גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

שלום וברוכים הבאים לקבוצת הביולוגיה המבנית והפונקציונלית של הממברנה. שמי מרטין קפרי. מוקד המחקר שלנו הוא הממברנה הביולוגית, שהסכימה שלה מוצגת בשקופית הראשונה, הממברנה המקיפה את התא והאברונים התת-תאיים כאשר היא קיימת היא מבנה דק מולקולרי, רק שתי מולקולות ליפידים לרוחב ומשובצות בחלבונים.

אנו מתעניינים במבנה ובתפקודים המיושמים הן על שומנים והן על חלבונים. עם זאת, למטרות סדרת JO זו, אגביל את ההתמקדות שלי לחלבוני ממברנה. אנו מבקשים להבין כיצד חלבוני הממברנה הללו מתפקדים ברמה המולקולרית משתי סיבות.

ראשית, יש את הסיפוק האינטלקטואלי בידיעה איך משהו עובד. שנית, על ידי ידיעה איך זה עובד, בדיוק כמו האופניים או המכונית שלך, יש סיכוי לתקן אותו אם הוא מתקלקל. תכנון תרופות הוא תוצאה ברורה של סוג זה של עבודה.

הגישה שאנו נוקטים כדי להבין כיצד פועל חלבון ממברנה ברמה המולקולרית היא לקבוע את המבנה הקריסטלוגרפי שלו. זה כרוך בקביעת המיקום במרחב התלת מימדי של כל האטומים, או לפחות כל האטומים שאינם מימן המרכיבים את החלבון. השיטה שאנו משתמשים בה למטרה זו נקראת בקיצור קריסטלוגרפיה מקרו-מולקולרית של קרני רנטגן.

כאן אנו רואים דוגמה לחלבון ממברנה שמבנהו נקבע באמצעות MX בשבריר איכות גביש של החלבון נדרש כדי לעשות mx. כפי שאתה יכול לדמיין, ישנם שלבים רבים המעורבים בקביעה מובנית באמצעות קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית כפי שמוצג באיור. הנה. בדרך כלל אלה כוללים זיהוי יעד חלבון ממברנה ולאחר מכן ייצור, טיהור והתגבשות שלו.

מדידות עקיפה מבוצעות על הגביש באמצעות מקור רנטגן ביתי או סינכרוטרון. נתוני העקיפה מעובדים, ומניבים מפת צפיפות אלקטרונים, אשר לאחר מכן מצוידת במודל מולקולרי. כאשר המודל מזוקק יכול לשמש לחקר מנגנון הפעולה של החלבון ולתכנון תרופות מבוסס מבנה.

המוקד של מאמר זה הוא להראות לך כיצד אנו מייצרים גבישים באיכות חלקית של חלבוני ממברנה באמצעות פאזות מזו ליפידים במה שנקרא שיטת מזו. סקירה עדכנית של השיטה והיקפה זמינה בהפניה ראשונה. הפרוטוקול שלב אחר שלב שנעקוב אחריו כאן מתואר בהתייחס לתרשים זרימה המסכם את השלבים הכרוכים והזמן הנדרש להקמת ניסוי התגבשות חלבון ממברנת מזו קצה מוצג כאן.

סרטון זה מכסה את השלבים המוקפים בקווים אדומים מקווקוים. הפריטים שתצטרכו לעשות בהתגבשות מזו במצב הידני מוצגים כאן. הם כוללים תמיסה מרוכזת של ליפיד חלבון הממברנה המטוהר ליצירת המיסה המארחת, בדרך כלל מונו אול כדי להפוך את השומן לברור יותר.

בסרטון זה, הוא מסומם בתמיסות משקעים של צבע אדום, מכשירי ליטוף של צינורות מים מטוהרים וקצות חד פעמיות ומבחר מזרקי המילטון אטומים לגז, חלקם עם מחטים נשלפות, מצמד קדח צר המשמש לערבוב תמיסת החלבון עם השומן לייצור המיזה. מתקן חוזר ממיקרוסקופ זכוכית המילטון מחליק ומחליק כיסוי. סרט מרווח מקל כפול מחורר מבודד באופן אידיאלי ליצירת פינצטה ליצירת באר, רקמות קרח סדוקות, מחשבון והכי חשוב מחברת המעבדה שלך.

