כוונון טור מקוטע זרימה מקבילה והפעלת איתור Multiplexed
15 בדצמבר 2015
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפעלה וכוונון של עמודות כרומטוגרפיה של זרימה מקוטעת מקבילה כדי לאפשר זיהוי מרובה.
המטרה הכוללת של הליך HPLC זה היא לכוונן עמודת זרימה מפולחת מקבילה כדי לאפשר זיהוי ריבוי. שיטה זו עונה על שאלות מפתח בתחומי הבריאות והרווחה, מדעי הסביבה, זיהוי פלילי וכל תחום הדורש ניתוח של דגימות מורכבות כגון גילוי ביולוגי. טכניקה זו מאפשרת ניתוח דגימה מקיף תוך מתן מידע על האופי הכימי והביו-אקטיבי של חומרים בתערובות מורכבות.
פרוטוקולי הזיהוי המרובים מאפשרים גם ניתוח מהיר. שיטה זו מאפשרת פיתוח אסטרטגיות להגדרת טביעת האצבע הכימית של תערובות מורכבות, כגון קפה ויין, ומאפשרת ליצרנים להבחין בין מוצריהם לבין זנים מזויפים זולים. בתחילה, זה עשוי להרגיש לא שגרתי לא לשלוח את כל הדגימה לגלאי אחד בלבד לניתוח מדויק.
עם זאת, ריכוז האנליטים בתוך כל זרם זרימה גבוה מזרם הזרימה הכולל של עמודה קונבנציונלית. כדי להתחיל, הגדר את מכשיר ה-HPLC עם 100% מים UE ומתנול טהור עבור שלבים ניידים A ו-B בהתאמה. אם יש להשתמש בגלאי MS, הוסף 0.1% חומצה פורמית לשני השלבים הניידים, ולאחר מכן נקה את משאבות ה-HPLC בהתאם להוראות היצרן.
הרכיבו את ה-MS UV VS. וגלאי DPPH. לפי הוראות היצרן. ודא שהרכיבים מסודרים כראוי, כך שהנפח המת בקווי הגלאי יהיה מינימלי.
לאחר מכן הגדר את אורך הגל של גלאי UV VISTA לאורך הגל הספציפי לדגימה כאן. 280 ננומטר עבור גלאי MS. השתמש במצב חיובי עבור ספירת יונים כוללת או ניתוח TIC עם שיטת זיהוי הסריקה המלאה.
איזון הטמפרטורה וזרימת הגז של גלאי MS לערכים הבאים. טמפרטורת וופורייזר של 500 מעלות צלזיוס, טמפרטורת נימים של 350 מעלות צלזיוס, זרימת גז עזר של 40 יחידות, זרימת גז סוחפת של חמש יחידות, קצב גז נדן של 60 יחידות ומתח ריסוס של 3.5 קילו-וולט. כדי להכין את המגיב הרדיקלי DPPH התחל בהמסת 25 מיליגרם של רדיקל DPPH ב-250 מיליליטר מתנול בבקבוק נפחי.
הוסף לתמיסה 250 מיקרוליטר של חומצה פורמית וסוניקציה של התמיסה למשך 10 דקות. לאחר מכן מכסים את הבקבוק ונייר הכסף כדי למנוע חשיפה לאור. לאחר מכן, נקה את המשאבה עם הפתרון הרדיקלי DPPH כפי שהמליץ היצרן כדי להגדיר את מערכת הרדיקלים DPPH.
ודא שקו המשאבה מהודק לכניסה של חתיכת T, ולאחר מכן חבר את סליל התגובה של 100 מיקרוליטר לשקע של חתיכת ה-T. חבר את הגלאי לקצה השני של מארז ה-ENC של סליל התגובה, סליל התגובה ומחמם עמודים. לבסוף הגדר את גלאי ה-UV הרדיקלי DPPH ל-520 ננומטר.
כדי לבנות את הזרימה המפולחת המקבילה או עמודת ה-PSF, חבר תחילה את כניסת העמודה למכשיר ה-HPLC. לאחר מכן, השתמש בחתיכת צינור כדי לחבר את היציאה המרכזית לגלאי MS. השתמש בצינורות באותם מידות כדי לחבר יציאת עמודה היקפית אחת לגלאי UV VS ואחרת לחתיכת ה-T של מערכת זיהוי הרדיקלים DPPH.
חסום יציאות היקפיות שאינן בשימוש באמצעות פקקי עמודים. התאם את קצב הזרימה של ה-HPLC למיליליטר אחד לדקה של 100% שלב B נייד עבור עמודה של 4.6 מילימטרים, קוטר פנימי ואורך של 250 מילימטרים. שיווי משקל למשך 20 דקות.
כדי להתחיל לכוון את מערכת ה-PSF יש לקרוע תחילה לכלי איסוף ריקים. השתמש בבקבוקונים אלה כדי לאסוף בנפרד את השלב הנייד מה-UV VS. ויציאות רדיקליות של DPPH. שימו לב לתקופת זמן האיסוף ואספו לפחות 500 מיליגרם ממס בכל כלי.
לאחר מכן, שקלו את כלי האיסוף כדי לקבוע את מסת השלב הנייד וחלקו את המסה בצפיפות המתנול כדי לחשב את נפח השלב הנייד שנאסף מכל יציאה. לבסוף, קבע את קצב הזרימה לגלאי MS וחשב את פרופורציות הזרימה של כל הגלאים כאחוז מהזרימה הכוללת כפי שמיוחס בפרוטוקול הטקסט. אם פרופורציות הזרימה חורגות באופן משמעותי מהערכים האידיאליים, הוסף צינורות נוספים במידת הצורך כדי להתאים את הלחץ האחורי ולחזור על תהליך האיסוף והחישוב.
