Name: עיבוד אנזימתי תענית חלבונים עבור איתור MS עם microreactor זרימה דרך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: למד לבנות מיקרו-ריאקטור זרימה לעיכול אנזימטי מהיר של חלבונים לזיהוי ב-MS. שיטה זו מאפשרת ניתוח חלבונים ביעילות ובמהירות במחקר פרוטאומיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF/DBI-1255991 ל-IML.

1. הכנה של נימי microreactor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את 100 מיקרומטר קוטר פנימי (ID) x 360 מיקרומטר קוטר חיצוני (OD) נימי באורך של 7-8 ס&quot;מ, ואת נימי 20 מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD 3-5 ס&quot;מ עם קופיץ נימי זכוכית; לאמת תחת מיקרוסקופ כי בשני הקצוות נימי יש חתך נקי, ישר, ללא כל קוצים בולטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את 20 מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD נימי לתוך קצה אחד של נימי OD 100 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר, למשך פרק ~ 6 מ&quot;מ; במקרה הצורך, יש למלא אחר המבצע הזה תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טיפה קטנה של E6000 הדבק סביב צומת של הנימים מזהים 90 מיקרומטר OD / 100 מיקרומטר עם סופו של Q-Tip, ולתת את התרופה הדבקה O / N ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את 20 מוכנס מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD נימי באורך של ~ 10-15 מ&quot;מ; זה יהיה פולט יינון electrospray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לחתוך באמבטיה &quot;OD הצצה, 1/16&quot; הצצה OD ו 1/16 &quot;OD PTFE 1/32ing לחתיכות של 4-5 ס&quot;מ אורך; אלה יהיו השרוולים המשמשים איגודים נימי למתן חיבור חופשי דליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הקצה השני של נימי OD 100 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר לאיחוד הצצה; להשתמש שרוול 1/32 &quot;הצצה למתן חיבור דליפה חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס / להדק פיסת ~ 5 ס&quot;מ 1/16 &quot;צינורות PTFE אל הקצה השני של האיגוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ~ 4 מ&quot;ג של C18 (5 מיקרומטר) חלקיקים בתוך מראש לנקות / יבשים 2 בקבוקון זכוכית מ&quot;ל; להוסיף 0.5 מ&quot;ל isopropanol, לסגור את הבקבוקון לפזר את התערובת הדלילה באמבטיה ultrasonicator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משיכה עם מזרק 250 μl כ 200 סלארי μl, הכנס את מחט המזרק בצינור 1/16 &quot;PTFE של האיגוד הצצה, ולחלק את התערובת הדלילה לאט לתוך נימי OD 100 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר; להתבונן תחת מיקרוסקופ כמו נימים מתמלאות חלקיקים עד אורך של אריזת 2-3 מ&quot;מ מושגת; זה יהיה microreactor (איור 1) 20 μ.נימים מ מזהה שומרות על חלקיקי microreactor דרך שפעת Keystone. 15 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את microreactor עם ~ 50 μl פתרון של H 2 O / CH 3 CN 50:50 v / v, ולאחר מכן עם ~ 50 μl פתרון של H 2 O / CH 3 CN 98: 2 V / V. </li></ol> 2. הכנת פתרונות לדוגמא הערה: תפעול הכרוכות בטיפול של ממיסים אורגניים וחומצות והכנת הפתרון הם להתבצע במנדף. תלבש משקפי מגן, כפפות וביגוד מגן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם CH 3 OH ולייבש כמה צלוחיות זכוכית (4 מ&quot;ל) צינורות פוליפרופילן (15 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של פתרון של H 2 O / CH 3 CN (98: 2 V / V) בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ&quot;ל ידי ערבוב 9.8 מ&quot;ל H 2 O עם 200 μl CH 3 CN; ומערבבים על ידי sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של פתרון של H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ&quot;ל על ידי ערבוב 5 מ&quot;ל H 2 &lt;/ sub&gt; O עם 5 מ&quot;ל CH 3 CN; ומערבבים על ידי sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4 מ&quot;ל של תמיסה מימית acidified (נ 0.01% TFA / v) על ידי הוספת 4 μl TFA (10%) ל -4 מ&quot;ל H 2 O / CH 3 CN (98: 2 V / V) בבקבוקון זכוכית 4 מ&quot;ל; ומערבבים על ידי sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4 מ&quot;ל של פתרון אורגני acidified (נ 0.01% TFA / v) על ידי הוספת 4 μl TFA (10%) ל -4 מ&quot;ל H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) בקבוקון זכוכית 4 מ&quot;ל; ומערבבים על ידי sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 16 מ&quot;ג NH 4 HCO 3 עם microbalance אנליטיות בקבוקון זכוכית 4 מ&quot;ל; להוסיף 4 מ&quot;ל של H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) פתרון ולפזר על ידי sonication; הדבר גורם פתרון 50 מ&quot;מימ של NH 4 HCO 3 (pH ~ 7.8) במאגר מימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 5 מ&quot;ג של חלבון סטנדרטי (למשל, אלבומין בסרום שור, המוגלובין α / β, ציטוכרום C, anhydrase פחמתית, α-2-HS-גליקופרוטאין, וכו &#39;) עם microbalance אנליטיות בקבוקון זכוכית 4 מ&quot;ל; להוסיף שתייה DI 4 מ&quot;לr ולפזר על ידי sonication; זה בדרך כלל תוצאות פתרון ריכוז גבוהה מיקרומטר-רמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מ&quot;ל פתרון חלבון (1-2 מיקרומטר) על ידי דילול פתרון ריכוז מיקרומטר ברמה גבוהה עם נפח מתאים של NH 4 HCO 3 (50 מ&quot;מ) חיץ מימית; ומערבבים על ידי sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון טריפסין (5 מיקרומטר) על ידי המסת טריפסין 20 מיקרוגרם רצף כיתה ב 170 μl NH 4 HCO 3 (50 מ&quot;מ) חיץ מימית; לפזר על ידי sonication. </li></ol> 3. הגדרת ניסוי הערה: מערכת LTQ-MS מצויד מקור ESI שונה הכוללת XYZ שלבית מובנה הביתה המאפשר התממשקות של ספקטרומטר מסה לגישות קלט מדגם שונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתקתי את microreactor הנימים מהאיגוד הצץ ולהתחבר טי הצץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס ~ 2 ס&quot;מ חוט Pt בזרוע בצד של טי הצצה; להשתמש שרוול הצצה &quot;1/32 למתןדליפה ללא חיבור עבור בידוד חוט Pt. