גישת עיבוד מקביל רב היעד לקביעת גנטי למבנה של פולימראז שפעת PB2 מקטע

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בגישה מרובת מטרות לקביעה מובנית של חלבון מטרה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, החל מגן בודד או רצף גנטי במקרה המוצג כאן. חלבון המטרה הוא תת-היחידה PB 2 פולימראז משפעת A, מרכיב מרכזי בשכפול הנגיף. הגישה הרב-מטרתית מושגת על ידי תכנון ושיבוט של סדרה של מבנים גנטיים במקביל על סמך רצף המטרה היחיד ומידע אחר הידוע על החלבון.

השלב השני הוא לבדוק את רמות הביטוי עבור כל מבנה ולבחור את הטובים ביותר לביטוי חלבון בקנה מידה גדול בתרבית תאים. השלב הבא דורש שבירת תאים פתוחים כדי להסיר את חלבוני המטרה מחומר הביטוי ולזקק כל אחד מהם לטוהר גבוה מאוד. לאחר מכן נערכת סדרה של ניסויי התגבשות עם כל חלבון כדי לקבל צורת גביש המתאימה למחקרי רנטגן.

נתוני עקיפה של קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה נאספים לאחר מכן על גביש אחד או יותר ומשמשים לפתרון ולעידון מפת צפיפות אלקטרונים המתארת את המבנה של כל חלבון מטרה. תוצאות אלו מאפשרות עיבוד של מבנה תלת מימדי של חלבון המטרה על סמך מפת צפיפות האלקטרונים. עיבוד רב-מטרות מגדיל מאוד את הסבירות להצלחה בקביעה מובנית על ידי מתן חלופות ברות קיימא בכל מחסום פוטנציאלי בדרך.

עבודה על מספר יעדים במקביל היא גם יעילה ביותר, ומפחיתה את הזמן והעלות לחלבון בכל שלב. הפוטנציאל להגדיל את קצב השלמת הקביעה המובנית עבור מטרות הניתנות לתרופה יאפשר יותר הזדמנויות לפיתוח טיפול בשנה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה חשובה בביולוגיה מבנית, החלבון האיכותי המתקבל בשיטות אלה יכול לתמוך בכל מחקר מבוסס חלבון.

לכל שלב בתהליך יש מדע משלו ודורש מומחיות משלו, אבל ההשקעה באנשים, מכשור וידע יכולה להשתלם יפה ברגע שכל החלקים מורכבים. לאחר בחירת גן יעד ותוצר גן לחקירה, הצעד הראשון דורש תכנון של וריאנטים או מבנים גנטיים מרובים. תוכנת מלחין גנים משמשת לתכנון מבנים אלה ברמת החלבון יחד עם הקוד המשויך על רצפי גנים סינתטיים מהונדסים.

באמצעות מודול מציג היישור ומודול עיצוב הבנייה, השווה יישורי רצף חלבונים והגדר מבני חלבון לתכנן פריימרים או אמפרים של מסוף PCR ו-PCR וקטורי. לאחר מכן, השתמש באלגוריתם של חלבון ל-DNA של מחבר גנים כדי לתרגם לאחור כל רצף חומצות אמינו לקוד על רצף חומצות גרעין מהונדס. השתמש בקוד המתאים בטבלת השימוש כדי למטב את הרצף לביטוי בשורת תא ספציפית.

במקרה זה, חיידקי אי קולי. לאחר שרצף גן המטרה מוכן, שכפל למעשה והכנס את הגן לפלסמיד וקטורי מתאים לביטוי חיידקים. במקרה זה וקטור PET 28 שונה.

וקטור זה מכיל רכיבים מסוימים הנחוצים לביטוי ולטיהור חלבונים. גן המטרה שונה כדי לשלב רצף תג היסטמין בקצה N או C של החלבון ורצף מחשוף כדי לאפשר הסרת התג במהלך הטיהור. לווקטור יש גם גן עמידות לאנטיביוטיקה לבדיקת ביטוי ותסיסה.