לבסוף, הגדר את קצב הזרימה של משאבת הריאגנט הרדיקלי DPPH כך שיתאים לקצב הזרימה של יציאת היציאה המחוברת לגלאי. ניתוח HPLC מרובה בוצע על דגימת קפה. היכולת להקליט DPPH רדיקלי UV VS. ו-Ms.Chromatograms מאפשרת בו זמנית להתאים בקלות את התרכובות בדגימה שהגיבו באופן חיובי לרדיקל DPPH לתגובות UV לעומת
MS בהתבסס על יישור זמן השמירה שבו נראתה תגובה חיובית מגלאי MSS TIC, המסה המולקולרית של השיא נרשמה. הקלות בהתאמת פסגות בין תהליכי זיהוי שונים מאפשרת צורה מהירה ויעילה יותר של סינון ואפיון לדגימה מורכבת כמו קפה לאחר שליטה, ניתן להגדיר טכניקה זו תוך כשעה בלבד ולהיות מוכנה לניתוח דגימה בעקבות הליך זה. ניתן להשתמש בגלאים אחרים כגון פלואורסצנציה של מקדם שבירה, וזיהוי מבוסס כימיקלים כגון זוהר כימי על מנת לקבל מידע נוסף על הדגימה.
לאחר צפייה בסרטון זה, עליך להכיר בחשיבות של תהליכי זיהוי ריבוב להשגת הבנה טובה יותר של מדגם מורכב. יתר על כן, זיהוי מולטיפלקס באמצעות עמודות זרימה מפולחות מקבילות הוא דרך יעילה ביותר לבצע חקר ביולוגי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול להתאמת עמודות כרומטוגרפיה מקביליות עם זרימה מפולחת, המאפשר זיהוי מרובה. השיטה ישימה בתחומים שונים, כולל בריאות, מדעי הסביבה ופורנזיה.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- כרומטוגרפיה
- כימיה אנליטית
- ניתוח דגימות מורכבות
רקע
- עמודות זרימה מפולחות מקביליות משפרות את יכולות הזיהוי.
- שיטה זו מתייחסת לאתגרים בניתוח דגימות מורכבות.
- היא רלוונטית לתעשיות כמו מזון ומשקאות.
- ניתוח מהיר הוא יתרון משמעותי של טכניקה זו.
מטרת המחקר
- לאפשר זיהוי מרובה בדגימות מורכבות.
- לפתח אסטרטגיות ל-fingerprinting כימי.
- להבדיל בין מוצרים אותנטיים למוצרים מזויפים.
שיטות ששימשו
- כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC)
- פעולת עמודה עם זרימה מפולחת מקבילית
- פרוטוקולי זיהוי מרובה
- ניתוח דגימות של תערובות מורכבות
תוצאות עיקריות
- כוונון מוצלח של עמודות כרומטוגרפיה לזיהוי מרובה.
- ניתוח מקיף של דגימות מורכבות הושג.
- זיהוי תכונות כימיות וביו-אקטיביות בתערובות.
- מהירות ניתוח משופרת בהשוואה לשיטות מסורתיות.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה חזקה לניתוח דגימות מורכבות.
- היא תומכת בהבדלת מוצרים בשווקים תחרותיים.
- טכניקה זו ניתנת ליישום בתחומי מדע שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Parallel segmented flow (PSF) columns with multiplexed detection address the challenge of comprehensive, high-throughput analysis of complex mixtures in discovery-stage biopharma workflows. By enabling simultaneous use of multiple detectors—including both destructive and non-destructive types—this technology increases analytical depth and efficiency, supporting rapid chemical and bioactive profiling. The approach is strategically positioned to enhance predictive confidence and accelerate decision-making at key inflection points in early discovery and screening pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed chemical and bioactivity profiling of complex samples for hypothesis interrogation.
- Supports functional target validation by correlating molecular features with bioactive responses.
- Facilitates mechanistic de-risking through multiplexed detection of analytes in a single run.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by integrating orthogonal detection outputs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated analytical systems for downstream compound screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative outputs across multiple detection modalities.
- Enables rapid, parallel evaluation of sample components, increasing screening throughput.
- Supports platform reuse by accommodating various detector types without additional dead volume.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chemical fingerprinting with translational biomarker discovery when analyzing bioactive mixtures.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting multiplexed data acquisition.
- Reduces risk in advancement decisions by providing comprehensive analytical profiles.
- Enhances predictive de-risking for complex sample characterization.
Pipeline & Workflow Integration
PSF column multiplexed detection integrates into the analytical continuum from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and screening-based workflows.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing and pathway clarification via simultaneous chemical and bioactivity readouts.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility by enabling parallel, quantitative detection streams.
- Analytics: Supplies multi-modal measurements and retention time alignment for confident analyte identification.
- Translational Research: Connects analytical outputs to biomarker alignment and preclinical continuity when relevant.
- Enterprise Reuse: Functions as a flexible, reusable analytical platform adaptable to evolving R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in complex sample analysis.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable multiplexed detection workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and improves capital efficiency by consolidating analytical steps.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in HPLC instrumentation and detector integration.
- Needs analytical infrastructure capable of supporting multiple detector types simultaneously.
- Demands cross-team standardization of flow rates, tubing dimensions, and detector assignment.
- Adaptable across various model systems and sample types with appropriate tuning.
- Practical limitations include the need for precise flow management and detector compatibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Setup of High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Instrument and UV-Vis/Mass Spectrometry (MS) Detectors
2:51
Preparation of 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Radical Reagent and System Detector
4:00
Setup of Parallel Segmented Flow (PSF) Column
5:00
Tuning the PSF Column for Multiplexed Detection
6:18
Results: Multiplexed Detection of a Coffee Sample
7:11
Conclusion