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר OD 50 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר (~ 0.5 מ &#39;אורך) נימי מדגם העברה לקצה השני של טי הצצה; להשתמש שרוול 1/32 &quot;הצצה למתן חיבור דליפה חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את טי הצצה על הבמה-XYZ ומקם את מ&quot;מ ESI פולט ~ 2 הרחק נימי מפרצון ספקטרומטר מסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הכבל Pt למקור אספקת החשמל ESI של ספקטרומטר מסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הקצה השני של נימי העברת מדגם לאיחוד נירוסטה; להשתמש שרוול 1/16 &quot;הצצה למתן חיבור דליפה חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינורות PTFE 1/16 &quot;4-5 ס&quot;מ עד הסוף השני של האיחוד נירוסטה להכניס את המחט במזרק 250 μl בצינור PTFE; להפעיל את המשאבה ולהגדיר את קצב הזרימה לפי השווי הרצוי (למשל, 2 μl / min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרי רכישת נתוני הקלט טנדם MS לתוך חבילת התוכנה שולטת מכשיר MSd לשמור כקובץ שיטה ולהכין את ההתקנה לביצוע הניתוח; עבור מערכת LTQ-MS, השתמש בפרמטרי ניתוח הנתונים התלויים הבאים: הדרה דינמית הופעל עבור 180 שניות עם רוחב המוני הדרת ± 1.5 מ &#39;/ z; אחד MS סריקה ואחריו זום אחד ו- MS 2 סריקות על 5 הפסגות האינטנסיביות ביותר העליונות, זום רוחב סריקת ± 5 מ &#39;/ z; דיסוציאציה התנגשות מושרה (CID) פרמטרים שנקבעו ברוחב בידוד 3 מ &#39;/ z, אנרגית התנגשות מנורמלת 35%, ש הפעלת 0.25, וזמן הפעלה של 30 מילים-שניות. </li></ol> 4. הגדרת Microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מכשיר microfluidic זכוכית או מצעים פולימריים; 16-18 הפריסה של המכשיר מסופקת 2A איור, מורכב microreactor (1) (אורך רוחב 0.13 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ x 50 מיקרומטר עמוקים) מחוברים כניסה (2 ), מוצא (3) וכן יציאה בצד (4); ערוצי מקשרות מניפולציות fluidic הם ~110 מיקרומטר רחב ו ~ 50 מיקרומטר עמוק; מבנה רב (5), מורכב ~ 1.5-2 מיקרומטר עמוק x 10 מיקרומטר x הרחב 100 מיקרומטר microchannels הארוך להציב 25 מיקרומטר בנפרד, יפעל כמסנן עבור שמירה על חלקיקי microreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל חיבורים נוזלים למסירת השבב על ידי הדבקת מחברים מיוחדים ליציאות המפרצון, או על ידי המצאת עמדת פולימריים המתאימה אבזרים למסירת נוזל (איור 2 ב). 16 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תרחיף של חלקיקים C18 (5 מיקרומטר) כמתואר בשלב 1.8; לספק את התערובת הדלילה אל microreactor עם מזרק באמצעות צינורות 1/16 &quot;PTFE המחובר ליציאת שבב הצד (4); לאטום את הנמל לאחר טעינת חלקיק עם דבק אפוקסי תרופה עבור שעה 1 בתנור ב 90 ºC 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס נימי (20 מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD x 10 מ&quot;מ אורך) בנמל לשקע, חותם עם דבק E6000, ולתת תרופה O / N; זה יהפוך את פולט ESI ( <sטרונג&gt; 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר OD 50 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר (~ 0.5 מ &#39;אורך) נימי מדגם העברה לנמל כניסת שבב (2); חבר את הקצה השני של נימי מזרק μl 250 ואת משאבת מזרק, כמתואר 3.6-3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מחבר הצצה טי קל משקל על קו העברת מדגם קצר לפני יציאת הכניסה (2) והכניס תיל Pt על הזרוע בצד של טי, כמתואר 3.2; זה יהיה האלקטרודה ESI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את המכשיר microfluidic על הבמה XYZ עם פולט ESI ממוצבת ~ 2 מ&quot;מ מן נימי מפרצון ספקטרומטר מסה; להכין את MS לניתוח כמתואר 3.8. </li></ol> 5. טוען לדוגמא, פרוטאוליטים עיכול Elution עבור ניתוח MS הערה: כל השלבים העברה פתרון / מדגם מבוצעים בעזרת משאבת מזרק וצריך לאפשר לכמה דקות נוספות כדי להשלים, כדי לפצות על-volum מתes הקשורים קווי העברה ומן microreactor; את הזמן הדרוש יהיה תלוי את הספיקות מעורבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את microreactor ולהכינו ניתוח על ידי יציקת בתמיסה מימית של NH 4 HCO 3 (50 מ&quot;מ) H 2 O / CH 3 CN (98: 2 V / V) בשעה 2 μl / דקה 5 דקות; להשתמש במזרק 250 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טענו מדגם החלבון (1 מיקרומטר) על microreactor ידי יציקת הפתרון המדגם ב 2 μl / דקה 5 דקות; להשתמש במזרק 250 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות את הפתרון טריפסין (5 מיקרומטר) על חלבון adsorbed על microreactor ב 2 μl / דקה במשך 1-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את תהליך העיכול פרוטאוליטים על ידי שטיפת microreactor עם בתמיסה מימית acidified של TFA (0.01% v / v) H 2 O / CH 3 CN (98: 2 V / V) בשעה 2 μl / דקה 5 דקות; להשתמש במזרק 250 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל משחררי החלבון לעכל מן microreactor על ידי יציקת פתרון אורגני acidified של TFA (0.01%v / v) H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) ב 300 NL / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תהליך רכישת נתונים MS ואת מתח ESI (~ 2,000 V); לרכוש נתונים MS באמצעות הפרמטרים רכישת נתונים הניתנים בשלב 3.8; להתבונן elution של פפטידים tryptic. </li></ol> 6. עיבוד נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את הנתונים MS טנדם עם מנוע חיפוש תואם לפורמט נתונים MS גלם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את קבצי גלם LTQ-MS באמצעות אורגניזם ספציפי מינימאלי מסד נתוני חלבון מיותר; להעלות את הנתונים הגולמיים של מנוע החיפוש, להגדיר את העמידות המוני הורה שבר יון ל Da 2 ו -1, בהתאמה, ולהשתמש רק שברי tryptic מלא עם עד שני החמיץ שסעים עבור החיפוש; אינו מאפשר שינויי posttranslational; להגדיר את שיעורי גילוי הגבוהים וביטחון בינוני שווא (FDR) עד 1% ו -3%, בהתאמה, אינו מאפשר שינויי posttranslational. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנן את הנתונים כדי לבחור ברמת ודאות גבוהה רקפפטיד תואם את החלבונים המופיע במאגר; להעריך את תוצאות חלבון פפטיד-רמה. </li></ol>