ההליך הבא משמש להכנת צלחת התגבשות כריך זכוכית. לטעינה, הניחו שקופית מיקרוסקופ מבודדת על הספסל. הסר את מכסה נייר המגן ממשטח אחד של רצועת סרט מרווח מחורר עם מוט כפול

הנח את הצד הדביק של הסרט כלפי מטה במגע עם פני לחץ ההחלקה. אטום את הקלטת לשקופית. באמצעות נייר אלומיניום או רולר ניתן להניח נייר אלומיניום בין הסרט לגלגלת כדי להגן על בסיס הבארות.

הסר את מכסה הנייר השני מהסרט כדי לחשוף את המשטח הדביק העליון שלו. הליך זה מייצר לוחית זכוכית מוכנה לטעינה ותקרה לאחר מכן ברגע שהטעינה הושלמה. כיסוי מבודד בודד מחליק בסמיכות לצלחת לתקרה מהירה ויעילה של בארות.

מניחים את השומן בגוש מבוקר טמפרטורה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות כדי להפוך אותו למותך. שימו לב שהליפיד המשמש הוא בדרך כלל אדמת מונו. בסרטון זה, לליפיד יש צבע אדום נוסף לנראות בזמן שהליפיד נמס.

הכן שני מזרקי המילטון אטומים לגז 100 מיקרוליטר לשימוש בשלב ערבוב חלבון השומנים, הסר את שמן פרוות הטפלון מהמזרק שיכיל את תמיסת החלבון. הניחו את המזרק שיחזיק את השומן לידו. במקרה זה, הפאל נשאר במקומו.

הנח את מצמד הקדח הצר בין שני המזרקים ולאחר מכן חבר את המצמד לאצבע מזרק השומנים. הדק את המצמד למזרק, אך אל תהדק יתר על המידה. הסר את הבוכנה מחבית מזרק השומנים.

ודא שהליפיד מותך. הגדר את הפיפט ל -30 מיקרוליטר וקח לאט לאט 30 מיקרוליטר של כובע שומנים מותך. בקבוקון השומנים.

יש לאחסן את השומן מתחת לחנקן או ארגון במינוס 80 מעלות צלזיוס. העבירו לאט כמה שיותר מהשומן המותך לקצה הפתוח של המזרק. הקפדה לא להכניס פערי אוויר.

הנח את הבוכנה לתוך הקנה במגע עם הנמר המותך וקדם לאט את הבוכנה במעלה הקנה כשהמזרק מוחזק אנכית. כפי שמוצג, בועת האוויר שנלכדה עולה בטעות בתהליך ומשתחררת. כעת יש לנו פקק של שומן מותך בחבית שאת נפחו עליכם לקבוע במדויק.

ניתן לעשות זאת על ידי קריאת הסימונים על חבית המזרק. במקרה זה, הנפח הוא 23 מיקרוליטר, שנרשם במחברת המעבדה. החלק את הפרווה על המחט המשתרעת מהמצמד.

השתמש בבוכנה כדי לאלץ את השומן המותך במעלה הקנה ולאט ובעדינות לתוך המחט בליבת המצמד. אם המחט מתמלאת מעט יתר על המידה, השומן ייראה פועם בקצה הפתוח שלו. על ידי גיבוי קל של הבוכנה, ניתן למשוך את עודפי השומן לתוך המצמד עד שהוא פשוט סומק עם קצה מחט המצמד.

במקרה זה, יחידת מצמד המזרק עמוסה במלואה ומוכנה לשילוב עם מזרק החלבון. יש לסובב את התמיסה ב -14, 000 גרם למשך 10 דקות, חמש עד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר אגרגטים גדולים. לפני קביעת ניסויי התגבשות, קח את תמיסת החלבון מדלי הקרח ואזן אותה בטמפרטורת החדר.

חשב את נפח החלבון, כך שיש להשתמש בתמיסה ליצירת השלב המעוקב בהידרציה מלאה או קרוב אליה עבור אולאן 20 מעלות צלזיוס. הידרציה מלאה עם מים מתרחשת בקרוב ל-40% במשקל מים כמו בתרשים השלבים. נזכיר כי העמסנו את מזרק השומנים ב-23 מונו בצפיפות של 0.94 מיליגרם למיקרוליטר.

