 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, כדי להסיר אגרגטים גדולים. לפני הקמת ניסויי הגבשת, הוצא את תמיסת החלבון מדלי הקרח והבא אותה לטמפרטורת החדר.

חשבו את נפח תמיסת החלבון שיש להשתמש בה כדי ליצור את הפאזה הקובית בהידרציה מלאה או קרוב אליה עבור olean בטמפרטורה של 20 °C. הידרציה מלאה עם מים מתרחשת בערך ב-40% מים לפי משקל, כפי שמופיע בדיאגרמת הפאזות. נזכיר שהטענו את מזרק הליפידים עם 23 µL של mono בצפיפות של 0.94 mg/µL.

כמות זו מקבילה ל-21.6 מיליגרם של ליפיד, לפיכך נדרשים 21.6 כפול ארבעה חלקי שש, כלומר 14.4 מיליגרם או 14.4 מיקרוליטר של תמיסת חלבון. בעזרת מזרק Hamilton של 25 או 50 מיקרוליטר, שאבו את הנפח הנדרש של תמיסת החלבון והעבירו את התמיסה אל קצה הטפלון של הבוכנה בתוך גוף המזרק. תוך הקפדה על מניעת בועות אוויר, הוציאו בזהירות את המחט ומדדו את נפח תמיסת החלבון במזרק. הנפח צריך להתאים לערך שחושב בשלב הקודם.

כהכנה לשילוב עם המזרק הטעון בליפידים, הזיזו בזהירות את תמיסת החלבון במעלה גוף המזרק עד שתהיה גמירה לקצה הפתוח שלו. ניתן לוודא זאת על ידי התבוננות דרך קצה גוף המזרק.

תמיסתו של חלבון הליפין והמזרקים הטעונים מוכנים כעת לשילוב. כדי להכין זאת, הברגו את מזרק החלבון אל הקצה הפתוח של המחבר המחובר למזרק הליפיד. לאחר שילוב שני המזרקים באמצעות המחבר, אמור להיווצר נפח רציף של נוזל מהליפיד במזרק אחד, דרך המחבר, ועד לתמיסת החלבון במזרק השני.

כהכנה לערבוב, מחזיקים את היחידה המורכבת כאשר מזרק אחד ביד ימין והשני ביד שמאל. מפעילים מומנט פיתול על שתי המהודרות דרך המחבר, תוך שימוש באצבעות ובבוהן של שתי הידיים, כדי להבטיח שהאיטום מול החריצים במחבר יישאר תקין במהלך ההידוק. בשלב זה, התקן ערבוב מורכב שאינו תקין יפגע ב-ALS ויגרום לדליפה, וגם הידוק יתר יוביל לדליפה.

מדובר בעניין של ניסיון, הכולל ניסויים וטעויות בלתי נמנעים ואובדן מקרי של דגימות. לכן, מומלץ להתאמן עם ליפידים ומים או תמיסת בופר כדי להתרגל למערכת לפני השימוש בתמיסות חלבון יקרות; כדי לבצע ערבוב, דחפו בעזרת האגודל או האצבע המורה את הבוחן בצד החלבון של יחידת הערבוב המורכבת עד לקצה, כך שתמיסת החלבון תידחף מתוך מזרק החלבון, דרך המחבר, אל תוך מזרק הליפידים. אם היחידה נסגרה באופן יעיל, פעולה זו תגרום לתנועה שווה והפוכה של הבוחן בצד הליפידים.

כעת משתמשים בבוכנה בצד השומנים כדי לדחוף את תכולת מזרק השומנים בחזרה דרך ה-coler ואל תוך מזרק החלבון. תהליך זה חוזר על עצמו פעמים רבות. לעיתים נדרשים מאה מעברים או יותר כדי להפיק פאזת misa הומוגנית.

בתחילת הערבוב, תנועת החומר קדימה ואחורה דרך המחבר עשויה להיות לא אחידה, ולעיתים נדרש כוח נוסף כדי להשלימ את הערבוב. הדבר צפוי. הערבוב הראשוני מלווה בדרך כלל בהופעת עכירות לא אחידה בדגימה, וגם זאת ניתן לצפות זאת.

ככל שההומוגניזציה מתקדמת, המרקם, כפי שנחוש על ידי הכוח הנדרש להנעת הבוכנות קדימה ואחורה, הופך לאחיד יותר ומאפיין את הפאזה הקובית הצמיגית, בדומה למראה הוויזואלי של הפאזה הקובית המתרגשת. אם התנאים מתאימים והפאזה הקובית נוצרת, הדיספרסיה צריכה להיראות שקופה אופטית בתוך גוף המזרק.