<ol><li>Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetersen%2C+DH+%22Encyclopedia+of+Microfluidics+and+Nanofluidics%22">Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics</a>. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).</li>
<li>Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+applications+of+immobilized+microfluidic+enzymatic+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Technol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).</li>
<li>Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+enzymatic+reactors+for+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic enzymatic reactors for proteome research.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).</li>
<li>Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping%3A+strategy%2C+characterization%2C+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22LabChip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance.</a> LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).</li>
<li>Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchip-based+proteolytic+digestion+system+driven+by+electroosmotic+pumping%5BTitle%5D)+AND+%22LabChip%22%5BJournal%5D)">A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping.</a> LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).</li>
<li>Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-immobilized+microfluidic+process+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Enzyme-immobilized microfluidic process reactors.</a> Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).</li>
<li>Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).</li>
<li>Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+microfluidic+enzyme+reactor+utilizing+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads.</a> Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).</li>
<li>Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticle+assembly+microfluidic+reactor+for+efficient+on-line+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).</li>
<li>Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titania+and+alumina+sol-gel-derived+microfluidics+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping%3A+design%2C+characterization%2C+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance.</a> J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).</li>
<li>Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+protein+digestion+through+the+confinement+of+nanozeolite-assembled+microchip+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors.</a> Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).</li>
<li>Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+enzyme+reactor+and+high+resolving+chromatography+in+%26%2334%3Bsub-chip%26%2334%3B+dimensions+for+sensitive+protein+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in &#34;sub-chip&#34; dimensions for sensitive protein mass spectrometry.</a> Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).</li>
<li>Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-enhanced+enzyme+reaction+for+protein+mapping+by+mass+spectrometry%3A+A+new+approach+to+protein+digestion+in+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes.</a> Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).</li>
<li>Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-assisted+sample+preparation+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis.</a> Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).</li>
<li>Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tapers+and+restrictors+for+capillary+electrochromatography+and+capillary+electrochromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).</li>
<li>Lazar, I. M., Kabulski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+LC+Device+with+Orthogonal+Sample+Extraction+for+On-Chip+MALDI-MS+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection.</a> Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).</li>
<li>Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+and+sample+injection+systems+on+a+planar+glass+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip.</a> Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).</li>
<li>Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Injection+Schemes+and+Column+Geometry+on+the+Performance+of+Microchip+Electrophoresis+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices.</a> Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).</li>
<li>Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Proteomic+Protocol+for+Biomarker+Fingerprinting+in+Cancerous+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).</li>
<li>Doucette, A., Craft, D., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometric+Study+of+the+Effects+of+Hydrophobic+Surface+Chemistry+and+Morphology+on+the+Digestion+of+Surface-Bound+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).</li>
<li>Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Liquid+Chromatography+System+for+Proteomic+Applications+and+Biomarker+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening.</a> Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).</li>
<li>Lazar, I. M., Karger, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Open-Channel+Electroosmotic+Pumping+System+for+Microfluidic+Sample+Handling%2C%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,&#34.</a> Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).</li>
<li>Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+TOFMS+Detection+for+Capillary+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis.</a> Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Microreactor המתואר בעבודה זו מספק קל ליישם התקנה ניסיונית לביצוע עיכול אנזימטי של חלבונים כדי לאפשר ניתוח MS והזדהות תוך פחות מ -30 דקות. היתרונות הברורים של מערכת זו, בהשוואת גישות קונבנציונליות, כוללים פשטות, מהירות, צריכת מגיב נמוכה ועלויות נמוכות. בפרט, אין צורך חרוזי מחסניות טריפסין משותקים יקרים. הכנת microreactor הנימים היא פשוט (איור 1 א), והוא יכול להיות מושלם בתוך דקות מחומרים סטנדרטיים, נפוצים במעבדה כרומטוגרפיה. בעוד חלקיקים C18 שלב התהפכה ניתן לשטוף ...

