כוונון טור מקוטע זרימה מקבילה והפעלת איתור Multiplexed

המטרה הכללית של הליך HPLC זה היא לכייל עמודת זרימה מקבילית מקטעת כדי לאפשר זיהוי רב-ערוצי (multiplex). שיטה זו עונה על שאלות מפתח בתחומי הבריאות והרווחה, מדעי הסביבה, פורנזיקה וכל תחום הדורש ניתוח של דגימות מורכבות, כגון גילוי ביולוגי. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מקיף של הדגימה, ובו בזמן מספקת מידע על התכונות הכימיות והביואקטיביות של חומרים בתערובות מורכבות.

פרוטוקולי הגילוי הרב-ערוציים מאפשרים גם ניתוח מהיר. שיטה זו מאפשרת פיתוח של אסטרטגיות להגדרת הטביעה הכימית של תערובות מורכבות, כגון קפה ויין, ובכך היא מאפשרת ליצרנים להבחין בין המוצרים שלהם לבין זני זיוף זולים. בתחילה, הדבר עשוי להיראות לא שגרתי בכך שלא שולחים את הדגימה כולה לגלאי אחד בלבד לצורך ניתוח מדויק.

עם זאת, ריכוז האנליט בתוך כל זרם זרימה גבוה יותר מאשר בזרם הזרימה הכולל של עמודה קונבנציונלית. לתחילת הדברים, הגדירו את מכשיר ה-HPLC עם 100%UE water ומתנול טהור עבור הפאזות הניידות A ו-B בהתאמה. אם נעשה שימוש בגלאי MS, הוסיפו 0.1%formic acid לשתי הפאזות הניידות, ולאחר מכן בצעו פירג' (purge) למשאבות ה-HPLC בהתאם להוראות היצרן.

יש להרכיב את גלאי ה-MS, ה-UV, ה-VS וה-DPPH בהתאם להוראות היצרן. יש לוודא כי הרכיבים מסודרים בצורה נכונה, כך שנפח המת (dead volume) בקווי הגילוי יהיה מינימלי.

לאחר מכן, הגדירו את אורך הגל של גלאי ה-UV VISTA לאורך הגל הספציפי לדגימה הנוכחית. עבור גלאי ה-MS, הגדירו 280 nanometers. השתמשו במצב חיובי (positive mode) עבור ניתוח ספירת יונים כוללת או TIC בשיטת גילוי של סריקה מלאה (full scan).

השג את שיווי המשקל של הטמפרטורה וזרימת הגז של גלאי ה-MS לערכים הבאים: טמפרטורת מאייד של 500 °C, טמפרטורת קפילרית של 350 °C, זרימת גז עזר של 40 יחידות, זרימת גז סריקה של 5 יחידות, קצב גז מעטפת של 60 יחידות ומתח התזה של 3.5 kV. כדי להכין את ריאגנט רדיקל ה-DPPH, התחל בהמסה של 25 mg של רדיקל DPPH ב-250 mL של מתנול בתוך בקבוק מדידה.

הוסף 250 µL של חומצה פורמית לתמיסה ובצע סוניקציה לתמיסה למשך 10 דקות. לאחר מכן, כסה את הבקבוק בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. בשלב הבא, שטוף את המשאבה עם תמיסת רדיקלי DPPH בהתאם להנחיות היצרן כדי להגדיר את מערכת רדיקלי ה-DPPH.

וודא שקו המשאבה מהודק לכניסה של מחבר T, ולאחר מכן חבר את סליל התגובה בנפח 100 microliter ליציאה של מחבר ה-T. חבר את הגלאי לקצה השני של מארז ה-ENC של סליל התגובה, לסליל התגובה ולמחמם עמודות. לבסוף, כוון את גלאי ה-UV של רדיקלי ה-DPPH ל-520 nanometers.

כדי להרכיב את עמודת הזרימה המקבילית המקוטעת (PSF), חברו תחילה את כניסת העמודה למכשיר ה-HPLC. לאחר מכן, השתמשו בקטע צינור כדי לחבר את הפתח המרכזי לגלאי ה-MS. השתמשו בצינורות בעלי ממדים זהים כדי לחבר פתח היקפי אחד של העמודה לגלאי ה-UV VS ופתח נוסף למחבר ה-T של מערכת גילוי הרדיקלים DPPH.

חסמו את כל יציאות ההיקף שאינן בשימוש באמצעות פקקי עמודה. כווננו את קצב הזרימה של ה-HPLC ל-1 mL לדקה של 100% mobile phase B עבור עמודה בעלת קוטר פנימי של 4.6 mm ואורך של 250 mm. בצעו שיווי משקל למשך 20 דקות.

כדי להתחיל בכיוון מערכת ה-PSF, ראשית יש לנקז לכלי איסוף ריקים. השתמשו במבחנות אלו כדי לאסוף בנפרד פאזה ניידת מיציאות ה-UV VS וה-DPPH radical. רשמו את פרק הזמן של האיסוף ואספו לפחות 500 milligrams של ממס בכל כלי.

בשלב הבא, שקלו את כלי האיסוף כדי לקבוע את מסת הפאזה הניידת, וחלקו את המסה בצפיפות של methanol כדי לחשב את נפח הפאזה הניידת שנאסף מכל פתח. לבסוף, קבעו את קצב הזרימה לגלאי ה-MS וחשבו את פרופורציות הזרימה של כל הגלאים כאחוז מהזרימה הכוללת, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. אם פרופורציות הזרימה סוטות באופן משמעותי מהערכים האידיאליים, הוסיפו צינוריות נוספות במידת הצורך כדי להתאים את הלחץ האחורי, וחזרו על תהליך האיסוף והחישוב.

לבסוף, הגדירו את קצב הזרימה של משאבת ריאגנט רדיקלי ה-DPPH כך שיתאים לקצב הזרימה של יציאת הפורט המחוברת לגלאי. ניתוח HPLC רב-ערוצי (multiplexed) בוצע על דגימת קפה. היכולת להקליט בו-זמנית כרומטוגרמות UV ו-Ms של רדיקלי DPPH מאפשרת להתאים בקלות את התרכובים בדגימה שהגיבו באופן חיובי לרדיקל DPPH לתוצאות ה-UV.

ובתגובות MS המבוססות על יישור זמן השהייה שבהן נצפתה תגובה חיובית מגלאי ה-MSS TIC, נרשמה המסה המולקולרית של השיא. הקלות בהתאמת שיאים בין תהליכי גילוי שונים מאפשרת צורה מהירה ויעילה יותר של סריקה ואפיון עבור דגימה מורכבת כגון קפה. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן להקימה בתוך כשעה ולהכינה לניתוח דגימות בהתאם לנוהל זה. ניתן להשתמש בגלאים אחרים, כגון מדד שבירה, פלואורסצנציה, וגילוי מבוסס כימי כגון כימילומינסנציה, על מנת להשיג מידע נוסף על הדגימה.

לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להכיר בחשיבותם של תהליכי זיהוי במבנה של multiplex (ריבוי אותות) לצורך השגת הבנה מעמיקה יותר של דגימה מורכבת. יתרה מכך, זיהוי multiplex באמצעות עמודות זרימה מקטעות במקביל הוא דרך יעילה ביותר לביצוע מחקר ביולוגי (bio exploration).