כל רצף גנטי של חלבון מטרה נוצר לאחר מכן בשיטות סינתזת גנים סטנדרטיות כהכנה לשיבוט צינורות פולימראז שיבוט ראשוני לא שלם, או שיבוט צינורות הוא אסטרטגיית שיבוט מבוססת PCR שבה גן המטרה מוגבר עם פריימרים המשלימים לווקטור המיועד. שיטה זו מנצלת את האופי הלא שלם של PCR בשלב מאוחר, מה שמשאיר את מוצרי ה-PCR עם טרמיני חד-גדילי משתנה. אני מכין את ה-PCR או ה-IPCR על ידי הוספת חמישה מיקרוליטר כל אחד של פריימרים קדימה ואחורה לכל תגובה.

בצלחת של 96 בארות על פי מפת לוחות, הוסף שני מיקרוליטר מכל גן סינתטי באורך מלא לבאר המתאימה לו על פי מפת הצלחות. לאחר הוספת 25 מיקרוליטר של תערובת מאסטר PFU לכל אחד, יש למחזר היטב את התגובות 25 פעמים באמצעות תנאי ה-PCR הבאים. דטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.

אניל ב-50 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות ונמשך ב-68 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. הגברת השבר מאושרת על ידי ניתוח ג'ל AGROS של מוצרי IPCR. מוצרי IPCR מוצלחים מיוצגים על ידי להקות חזקות.

תוצאות פחות רצויות נתפסות לעתים קרובות כרצועות חלשות או מריחות בתגובה נפרדת. פלסמיד הביטוי מוגבר על ידי PCR וקטורי או הגברת שבר VPCR מאושרת על ידי ניתוח ג'ל AROS של מוצרי VPCR. ברגע שמוצרי IPCR ו-VPCR מוגברים, הם מתווספים ללוח מיזוג ומכניסים לתרמו-סייקלר לתגובת המיזוג.

המבנים ששובטו בהצלחה הופכים לאחר מכן לתאי אי קולי בעלי יכולת כימית ומאוחסנים בגבעולי גליצרול כדי להתחיל ברצף בדיקת הביטוי. כמות קטנה של כל דגימה ממלאי גליצרול של מבנה משובט על צלחת אגר נפרדת. הצלחת עשויה ממרק מזין חיידקי והסמן האנטיביוטי קנמיצין המקודד בווקטור הדגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס למחרת.

התחל תרבית מוקדמת לכל דגימה על ידי בחירת מושבה בודדת מצלחת האגר הטרייה. השתמש במושבה זו כדי לחסן 1.2 מיליליטר של מרק שחפת בתוספת פחית מיצין וגלוקוז לעיבוד מקביל. כל תרבית מוקדמת גדלה בגוש תחתון עגול של 96

גדל בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-220 סיבובים לדקה. לאחר הגידול בן לילה. התחל תרביות אינדוקציה בקנה מידה קטן עבור כל דגימה על ידי שימוש ב-40 מיקרוליטר של התרבית המוקדמת לחיסון.

1.2 מיליליטר מרק שחפת. בתוספת 50 מיליגרם למיליליטר של מערכת אקספרס לילה של פחית מיצין ונובאגן. האחד, לגדל את תרביות האינדוקציה ב-20 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות, לנער ב-220 סל"ד תאי קציר על ידי צנטריפוגה ב-4,000 יחידות GForce למשך 15 דקות.

שפכו את הסופרנטנט ואחסנו את הכדורים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות לפני עיבוד נוסף לאחר הטיהור. ניתוח החלבון עם ובלי תגובת מחשוף על ידי אלקטרופורזה נימית באמצעות מערכת CHIP 90 מעבדת קליפר לפי פרוטוקול היצרן. במקרה של שפעת, תת-יחידה 14 של חלבון PB שני חלבונים מתוך 34 המבנים הובילו לחלבון מטרה מסיס ונכנסו לשלב הבא: תסיסה בקנה מידה גדול.

כדי להתחיל תסיסה בקנה מידה גדול יש לחסן 100 מיליליטר של מרק תרבית תאי חיידקים המכיל 50 מיליגרם למיליליטר. האם מיצין יכול ממלאי גליצרול ולגדול בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס? ניעור ב-220 סל"ד למחרת, הרחב את התרבית המוקדמת על ידי שימוש ב-10 מיליליטר לחיסון.