זיהוי ואפיון של חלבונים מטוהרים מושגת לעתים קרובות על ידי שימוש בטכניקות MS. החלבון מתעכל עם אנזים ופפטידים שלה מנותחים עוד יותר על ידי MS באמצעות התקנה ניסיונית עירוי פשוט. עיכול פרוטאוליטים הכרחי להפקה שברי פפטיד קטנים שנופלים הטווח המוני השימושי של רוב מנתחי MS, וזה יכול להיות מקוטע בקלות דרך התנתקות מושרה התנגשות אנרגיה נמוכה להפקת מידע רצף חומצות האמיניות. עבור חלבונים מבודדים או תערובות חלבון פשוט, אין צורך עוד הפרדה chromatographic של פפטידים לפני גילוי MS. תערובת של פפטידים 25-50 להיות יכולה לנתח בקלות על ידי יציקת המדגם עם משאבת מזרק ישירות מקור יון MS. ספקטרומטר המסה יכול לבצע את הניתוח ולאשר את הרצף של חלבון בתוך מסגרת זמן קצרה. בעזרת שיטות איסוף הנתונים מודרניות, תהליך זה יכול להתבצע within כמה דקות או אפילו שניות. הגורם המגביל בהשלמת התהליך על בקנה מידת זמן קצר הוא צעד העיכול פרוטאוליטים. בדרך כלל, זה מתבצע על פני כמה שעות (או O / N), בתמיסה, ב 37 ºC, באמצעות מצע: יחסי אנזים של (50-100): 1. כדי לצמצם את זמן עיכול אנזימטי לדקות או שניות, microreactors אנזים משותק, בצורה של כורי microfluidic או מחסניות זמינות מסחרי, תוארו. 1-6 בדרך כלל, האנזים הוא משותק על ידי קוולנטיים, הלא קוולנטיים / ספיחה פיזית, מורכב היווצרות או אנקפסולציה, 3,6 יעילות משופרת של תהליך אנזימטי מתאפשר בזכות יחסי קרקע-נפח האנזים אל המצע גדול. יתרונות נוספים של כורים משותקים כוללים מופחת autolysis והתערבות של האנזים בניתוח MS, שיפור יציבות אנזים ויכולת שימוש חוזר. מגוון של גישות, באמצעות זכוכית או מכשירי microfabricated פולימריים תואר,באמצעות אנזימים משותקים על חרוזים מגנטיים ידי אינטראקציות נוגדן-אנטיגן, 7,8 הלכוד רשתות ננו-חלקיקים מזהב, 9 גלומים סול ג&#39;ל טיטניה-אלומינה 10 ו nanozeolites, 11 או נתפסו באמצעות Ni-נ.ת.ע או ההיווצרות המורכבת-Tag שלו. 6 לחלופין נימים, פתוח צינורי עם קיבוע אנזימים פותחו, כמו גם. 12 יתר על כן, מחשוף פרוטאוליטים משופר הודגם באמצעות הקרנת מיקרוגל מבוקר 13 או לחץ בסיוע או לחץ טכנולוגית אופניים (PCT) לצמצום זמני התגובה ל 30-120 דקות. 14 למרות היתרונות המרובים של כורי אנזים משותקים, העלויות של מחסניות מסחריות היא גבוהות, הזמין של מכשירי microfluidic לשימוש שיגרתי מוגבל, ושימוש תוצאות טכנולוגיות מיקרוגל או PCT ב צורך במכשור נוסף. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח שיטה כי circumveNTS החסרונות האלה, וזה יכול להיות מיושם בקלות בכל מעבדה להעצים חוקרים עם גישה פשוטה ויעילה לביצוע מחשוף אנזימטי של חלבונים כהכנה לניתוח MS בתוך דקות. הגישה מתבססת על השימוש הידרופובי, C18-חלקיקים שהם שנטענו מראש נימים או מכשיר microfluidic, ואת הספיחה של החלבון (ים) של עניין על חלקיקים אלה ואחריו עיכול אנזימטי במהלך העירוי של האנזים על מיטה וחלבון שנתפס ארוז (ים). לפי גישה זו, המצע הוא משותק באמצעות קישור לא קוולנטי, ואת האנזים הוא החדיר מעל החלבון ההמום. יעילות עיכול פרוטאוליטים מוגברת על-ידי אזורים פני החלקיקים גדולים החושפים את חלבון לעיבוד האנזימטית, מרחקים וזמני דיפוזיה אל מפני השטח של חלקיקים, שיפור העברת המוני, לא מצורף קוולנטיים שעשויים להשפיע על פעילותו של האנזים, היכולת במהירות evaluatשילובי דואר של אנזימים שונים, disposability, ריבוב אם התהליך מבוצע במתכונת microfluidic. גישה זו באה לידי ביטוי עם השימוש תערובת של חלבונים סטנדרטיים טריפסין-האנזים הנפוץ ביותר לעיכול פרוטאוליטים לפני גילוי ESI-MS. ספקטרומטר מסה משמש לגילוי במחקר זה היה quadrupole מלכודת ליניארי המכשיר (LTQ).