זה מתאים ל -21.6 מיליגרם שומנים, ולכן יש צורך ב -21.6 כפול ארבע חלקי שישה או 14.4 מיליגרם או 14.4 מיקרוליטר של תמיסת חלבון עם מזרק המילטון של 25 או 50 מיקרוליטר תופס את הנפח הנדרש של תמיסת החלבון, מעביר את התמיסה לקצה הטפלון של הבוכנה בחבית תמיסת החלבון. הקפידו להימנע מבועות אוויר, משכו בזהירות את המחט ומדדו את נפח תמיסת החלבון במזרק. הוא צריך להתאים לערך שנמסר בשלב הקודם.

לקראת שילוב עם המזרק העמוס בשומנים. סנטימטר בזהירות את תמיסת החלבון במעלה החבית כדי בסופו של דבר לשטוף עם הקצה הפתוח שלה. ניתן לראות זאת על ידי הסתכלות מטה דרך קצה סיום הקנה.

תמיסת חלבון הליפין, מזרקים טעונים מוכנים כעת לשילוב כהכנה למקס לעשות זאת, הברג את מזרק החלבון לקצה הפתוח של המצמד המחובר למזרק השומנים. לאחר שילוב שני מזרקים דרך המצמד. נפח רציף של נוזל צריך להתקיים משומנים במזרק אחד דרך המצמד לתמיסת חלבון במזרק השני.

לקראת הערבוב, היחידה המורכבת מוחזקת באחד עם מזרק אחד ביד ימין והשני בשמאל. מומנט מופעל על שתי החביות עד למצמד, באמצעות האצבעות והאגודל של שתי הידיים כדי להבטיח שהאטם כנגד התלמים במצמד יישאר שלם במהלך ההידוק. מכשיר הערבוב המורכב בשלב זה יפגע ב- ALS ויגרום לדליפה תחת הידוק יוביל גם לדליפה.

זה עניין של ניסיון עם ניסוי וטעייה בלתי נמנע ואובדן דגימה מדי פעם. לכן כדאי להתאמן עם תמיסת שומנים ומים או חיץ כדי להרגיש את המערכת לפני שמתחילים להשתמש בתמיסת חלבון יקרת ערך כדי להשפיע על הערבוב, לקדם את הבוכנה בצד החלבון של יחידת הערבוב המורכבת עד לקצה שלה עם האגודל או האצבע המורה הדוחפת את תמיסת החלבון ממזרק החלבון דרך המצמד לתוך מזרק השומנים. אם היחידה נאטמה ביעילות, פעולה זו תגרום לתנועה שווה והפוכה של הבוכנה בצד השומנים.

הבוכנה בצד השומני משמשת כעת להנעת תכולת מזרק השומנים בחזרה דרך הקולר לתוך מזרק החלבון. תהליך זה חוזר על עצמו פעמים רבות. לפעמים נדרשים מאה קטעים או יותר כדי לייצר פאזה מיסה הומוגנית.

בתחילת הערבוב, תנועת החומר קדימה ואחורה דרך המצמד יכולה להיות לא אחידה ולעיתים יש צורך בכוח נוסף כדי לבצע ערבוב. זה צפוי. ערבוב ראשוני מלווה בדרך כלל בהתפתחות עכירות לא אחידה בדגימה ושוב צפוי.

ככל שההומוגניזציה מתקדמת. המרקם כפי שמורגש על ידי הכוח הדרוש להזזת הבוכנות קדימה ואחורה הופך אחיד ואופייני יותר לשלב הצמיג המעוקב, וכך גם המראה החזותי של השלב המעוקב המתהווה. אם התנאים מתאימים ונוצר השלב המעוקב, הפיזור צריך להיראות שקוף אופטית בחבית המזרק.

לפיכך, הסימונים על חבית המזרק צריכים להיות קריאים בבירור דרך שלב המזו בקנה. במקרה של חלבונים צבעוניים, שלב המזו יהיה בצבע החלבון, אך יהיה שקוף אופטית. קירור קל מאוד של הדגימה במהלך הערבוב על ידי הנחת מערבל המזרק לזמן קצר על קרח יכול להאיץ את ההומוגניזציה והשגת השקיפות.