לפיכך, הסימונים על גוף המזרק צריכים להיות קריאים בבירור דרך הפאזה המזופורית בגוף המזרק. במקרה של חלבונים צבעוניים, לפאזה המזופורית יהיה את צבע החלבון, אך היא תהיה שקופה מבחינה אופטית. קירור קל מאוד של הדגימה במהלך הערבוב, על ידי הנחת מערבל המזרקים על קרח למשך זמן קצר, עשוי להאיץ את ההומוגניזציה ואת השגת השקיפות.

עם זאת, חשוב להימנע מערבוב יתר של הדגימה; יש לנקוט זהירות כדי להימנע מערבוב נמרץ מדי, שכן הדבר עלול לגרום לעליית טמפרטורת הדגימה עקב חימום חיכוכי. בשלב זה, פאזת ה-cubic misa נוצרה והחלבון שולב מחדש בתוך השכבה הליפידית. פאזת ה-misa מוכנה כעת לחלוקה לבארות בודדות בלוחות ההתגבשות.

ראשית, יש להעביר את הפאזה המזו למזרק המילטון בנפח 10 µL המורכב על מפזר חוזר. התחל תהליך זה על ידי חיבור המזרק למפזר. טען את המזרק עם הפאזה הקובית.

הוצא את המחט ואת הבוכנה מהמזרק. השאר את טבעת הטפלון במקומה. הסר את אום החיזוק מהמפיץ בעזרת מטבע קטן.

כאשר זרוע הגלגלת נסוגה לחלוטין, הכנס את המזרק ללא הבוכנה והמחט דרך טבעת ההחזקה של המנפנף. החזר את אטם קשירת המעצור כאשר צד האטם פונה אל המזרק, והברג אותו היטב אל הקצה הפתוח של המזרק.

יש להקפיד לוודא שהמזרק ממורכז כראוי בטבעת התמיכה ושהגוף מיושר במקביל לזרוע הגלגלת. ניתן להעריך את שני התנאים הללו על ידי I. שני הדרישות הללו חשובות, כיוון שאם הבוכנה אינה נעה בחופשיות, ייווצר לחץ במזרק המקור במהלך הטעינה ועלול להתרחש דליפה. העבירו את הבוכנה דרך טבעת התפיסה כאשר אום התפיסה מסובבת החוצה מספר סיבובים, והנחו את הבוכנה אל הקצה הפתוח של המזרק.

לחצו על זרוע המנגנון (ratchet arm) כדי להניע את הבוכנה באופן מלא לתוך הצילינדר, ובדקו שהיא נעה בחופשיות ובמלואה בתוך הצילינדר. אם הבורג ומוט ההובלה שוחררו, הידקו אותם מחדש ובדקו שוב שהבוכנה נעה בחופשיות. כעת מזרק ההגשה מוכן לטעינה.

הזז את הבוכנה בצד אחד של יחידת הערבוב המורכבת לסימון ה-0 µL. כדי להעביר את הפאזה המזו (meso phase) למזרק השני ולמחבר, נתק את המזרק הריק, כשה-UL שלו במקומו, מיחידת הערבוב וחבר מיד את המזרק הטעון, כשהמחבר מחובר אליו, לקצה המוברג של מזרק החלוקה בנפח 10 µL.

מידת ההדוקות שבה מתבצע החיבור היא קריטית. כפי שצוין כבר, טענו את מזרק ההגשה על ידי לחיצה על הבוכנה של המזרק בנפח 100 microliter כך שהפאזה המזופורית (meso phase) תועבר דרך המחבר. אם החיבור הדוק והבוכנה במזרק ההגשה נעה בחופשיות, אזי הבוכנה אמורה להתחיל לנוע בכיוון התנועה של בוכנת הטעינה בעוד מזרק ההגשה מתמלא.

נתק את מזרק הטעינה עם המחבר המחובר ממזרק החלוקה. חבר מחט קצרה בעלת קצה שטוח לסיום הפלדה של מזרק החלוקה והדק אותה בזהירות במקומה. קבע את הבוכנה לזרוע הראצ'ט על ידי הידוק הקשר בטבעת האחיזה.

יש להקפיד לא להדק את הקשר יתר על המידה, שכן הדבר עלול לשרוט ולעוות את הבוכנה ולהפוך אותה לבלתי שמישה. חשוב שטווח התנועה שניתן לזרוע של המנגנון (ratchet arm) במצב מהודק יוגבל ליותר מ-inch אחד.