<table><tbody><tr><td>מלכודת יונים ESI-MS</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>ספקטרומטר המסה LTQ משמש לרכישת נתוני MS</td></tr><tr><td>טנדם שלב XYZ</td><td>ניופורט</td><td>חלקים מרובים</td><td>שלב ה-XYZ הביתי משמש להתאמת מקור הננו-ESI המסחרי LTQ לקבלת קלט ממערכות אספקת דגימות שונות</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>אופטיקה אדמונד</td><td>G81-278</td><td>המיקרוסקופ משמש לצפייה בתהליך אריזת המיקרו-כור</td></tr><tr><td>איזון אנליטי / Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>האיזון משמש לשקילת דגימות החלבון</td></tr><tr><td>אמבט אולטרסאונד / ברנסון</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>האמבטיה הקולית משמשת לערבוב / הומוגניזציה של הדגימות ופיזור משאבת המזרק של חלקיקי C18</td></tr><tr><td>22</td><td>מכשירי הרווארד</td><td>552222</td><td>המיקרו-משאבה משמשת להעמסה, שטיפה והוצאת הדגימה והאנזים על ומהמיקרו-כור הנימי הארוז</td></tr><tr><td>מערכת המים האולטרה-טהורים</td><td>Milli-Q EMD Millipore</td><td>ZD5311595&nbsp;</td><td>מערכת המים MilliQ משמשת להכנת מי DI מטוהרים</td></tr><tr><td>פיפטור/אפנדורף (1,000&nbsp; ומיקרו; l)</td> <td>VWR</td><td>53513-410</td><td>הפיפטור משמש למדידת כמויות קטנות של תמיסות מדגם</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&nbsp; ומיקרו; l)</td> <td>VWR</td><td>53513-406</td><td>הפיפטור משמש למדידת נפחים קטנים של תמיסות מדגם</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&nbsp; ומיקרו; l)</td> <td>VWR</td><td>53513-402</td><td>הפיפטור משמש למדידת כמויות קטנות של תמיסות דגימה</td></tr><tr><td>נימי סיליקה התמזגו (100 ומיקרו; מזהה m x 360 ומיקרו; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>נימי זה משמש לייצור</td></tr><tr><td>נימי סיליקה התמזגו במיקרו-ריאקטור (20&nbsp; ומיקרו; מזהה m x 100 ומיקרו; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>נימי זה משמש לייצור</td></tr><tr><td>נימי סיליקה התמזגו של פולט ESI (50&nbsp; ומיקרו; מזהה m x 360 ומיקרו; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>נימי זה משמש להעברת הדגימות והחומר הנוזל ממשאבת המזרק למיקרו-כור הנימים</td></tr><tr><td>סכין נימי</td><td>זכוכית Supelco</td><td>23740-U</td><td>זהו כלי לחיתוך נימי סיליקה התמזגו באורך הרצוי</td></tr><tr><td>Glue</td><td>Eclectic Products</td><td>E6000 Craft</td><td>דבק זה משמש לאבטחת פולט ה-ESI לתוך המיקרו-כור הנימי או השבב המיקרופלואידי,</td></tr><tr><td>דבק אפוקסי</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>דבק זה משמש לאיטום חור הכניסה המיקרופלואידית שדרכו נטענים חלקיקי C18</td></tr><tr><td>שלב הפוך C18 חלקיקים (5&nbsp; ומיקרו; m)</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>אלו הם חלקיקי C18 שעליהם נספגים החלבונים; החלקיקים הופקו מ-4&nbsp; מ"מ x 20 ס"מ עמוד C18 LC מבית Agilent</td></tr><tr><td>מזרק/זכוכית (250 ומיקרו; l)</td> <td>המילטון</td><td>81130-1725RN</td><td>מזרקי הזכוכית משמשים להעמסת תמיסת החלקיקים C18 במיקרו-כור הנימים ולהעברת הדגימה והחומרים למיקרו-כור</td></tr><tr><td>הפחתה פנימית PEEK Union (1/16 אינץ' עד 1/32 אינץ')</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>איחוד זה משמש לחיבור 250 ומיקרו; l מזרק למיקרו-כור לטעינת ה-5 והמיקרו; m חלקיקים slurry</td></tr><tr><td>איחוד נירוסטה (1/16 אינץ')</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>איחוד הנירוסטה משמש לחיבור מחט מזרק הזכוכית למחבר טי נימי עירוי</td></tr><tr><td>Microvolume PEEK (1/32 אינץ')</td><td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>טי ההצצה משמש לחיבור נימי העברת הדגימה למיקרו-כור הנימים; על זרועו הצדדית, הוא מאפשר הכנסת מחבר טי חוט Pt</td></tr><tr><td>(משקל קל)</td> <td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td><td>מחבר טי זה משמש להפעלת מתח ESI על השבב המיקרופלואידי דרך חוט העברת הדגימה</td></tr><tr><td>Pt (0.404 מ"מ)</td> <td>VWR</td><td>66260-126</td><td>חוט ה-Pt מספק חיבור חשמלי לייצור ESI ומחובר לספקטרומטר המסה ESI ספק כוח</td></tr><tr><td>צינורות PTFE (1/16 אינץ' OD)</td> <td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>צינורות הטפלון משמשים כדי לאפשר חיבור אטום בין מחט המזרק לאיחוד הנירוסטה&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות הצצה (0.015 אינץ' מזהה x 1/16 אינץ' OD)</td> <td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>צינורות ההצצה משמשים כשרוול כדי לאפשר חיבור אטום בין איחוד הנירוסטה ל-50&nbsp; ומיקרו; צינורות PEEK נימיים להעברת מזהה m</td></tr> (<tr><td>0.015 אינץ' מזהה x 1/32 אינץ' OD)</td> <td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>צינורות ההצצה משמשים כשרוול כדי לאפשר חיבור ללא דליפות בין נימי הסיליקה הממוזגים לבין</td></tr><tr><td>חותך צינורות הפולימר</td> Peek Tee Clean-cut <td>Valco</td><td>JR-797</td><td>חותך זה משמש לחיתוך מראש של 1/16 אינץ' ו-1/32 אינץ' צינורות פולימר הצצה המשמשים כשרוול לחיבורים ללא דליפות בחתיכות באורך ~4-5 ס"מ</td></tr><tr><td>בקבוקון ענבר (2 מ"ל)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>הבקבוקונים משמשים להכנת תמיסות לדוגמה ותמיסת החלקיקים C18&nbsp;</td></tr><tr><td>בקבוקון ענבר (4 מ"ל)</td> <td>VWR</td><td>66011-948</td><td>הבקבוקונים משמשים להכנת תמיסות לדוגמא</td></tr><tr><td>שפופרת פוליפרופילן (15&nbsp; מ"ל)</td> <td>פישר</td><td>12-565-286D</td><td>הבקבוקונים משמשים להכנת תמיסות חיץ</td></tr><tr><td>צילינדר (100 מ"ל)</td> <td>VWR</td><td>24710-463</td><td>הגליל משמש למדידת נפחי ממס</td></tr><tr><td>צילינדר (10 מ"ל)</td> <td>VWR</td><td>24710-441</td><td>הגליל משמש למדידת נפחים של</td></tr><tr><td>קצות פיפטה ממס (1,000 ומיקרו; l)</td> <td>VWR</td><td>83007-386</td><td>קצות הפיפטה משמשים למדידת כמויות קטנות של פתרונות לדוגמא</td></tr><tr><td>קצות פיפטה (100 ומיקרו; l)</td> <td>VWR</td><td>53503-781</td><td>קצות הפיפטה משמשים למדידת כמויות קטנות של פתרונות לדוגמה</td></tr><tr><td>קצות פיפטה (10 ומיקרו; l)</td> <td>VWR</td><td>53511-681</td><td>קצות הפיפטה משמשים למדידת כמויות קטנות של פתרונות מדגם</td></tr><tr><td>מצעי זכוכית</td> כתר לבן <td>ננופילם</td><td>B270, 3 אינץ' x 3 אינץ'</td><td>מדובר במצעי זכוכית לייצור שבבים</td></tr><tr><td>התאמת אגוז זכר (1/16 אינץ')</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>אביזר זה משמש לחיבור נימי העברה לשבב המיקרופלואידי,</td></tr><tr><td>מכלול ננו-פורט</td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>אביזר זה משמש לחיבור נימי העברה לשבב המיקרופלואידי</td></tr><tr><td>, תקני חלבון</td><td>סיגמא</td><td>מרובה #</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל, HPLC כיתה</td><td>פישר</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>מתנול, כיתה</td> <td>HPLCפישר</td><td>A452</td><td></td></tr> איזופרופנול, <tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td></td> בדרגת HPLC <td>Sigma</td> 650447 חומצה טריפלואורואצטית Sigma 302031 <td></td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין, דרגת ריצוף</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