עם זאת, חשוב לא להגזים בדגימה יש לנקוט בזהירות כדי למנוע ערבוב נמרץ במיוחד מכיוון שהדבר עלול לגרום לעליית טמפרטורת הדגימה עקב חימום חיכוך. בצומת זה, נוצר שלב המיסה המעוקב והחלבון נבנה מחדש לתוך בליי השומן. שלב המיסה מוכן כעת לחלוקה לבארות בודדות של לוחות ההתגבשות.

עם זאת, ראשית, יש להעביר את שלב המזו למזרק המילטון בנפח 10 מיקרוליטר המותקן על מתקן חוזר. התחל תהליך זה על ידי צימוד המזרק למתקן דק. טען את המזרק עם המיסה המעוקבת.

הסר את המחט ואת הבוכנה מהמזרק. השאירו את הטפלון במקומו. הסר את אום השמירה מהמתקן בעזרת מטבע קטן.

כשזרוע המחגר משוכה במלואה. הכנס את המזרק ללא הבוכנה והמחט שלו דרך טבעת האחיזה של המתקן. החזר את צד אטם קשר השמירה הפונה למזרק והברג אותו בחוזקה בקצה הפתוח של המזרק.

יש להקפיד על כך שהמזרק מרוכז כראוי בטבעת האחיזה ושהקנה מיושר במקביל לזרוע המחגר. ניתן לשפוט את שתיהן על ידי I.שתי הדרישות הללו חשובות מכיוון שאם הבוכנה לא פועלת חופשי ודרך לחץ יצטבר במזרק המקור במהלך הטעינה ועלולה להתרחש דליפה. העבירו את הבוכנה דרך טבעת האחיזה בעזרת אגוז האחיזה, פתחו כמה סיבובים והנחו את הבוכנה לקצה הפתוח של המזרק.

לחץ על זרוע המחגר, הזז את הבוכנה במלואה לתוך הקנה ובדוק שהיא נעה בחופשיות ודרך הקנה. אם הבורג ומוט ההנחיה השתחררו, הדק אותו מחדש ובדוק שוב שהבוכנה נעה בחופשיות. אני מזרק החלוקה מוכן כעת לטעינה.

הזז את הבוכנה בצד אחד של יחידת הערבוב המורכבת לסימן הסיום של אפס מיקרוליטר. כדי להעביר את שלב המזו למזרק השני ולמצמד. נתק את המזרק הריק עם ה-UL שלו במקומו מיחידת הערבוב וחבר מיד את המזרק הטעון עם המצמד המחובר לסיום ההברגה של מזרק החלוקה של 10 מיקרוליטר.

מידת ההידוק איתה נעשה הצימוד היא קריטית. כפי שכבר צוין, טען את מזרק החלוקה על ידי לחיצה על הבוכנה של מזרק 100 מיקרוליטר כך ששלב המזו יעבור דרך המצמד. אם הצימוד הדוק והבוכנה במזרק המחלק פועלת חופשית, אז הבוכנה צריכה להתחיל לנוע בכיוון התנועה של בוכנת הטעינה כאשר מזרק החלוקה מתמלא.

נתק את מזרק הטעינה כשהמצמד מחובר ממזרק החלוקה. אבטח מחט קצרה ושטוחה לקצה הפלדה של מזרק החלוקה והדק אותה בזהירות במקומה. מהדק את הבוכנה לזרוע המחגר על ידי הידוק הקשר בטבעת האחיזה.

יש להקפיד לא להדק יתר על המידה את הקשר. מכיוון שזה יכול לקלוע ולעוות את הבוכנה ולהפוך אותה לבלתי שמישה. חשוב שטווח הנסיעה המסופק לזרוע המחגר במצב מהודק יוגבל ללא יותר מאינץ'.

כפי שמוצג מעבר לכך, לבוכנה תהיה נטייה להתכופף והמשלוח יכול להיכשל. L לחץ על תוף המחגר מספר פעמים כדי לקדם את הבוכנה בקנה, ובכך למלא את נפח הריק של המחט ולהעמיס את המחט. יש לחזור על שלב זה עד 10 פעמים עד שחוט רציף של שלב המסה יוצא מקצה המחט.