כפי שמוצג בהמשך, לבוחן תהיה נטייה להתעקם וההגשה עלולה להיכשל. לחץ על תוף הראצ'ט מספר פעמים כדי להקדם את הבוחן בתוך החבית, ובכך למלא את הנפח הריק של המחט ולהטעין אותה. יש לחזור על שלב זה עד 10 פעמים, עד שחוט רציף של פאזת ה-mesa יצא מקצה המחט.

המחט מוכנה כעת לשימוש בהקמת ניסויי התגבשות, אשר יש להתחיל בהם באופן מיידי. לא מומלץ להשאיר את החלבון בתוך הפאזה הקובית למשך זמן רב מדי לפני הקמת ניסויי ההתגבשות. מכיוון שחלבונים מסוימים אינם יציבים בפאזה הקובית ללא תוספת של משקיע (precipitant), יש להניח פלטת התגבשות רב-בארים וכיסוי זכוכית (cover slip) על משטח המוגבה בכמה אינצ'ים מעל שולחן העבודה כדי להקל על הטעינה.

ניגודיות אופטימלית ונראות משופרת מושגות כאשר הפני השטח כהים מעט. הומוגניזרו את תמיסות המשקיע והסירו את הפקקים מהמבחנות. כוון את טבעת חלוקת המשקיע ל-1 µL; כאשר מחט החלוקה מוחזקת במצב אנכי ביד אחת, השתמש ביד החופשית כדי למקם את קצה המחט במרכז ומעל בסיס הבאר ישירות.

מספר אחת. לחצו על הכפתור בפיפט המקריב (repeating dispenser) כדי להוציא טיפה (bolus) של mease על פני השטח של הזכוכית. נפח הטיפה הוא 200 nanoliters.

כאשר משתמשים במפיץ חוזר סטנדרטי עם מזרק של 10 microliter, קצה המחט צריך להיות במרחק של כמה מאות micrometers לכל היותר מעל בסיס הבאר. כדי להבטיח הגשה נכונה, ניתן להשיג הגשה הדירה בקלות; הדבר דורש רק מעט תרגול. לאחר טעינת ארבע הבארות הסמוכות ב-mease, יש להניח microliter אחד של תמיסת משקיפה מעל כל בולוס של mease.

באמצעות שימוש בפיפטה של שני מיקרוליטר (2 µL) וטיפים חד-פעמיים סטנדרטיים, ובמהירות רבה ככל האפשר, הניחו לביד כיסוי באופן מרובע מעל הבארות המלאות כדי לכסות אותן באופן אחיד וליצור איטום אטום למים. השתמשו בשפכטול כדי להפעיל לחץ על לביד הכיסוי בנקודת המגע שלו עם המשטח הדביק החשוף של סרט המרווח. ניתן לחזור על תהליך חלוקת התמיסות והמשקיעים עד שכל הבארות בלוח יהיו מלאות ואטומות.

הפלטה מוכנה כעת לבדיקה ולדגירה. סמנו את הפלטה בבירור לצורכי מעקב. חלבונים הרגישים לאור מטופלים בדרך כלל על ידי עטיפת הפלטות בנייר אלומינום לפני הנחתן בתא הדגירה.

ניתן להסיר אותן ולבחון אותן תחת מיקרוסקופ בתאורה עמומה או תאורה צבעונית מתאימה. יש להניח את הפלטות בתא בעל בקרת טהפרה, בדרך כלל בטמפרטורה של 20 °C או בקירוב, בלוח זמנים קבוע. יש לבחון את הדפנות לאיתור צמיחת גבישים באמצעות מיקרוסקופ באור מקוטב עם הגדלה של 10 או 20 פעמים.

המטרה, לוח הזמנים המשמש במעבדת המחבר הוא כדלקמן, ימים 0 1 2 3 5 7 14 21 30 לאחר ההגדרה. בחנו בקפידה את בולוס המדידה. התאימו את עומק המיקוד בתוך הדגימה בעובי 140 micron.

יש לבצע את הבדיקה הן באור רגיל והן בין פילטרים מקטבים מצולבים; גבישי חלבון ממברנה חסרי צבע הגדלים בשלב הקובי, כאשר הם נצפים באור רגיל, נראים כך. גבישי חלבון ממברנה חסרי צבע הגדלים ב-meso, כאשר הם נצפים באור מקוטב, נראים כך או כך; חלבון ממברנה בעל צבע טבעי הגדל ב-meso, כאשר הוא נצפה באור רגיל, נראה כך או כך.

השלבים הבאים בתהליך הכולל של קביעה מבנית הם קצירה וקירור קריוגני של הגבישים, והקלטה ועיבוד של דיפרקציית קרני X מהם. נושאים אלה מכוסים במאמרים נפרדים של JoVE בסדרה זו.