עיבוד אנזימתי תענית חלבונים עבור איתור ms עם microreactor זרימה דרך

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

הרוב המכריע של ספקטרומטריית מסה (MS) מבוסס שיטות ניתוח חלבון בה התקדמות עיכול אנזימטי לפני הגילוי, בדרך כלל עם טריפסין. שלב זה הכרחי עבור הדור של פפטידים בעלי משקל מולקולרי קטן, בדרך כלל עם MW &lt;3,000-4,000 Da, כי ליפול בתוך טווח סריקה יעילה של מכשור ספקטרומטריית מסה. פרוטוקולים קונבנציונליים לערב עיכול אנזימטי O / N ב 37 ºC. ההתקדמות שחלה באחרונה הוביל לפיתוח של מגוון רחב של אסטרטגיות, בדרך כלל בתחום השימוש של microreactor עם קיבוע אנזימים או של מגוון רחב של תהליכים פיזיקליים משלימים המפחיתים את הזמן הדרוש לעיכול פרוטאוליטים לכמה דקות (למשל, מיקרוגל או גבוהה לַחַץ). בעבודה זו, אנו מתארים גישה פשוטה וחסכונית שיכול להיות מיושמת בכל מעבדה להשגת עיכול אנזימטי מהיר של חלבון. החלבון (או תערובת החלבונים) היא adsorbed על Perf הגבוהה C18-בונדד התהפכו פאזייםormance כרומטוגרפיה נוזלי (HPLC) חלקיקי סיליקה נטענו מראש טור נימים, טריפסין חיץ מימי הוא החדיר מעל החלקיקים לתקופה קצרה של זמן. כדי לאפשר on-line זיהוי MS, פפטידים tryptic הם eluted עם מערכת ממס עם תוכן אורגני גדל ישירות למקור MS יון. גישה זו תמנע את השימוש של חלקיקי קיבוע אנזימים יקרן ואינו מצריכה כל עזרה שתגיע להשלמת התהליך. עיכול חלבון וניתוח מדגם מלא ניתן להשיג בפחות מ ~ 3 דקות ו ~ 30 דקות, בהתאמה.

תוצאת נציג של תהליך עיכול פרוטאוליטים בצעה בו זמנית על תערובת של חלבונים, עם microreactors המתואר לעיל (איורי 1 או 2), מופיע בלוח 1. הטבלה כוללת רצף הפפטידים הייחודי לזהות חלבון מסוים, הצלב מתאם ציון (Xcorr) (כלומר, ציון המאפיין את איכות המשחק הניסיון אל התיאורטי הספקטרום ההמוני טנדם המקביל), מספר שסעים החמיצו, על המדינה לגבות פפטיד (z), ואת המסה / תשלום ( מ &#39;/ z) של פפטידים protonated. ברמת החלבון, הש...

מוצג פרוטוקול מהיר לעיכול פרוטאוליטי עם מיקרו-ריאקטור טריפטי שנבנה בזרימה פנימית יחד עם ספקטרומטר מסה של יינון אלקטרו-ספריי (ESI). מתוארים ייצור המיקרו-כור, מערך הניסוי ותהליך רכישת הנתונים.