ליטר אחד של מרק המכיל אמצעי אינדוקציה אוטומטית ו-50 מיליגרם למיליליטר יכול מיצין בבקבוק מבולבל של שני ליטר. יש לנער את התרביות המורחבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בערך כל 30 דקות. בדוק את הצפיפות האופטית של התרבית על ידי מדידת ספיגת UV באורך גל של 600 ננומטר.

כאשר מגיעים לצפיפות אופטית של 0.6, שנה את הטמפרטורה של החממה הרועדת ל-20 מעלות צלזיוס לאחר זמן הגידול הרצוי. הסר מרובע עלי מייצג של 10 מיליליטר מכל מבנה לבדיקת ביטוי. קצור תאים על ידי צנטריפוגה ב -5, 000 GForce יחידות למשך 15 דקות.

שפכו את הסופרנטנט והקפיאו את כדור התא בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בהליך זה, יש להפשיר ולהשעות מחדש את משחת התאים במאגר ליזה ביחס נפח מאסטר אחד עד חמישה. מערבבים במרץ במשך 30 דקות בחום של ארבע מעלות צלזיוס.

השתמש במרית נקייה כדי לשחרר נתחים מהצד של הכוס. מכנית את התאים על הקרח עם סוניקט של בונים חופשיים. הבהירו את הליזאט הגולמי על ידי צנטריפוגה ב-18,000 גרםיחידות למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

אספו את הסופרנטנט ושמרו כמות קטנה לניתוח לפני שתמשיכו בטיהור בקנה מידה גדול. אשר ביטוי חלבון בקנה מידה גדול של כל תרבית באמצעות ניתוח ג'ל דף SDS. תוצאת דף SDS מייצגת זו מציגה ביטוי חלבון חזק, כ-50% מסיסות וכ-50% מחשוף.

במקרה זה, תג ההיסטידין הוסר יחד עם תג מסיסות חלבון נוסף, שהונדס במבנה המקורי. שרף ניקל משמש להפרדת חלבון המטרה עם תג ההיסטמין הייחודי מכל חומר תאי אחר כולל חלבונים חיידקיים מקומיים. עמודה אחת של ניקל מוכנה על ידי שטיפה עם ארבעה נפחי עמודות של מי UE כדי להסיר את מאגר האחסון ואחריו נפח עמודה אחד של מאגר B וחמישה נפחי עמודה של מאגר.

הקבלה שיווי משקל A עבור E נעשית עם יצרן החלבון, המסוגל להריץ מספר עמודות בו זמנית. טען כל ליזט מובהר המכיל חלבון מסיס עם תג היסטמין לעמודה נפרדת בקצב של שני מיליליטר לדקה, ואחריו מספר שטיפות בנפח עמודה עם מאגר A, אסוף את הזרימה דרך המאגר ושמור לניתוח. יש לסלק את החלבון הקשור בסדרה של שיפועי צעדים עם מאגרים A ו-B ב-95 עד 5 60 עד 40, ולבסוף 100% מאגר B.הרכיבים במאגר B מתחרים בהיסטמין על שרף הניקל ובכך מסירים את החלבון מהעמודה ביחס נתון.

אסוף כל שבר פליטה בנפרד. תוצאת כרומטוגרמה מייצגת מריצה על עמודה אחת של ניקל מוצגת כאן. נתח את הניקל אחד חמק מהשברים, הליזאט הגולמי, הליזט המובהר והניקל אחד זורמים דרך דף SDS והשווה עם ספיגת ה-UV ב-280 ננומטר שנאספה במהלך טיהור העמודה.

שלב זה קובע אם הטיהור הצליח. בחר ואגד שברים המכילים את חלבון המטרה כדי להמשיך הלאה לעיבוד נוסף. חשב את הכמות הכוללת של החלבון בשלב זה עם מקדם ההכחדה התיאורטי של החלבון, מדוד את ספיגת ה-UV ב-280 ננומטר ומביא בחשבון את הנפח הכולל של השברים המאוגדים.

שמור דגימה קטנה לניתוח. הגן לחלבון המטרה קודד ברצף ספציפי, המוכר על ידי ULP 1 כאתר מחשוף, וכך הוספת ULP 1 גורמת לחשוף בין תג ההיסטידין לחלבון המבוקש. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף מיקרוליטר אחד של יוביקוויטין כמו פרוטאז, אחד לכל חמישה מיליגרם חלבון הקיים בשברים המאוגדים.