המחט מוכנה כעת לשימוש בהקמת ניסויי התגבשות, שאמורים להתחיל מיד. לא מומלץ לשמור על השלב המעוקב הטעון בחלבון זמן רב מדי לפני הגדרת ניסויי ההתגבשות. מכיוון שחלק מהחלבונים אינם יציבים בשלב המעוקב ללא תוספת משקעים, הנח צלחת התגבשות מרובת בארות והחלקת כיסוי על משטח, מוגבה כמה סנטימטרים מעל הספסל כדי להקל על הטעינה.

ניגודיות אופטימלית ונראות משופרת מושגות כאשר המשטח כהה מעט. הומוגניזציה של תמיסות המשקעים וביטול הבקבוקונים. הגדר את אביזר חלוקת המשקעים למיקרוליטר אחד כאשר מזרק החלוקה מוחזק אנכית ביד אחת, השתמש ביד החופשית כדי למקם את קצה המחט במרכז וישירות מעל בסיס הבאר.

מספר אחת. לחץ על הכפתור על המתקן החוזר כדי להוציא בולוס של מכה על משטח הזכוכית. נפח הבולוס הוא 200 ננו-ליטר.

כאשר משתמשים במתקן החוזר הסטנדרטי עם מזרק של 10 מיקרוליטר, קצה המחט צריך להיות לא יותר מכמה מאות מיקרומטרים מעל בסיס הבאר כדי להבטיח אספקה תקינה, אספקה ניתנת לשחזור מושגת בקלות. זה רק דורש קצת תרגול. לאחר שארבע הבארות הסמוכות נטענות בנוזל, הניחו מיקרוליטר אחד של תמיסת משקעים על גבי כל בולוס מיז.

בעזרת שני מיקרוליטר לכל פטנט וטיפים חד פעמיים סטנדרטיים במהירות האפשרית, הנח פתק כיסוי ישר מעל הבארות המלאות כדי לכסות אותן באופן אחיד כדי ליצור אטימה אטומה למים. השתמש במרית כדי להפעיל לחץ על החלקת הכיסוי היכן שהיא יוצרת מגע עם המשטח הדביק של המקל החשוף של סרט המרווח. ניתן לחזור על תהליך חלוקת המשקעים והמשקעים עד שכל הבארות בצלחת נטענות ואטומות.

הצלחת מוכנה כעת לבדיקה ולדגירה. סמן את הצלחת בבירור למטרות מעקב. חלבונים רגישים לאור מטופלים בדרך כלל על ידי עטיפת הצלחות בנייר אלומיניום לפני הכנסתם לתא הדגירה.

ניתן להסיר אותם ולבחון אותם תחת המיקרוסקופ באור מאופק או בצבע מתאים. הניחו את הצלחות בתא מבוקר טמפרטורה בדרך כלל בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס או בערך בלוח זמנים קבוע. בדוק את הקירות לצמיחת גבישים באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב עם מטר פי 10 או 20.

מטרה, לוח הזמנים המשמש במעבדה של המחבר הוא כדלקמן, יום 0 1 2 3 5 7 14 21 30 סט פוסטים. בדוק בזהירות את בולוס המיזה. התאמת עומק המיקוד בתוך הדגימה בעובי 140 מיקרון.

הבדיקה צריכה להיעשות הן באור רגיל והן בין מקטבים צולבים, גבישי חלבון ממברנה חסרי צבע הגדלים בשלב המעוקב כאשר מסתכלים עליהם באור רגיל. להיראות ככה. גבישי חלבון ממברנה חסרי צבע הגדלים במזו כאשר מסתכלים עליהם באור מקוטב נראים כך או כך חלבוני ממברנה בצבע טבעי הגדלים במזו כאשר מסתכלים עליהם באור רגיל נראים כך או כך.

השלבים הבאים בתהליך הכולל של קביעה מובנית הם לקצור ולקרר בהקפאה את הגבישים, ולתעד ולעבד מהם עקיפה של קרני רנטגן. נושאים אלה מכוסים במאמרים נפרדים של JoVE בסדרה זו.