עיבוד אנזימתי תענית חלבונים עבור איתור MS עם microreactor זרימה דרך

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לתאר את הייצור של מיקרו-ריאקטור טריפטיבי בעבודת זרימה, המבצע עיכול אנזימטי מהיר של חלבונים כדי לאפשר זיהוי חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה עם יינון בריסס חשמלי. השיטה יכולה לסייע בהדגמת רצף חומצות האמינו של חלבונים מבודדים ומטוהרים כדי לתמוך באפיון המשכי של מבנה ותפקוד. היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שהוא מהיר, יעיל מבחינה כלכלית ונוח לשילוב בתוך תהליכי עבודה המשתמשים בפלטפורמות מיוצרות במיקרו-פבריקציה.כדי להתחיל, השתמשו בחותך קפילרות זכוכית כדי לחתוך את צינור קפילרת הזכוכית הגדול יותר לאורך של שבעה עד שמונה סנטימטרים, ואת הקפילרה הקטנה יותר לאורך של שלושה עד חמישה סנטימטרים. השתמשו במיקרוסקופ כדי לוודא ששני קצוות הקפילרות נחתכו באופן נקי וישר, ללא שבבים בולטים. הכניסו את הקפילרה הקטנה יותר למשך כשישה מילימטרים לתוך אחד מקצותיה של הקפילרה הגדולה יותר.לאחר מכן, השתמשו במקלון צמר גפן כדי למרוח טיפה קטנה של דבק מסביב לחיבור של הנימיות, והניחו לדבק להתייבש למשך לילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חתכו את הנימה שהוכנסה לאורך של כ-10 עד 15 מילימטרים. קצה זה ישמש כפולט של יינון בריסס חשמלי (electrospray ionization).הכנס את הקצה הנגדי של הנימי בעל הקוטר הגדול יותר לתוך צינור PEEK בקוטר 1/32 אינץ', שנגזר מראש לאורך של בין ארבעה לחמישה סנטימטרים וחובר למחבר PEEK. לאחר מכן, הכנס והדק את קטע צינור ה-PTFE באורך חמישה סנטימטרים ובקוטר 1/16 לקצה הנגדי של המחבר. בבקבוק זכוכית נקי ויבש בנפח 2 מיליליטר, שקול 4 מיליגרם של חלקיקי C18 ולאחר מכן הוסף 0.5 מיליליטר של isopropanol.סגרו את הבקבוקון. מקמו אותו במכחול אולטרסוני (ultrasonicator bath) ובצעו סוניקציה כדי לפזר את החלקיקים באופן אחיד בתמיסה. לאחר מכן, השתמשו במזרק של 250 microliter כדי לשאוב 200 microliter של תגליגת ה-C18.החדירו את המזרק לתוך צינור ה-PTFE בקוטר 1/16 אינץ' והזרים את התחליב לאט אל תוך הקפילרה הגדולה. עקבו תחת המיקרוסקופ אחר מילוי הקפילרה בחלקיקים, עד להשגת דחיסה של חלקיקים בגובה של שני עד שלושה מילימטרים. צינור הקפילרה הקטן מחזיק את החלקיקים הללו במיקרו-ריאקטור באמצעות אפקט ה-keystone.לבסוף, שטפו את המיקרו-ריאקטור עם 50 µL של תמיסה ביחס של 50:50 של מים ואצטוניטריל, ולאחר מכן עם 50 µL של תמיסה המכילה 49 µL של מים המעורבבים עם 1 µL של אצטוניטריל. נתקו את המיקרו-ריאקטור הקפילרי ממחבר ה-PEEK וחברו אותו ל-PEEK-T. לאחר מכן, הכניסו למזלג הצד של ה-PEEK-T חוט פלטינה באורך של שני סנטימטרים, המבודד עם שרוול PEEK בקוטר 1/32-inch כדי להבטיח חיבור ללא דליפות.חבר קפילרית להעברת דגימות באורך חצי מטר לקצה הנגדי של ה-PEEK-T. השתמש בשרוול PEEK בגודל 1/32 אינץ' כדי להבטיח חיבור אטום ללא דליפות. קבע את ה-PEEK-T על במת ה-XYZ.מקמו את פולט יינון האלקטרוספריי (electrospray ionization emitter) במרחק של כ-שני מילימטרים מהנימי הכניסה של ספקטרומטר המסה. לאחר מכן, חברו את תיל הפלטינה למקור אספקת הכוח של יינון האלקטרוספריי בספקטרומטר המסה. כמו כן, חברו את הקצה הנגדי של נימי העברת הדגימה למחבר הפלדה אל-חלודה, באמצעות שרוול PEEK של 1/16-inch כדי להבטיח חיבור ללא דליפות.בשלב הבא, חברו קטע של 4 עד 5 ס"מ של צינור PTFE בקוטר 1/16 אינץ' לקצה הנגדי של מחבר הפלדה אל-חלודה. הזינו את פרמטרי רכישת הנתונים של ה-tandem MS, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף, לתוך חבילת התוכנה השולטת במכשיר ה-MS. שמרו אותם כקובץ שיטה כדי להכין את המערכת לביצוע האנליזה.מערכת ה-LTQ MS מצוידת במקור ESI משופר הכולל במה XYZ מתוכננת במעבדה, המאפשרת חיבור של ספקטרומטר המסה לגישויות שונות של הזנת דגימות. טענו מזרק של 250 µL בתמיסה מימיא של 50 mM ביקרבונט המומסים ב-2% acetonitrile. לאחר מכן, חברו את המזרק למיקרו-ריאקטור והניחו אותו תחת משאבת המזרקים.שטפו את המיקרו-ריאקטור בקצב של 2 µL לדקה במשך חמש דקות, כדי להכינו לאנליזה. לאחר מכן, טענו את דגימת החלבון הרלוונטית למזרק של 250 µL והזרימו את תמיסת הדגימה בקצב של 2 µL לדקה במשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו מזרק של 250 µL טעון בתמיסת trypsin בריכוז 5 µM תחת משאבת המזרקים, והזרימו אותה על החלבון שנספג במיקרו-ריאקטור בקצב של 2 µL לדקה למשך דקה אחת עד שלוש דקות.קריטי להפשיר ולהכין את תמיסת ה-trypsin באופן טרי לפני כל ניסוי. פעולה זו תבטיח שהאנזים הפרוטליטי ישמור על פעילותו ועל ה-pH התפעולי של המיקרו-ריאקטור, שהוא pH של כ-8. מלא מזרק נוסף בנפח 250 µL בתמיסה מימית המורכבת מ-0%1% של חומצה trifluoroacetic שנוספה ל-2% acetonitrile.השתמשו בתמיסה זו כדי לעצור את תהליך העיכול הפרוטאוליטי על ידי שטיפת המיקרו-ריאקטור בקצב של 2 µL לדקה למשך חמש דקות. לאחר מכן, עברו למזרק מלא ב-0.1% trifluoroacetic acid בתוספת 50% acetonitrile, והפעילו את תהליך רכישת נתוני ה-MS במתח Electrospray Ionization של כ-2000 V. השתמשו בתמיסה המוחמצת כדי להתחיל באלוציה של פהפטידי החלבון מהמיקרו-ריאקטור בקצב של 300 nL לדקה למשך 20 עד 30 דקות.רכשו נתוני ספקטרומטריית מסה באמצעות פרמטרי רכישת הנתונים המפורטים בפרוטוקול הטקסט המצורף. עבדו את קבצי ה-raw של ה-LTQ MS באמצעות מאגר חלבונים עם כפילות מינימלית, תחילה על ידי העלאת הנתונים הגולמיים למנוע החיפוש. לאחר מכן, הגדירו את סבילות המסות של יוני האב ויוני הפגמנטציה לשני וסוג אחד של דלטון בהתאמה, והשתמשו בחיפוש רק בפגמנטים טריפטיים מלאים עם עד שני שבירות חסרות.בנוסף, הגדירו את שיעורי התגליות השגויות (false discovery rates) עבור רמת ביטחון גבוהה ובינונית ל-1% ו-3% בהתאמה, ואל תאפשרו מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות, אלא אם כן אתם מחפשים מודיפיקציות ספציפיות. לבסוף, סננו את הנתונים כדי לבחור רק את התאמות הפפטידים ברמת ביטחון גבוהה. מוצג כאן ספקטרום מס המורכב מפפטידים טריפטיים שנוצרו מתערובת חלבונים שהועברה לפרוטאוליזה במיקרו-ריאקטור.תוויות אלו מייצגות את יוני הפפטידים הטריפטיים בעזמה הגבוהה ביותר ומספקות את הרצף שלהם ואת מזהה החלבון התואם. מיקרו-ריאקטור זה מספק מערך ניסיוני קל ליישום לביצוע עיכול אנזימטי של חלבונים ומאפשר ניתוח מסה וזיהוי בפחות מ-30 דקות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי שמירה על ניקיון המבחנות והמכשירים הבאים במגע עם התמיסות היא קריטית למניעת זיהום הדגימות.בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות לרכישת נתונים בספקטרומטריית מסות כדי לאפשר אפיון טוב יותר של הפפטידים הנוצרים ולענות על שאלות נוספות הקשורות למבנה של חלבונים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הפרוטאונומיקה לפתח פרוטוקולים מהירים יותר לניתוח חלבונים ולבחון פיתוח של פלטפורמות מיקרו-אנליטיות חדשניות המאפשרות סריקה בספיקה גבוהה של דגימות ביולוגיות. טכניקה זו מוגבלת לניתוח של תערובות חלבונים פשוטות למדי, המייצרות בין 25 ל-50 פפטידים.ניתן לנתח פפטידים אלו באמצעות ניסויי הזרקה (infusion) פשוטים, ואין צורך בהפרדה בכרומטוגרפיה נוזלית לפני ניתוח MS. זכרו כי עבודה עם ממסים אורגניים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון הימנעות מלהבות גלויות, בעת ביצוע הליך זה.