בשלב זה, החלבון המפוצל מועבר ממאגר B למאגר A להמשך עיבוד באמצעות צינורות דיאליזה, דיאליזה של החלבון כנגד שני ליטר בופר, A למשך ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס תוך ערבוב. השתמש בחתך משקל מולקולרי של 10 קילודלטון עבור PB שניים לאחר דיאליזה. הפעל ג'ל דף SDS נוסף של חלבון המטרה עם ובלי ULP אחד.

זה יקבע אם מחשוף אחד של ULP הצליח ויאפשר לבחור את השברים הטובים ביותר להעברה להמשך עיבוד. מוצג כאן תוצאות דף SDS המייצג שלנו עבור שלושה מבנים של הפולימראז pb. שני סמני משקל מולקולרי תת-יחידה נמצאים בנתיב הראשון.

נתיבים 2, 6 ו-10 הם חלבונים מאוגדים מעמודות ניקל אחת. נתיבים 3, 7 ו-11 מכילים זרימה של חלבון מפוצל במאגר A מניקל 2 ונתיבים 4, 8 ו-12. הצג את הסרת תג ההיסטמין במאגר B מניקל שתיים.

לאחר הסרת ההיסטמין, מרוכזים השברים המאוגדים מניקל שניים. כדי להתחיל ב-SEC, יש לבחור שוב את השרף המתאים על סמך המשקל המולקולרי של המטרה במקרה זה, נעשה שימוש ב-acere S 110 מעל עמודה של 30 GL ומאוזן עם מאגר SEC של 200 מיליליטר בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר, טען את הדגימה ללולאת דגימה של 10 מיליליטר והתחל את ריצת עמודת ה-SEC. עקוב אחר הכרומטוגרמה סופגת ה-UV ב-280 ננומטר תוך איסוף שברי נפח קטנים.

הפעל את כל חלקי ה-SEC הרלוונטיים דרך דף SDS. הגישה הסטנדרטית לניסויי התגבשות חלבונים מתבצעת בשיטת טיפת הישיבה הכוללת דיפוזיה של אדים. זה לא נדיר להגדיר שני מסכי מטריצה דלילים או יותר כבר בהתחלה עבור כל חלבון מטרה.

כדי להתחיל בתהליך זה, מלא מראש כל מאגר של צלחת התגבשות זוטרה קומפקטית של 96 בארות עם 80 מיקרוליטר כל מצב במסך ההתגבשות שנבחר, הוציא 0.4 מיקרוליטר חלבון במאגר SEC לכל אחת מ-96 הבארות. לאחר מכן הוסף 0.4 מיקרוליטר ממסך ההתגבשות, והבטיח ערבוב מלא של הטיפה בכל אחד מהם. מכסים היטב את כל הנדוש בסרט תקרה שקוף, ומבטיחים אטימה מלאה על כל באר לאחסן את הצלחת ב-16 מעלות צלזיוס במקום ללא הפרעה ללא רעידות סביבתיות.

בדוק אם יש התגבשות חלבון מעת לעת במהלך השבועות הקרובים תחת מיקרוסקופ מנתח. אם לא מופיעים גבישי חלבון, קבעו צלחות חדשות בתנאים שונים ושנו את ריכוז החלבון בטיפה האחרונה כדי להגדיל את סיכויי ההצלחה לפני הקטיף. מצננים פאק בסגנון A LS בעושה מלא בחנקן נוזלי ומכסים במכסה כדי להתחיל בקציר.

חותכים את הסרט השקוף המכסה את הבאר עם גביש חלבון המטרה לריק סמוך. ובכן הוסף 1.6 מיקרוליטר ממצב ההתגבשות המתאים ושלב אותו עם 0.4 מיקרוליטר אתילן גליקול. תמיסה של 20% אתילן גליקול במצב התגבשות מגנה על גביש החלבון.

במהלך הקפאת קריו, נתחו את הגביש מתחת למיקרוסקופ ובחרו לולאת קריו מתאימה לקציר, תוך התאמת הקוטר הפנימי של הלולאה לרוחב המרבי של הגביש. חבר את לולאת הקריו לשרביט קריסטל מגנטי ולולאה את הגביש ישירות מתמיסת הבאר. טבלו מיד את לולאת הקריו עם הקריסטל שנקטף לתוך חומר קריופרוטקט ולאחר מכן טבלו בדיסקית בסגנון LS.

כדי להבהב, הקפיאו את חזרת הגביש למספר רצוי של גבישים. לאחר השלמת הקציר, השתמש בשרביט דיסקית כדי להניח מכסה מגנטי על הדיסקית המכיל גבישים קפואים עם לשונות כפופות. הפוך את הדיסקית לשלב הבא.

הברג דוחף דיסקית על הדיסקית, ואז העבר את הדיסקית לשחקן KU doer והשתמש בו כדי לנקב את המכסה. הגבישים בדיסקית נשארים קפואים באמבט חנקן נוזלי עד שהם מוכנים למחקרי עקיפה של קרני רנטגן באמצעות תוכנת רכישת התמונות J Director. הגדר את הפרמטרים הבאים עבור חריץ קרן הקרנת גביש ב-0.5 מעלות, מרחק גלאי של 50 מילימטרים, שלב תמונה ב-70 מעלות ואורך חשיפה של 30 שניות.

להלן צילום מסך לדוגמה מתוכנת רכישת התמונות בזמן הקרנת גביש, הפאנל המרכזי מציג עקיפה של קרני רנטגן שנצפתה מגביש מייצג אוסף מספיק תמונות ברזולוציה גבוהה עבור מערך נתונים שלם הדרוש לקביעת מבנה תלת מימדי. אסטרטגיות השיבוט וטיהור החלבונים שהודגמו בסרטון זה הביאו ל-14 PB מטוהרים, שתי דגימות שמהן תשע הניבו גבישים המתאימים למחקרי עקיפה. מערך הנתונים הפנימי של עקיפה של קרני רנטגן נאסף על חמישה מתוך תשעת המבנים עם קרינת אלפא QK באמצעות מחולל רנטגן של rigaku סופר בהיר בתוספת אנודה מסתובבת, המצויד ב-ossec variax hf, אופטיקה HF וגלאי Saturn 944 פלוס CCD.

תמונת עקיפה של קרני רנטגן של תת-היחידה PB 2 של פולימראז מוצגת כאן. כל מערך נתונים עובד ונקבעו בסך הכל ארבעה מבנים של יחידת המשנה PB שתיים. כל מבנה עבר ביקורת עמיתים והועלה למאגר נתוני החלבון לעיון הציבור.

איור זה מציג דיאגרמות סרט של המולקולות ביחידה הא-סימטרית הקריסטלוגרפית. מבין ארבעת שני המבנים של PB, מבנים משניים צבועים בתבנית קשת עם קודי PDB מתאימים. בטבלה זו מוצג ניתוח התוצאות של שפעת PB שתי מטרות בשיטות המתוארות במאמר וידאו זה.

צינור העיבוד המקביל הרב-מטרתי לקביעת גן למבנה מתואר בחמישה שלבים, שיבוט, מסיסות, טיהור, התגבשות וקביעת מבנה. התפוקה של צינור הביולוגיה המבנית שלנו לא רק מספקת את הבסיס למחקר מבוסס מבנה, אלא גם מזינה מחקרים נוספים כגון בדיקות פונקציונליות לאישור תפקוד חלבון או סינון ביופיזיקלי של תרכובות חדשות על ידי MAR או SPR כדי לזהות נקודות התחלה חדשות לפיתוח תרופות. טכניקה זו והכלים שהומצאו יחד איתה עזרו לסלול את הדרך לביולוגים מבניים לזהות סוגים רבים של מחקרים מבוססי תגליות, כולל תכנון תרופות מבוסס מבנה, שהייתה לו השפעה עצומה על בריאות האדם ומחלות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד עיבוד מקביל מרובה מטרות יכול להגדיל מאוד את ההצלחה של קביעה מובנית. אל תשכח שעבודה במעבדה לביולוגיה מבנית עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי הזהירות המתאימים, כגון שימוש בציוד הגנה אישי תוך כדי עיסוק בפעילויות מעבדה.