fast-enzymatic-processing-proteins-for-ms-detection-with-flow-through

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Digital מיקרופלואידיקה היא טכניקה מאופיין מניפולציה של טיפות בדידים (~ NL - מ"ל) על מערך של אלקטרודות על ידי יישום של שדות חשמליים. הוא מתאים היטב בביצוע מהיר, רציף, מבחני מיניאטורי ביוכימיים אוטומטיות. כאן אנו מדווחים פלטפורמה מסוגל מיכון כמה מדרגות עיבוד proteomic.

מיקרופלואידיקה דיגיטלי עבור עיבוד אוטומטי proteomic

בעבודה זו נסביר את ייצור ושימוש במיקסר microfluidic מסוגל ערבוב שני פתרונות ~~~HEAD=NNS 8 μs. כמו כן, אנו מדגימים את השימוש מערבלי אלה עם זיהוי ספקטרוסקופיות באמצעות הקרינה UV ותהודה הקרינה העברת אנרגיה (סריג).

מערבלים microfluidic ללימוד קיפול חלבונים

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

אלקטרונואידים מבוססי מיקרופלואידיג דיגיטלי היא טכניקה העושה שינוי מונחה מתח בזווית המגע לכאורה של droplet מיקרוליטר-נפח כדי להקל על המניפולציה שלה. שילוב זה עם חרוזים מגנטיים פונקציונליזציה מאפשר שילוב של מספר מבצעים ביחידת מעבדה עבור הכנה לדוגמה וזיהוי של פתוגנים באמצעות חיסוני מקושר אנזים (אליסה).

האלקטרו-מערכות מבוססות-פלטפורמת מיקרופלואידיקה דיגיטלית עבור מערכת חיסונית אוטומטית מקושרת אנזימים

סינתזות Lanthipeptide לזרז תגובות מרובות צעדים במהלך הביוסינתזה של מוצרים טבעיים פפטיד. כאן, אנו מתארים רציף, מלמטה למעלה, מימן-deuterium חילופי ספקטרומטריית מסה (HDX-MS) זרימת עבודה שניתן להפעיל כדי ללמוד את הדינמיקה הקונפורמטיבית של סינתטאז lanthipeptide, כמו גם אנזימים דומים אחרים המעורבים ביוסינתזה של מוצר טבעי פפטיד.

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

הפרוטוקול נועד להציג את השימוש בספקטרומטר מסה מרובע משולש לניטור תגובה מרובה (MRM) של חלבונים מדגימות קליניות. סיפקנו זרימת עבודה שיטתית החל מהכנת מדגם לניתוח נתונים עבור דגימות קליניות עם כל אמצעי הזהירות הדרושים שיש לנקוט.

זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית

פלטפורמה סטטית חדשה משמשת לאפיון מבנה החלבון ואתרי האינטראקציה בסביבת התאים המקומית תוך שימוש בטכניקת טביעת רגל של חלבון הנקראת חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים (IC-FPOP).

חממת פלטפורמה עם שלב Movable XY: פלטפורמה חדשה ליישום חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים

ההרכב המבני של אלפא-סינוקלאין מונומרי משפיע על תפקודו הפיזיולוגי ועל תכונותיו הפיזיקוכימיות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבצע ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה וניתוחי נתונים מאוחרים יותר כדי לקבוע מידע קונפורמי על המונומר של חלבון זה בעל הפרעה פנימית בתנאים פיזיולוגיים.

ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה לחקר הדינמיקה המבנית של אלפא-סינוקלאין בתנאים פיזיולוגיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לכידה וזיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות למחלה מתאים ורקמות מקומיות באמצעות בדיקות כימיות וספקטרומטריית מסה. מערכי הנתונים של האינטראקציה המתקבלים מנותחים באמצעות פלטפורמה ייעודית מבוססת אינטרנט כדי לחשוף ליקויים דינמיים ברשת ושינויים במסלול הקשורים למחלות.

מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

למד לבנות מיקרו-ריאקטור זרימה לעיכול אנזימטי מהיר של חלבונים לזיהוי ב-MS. שיטה זו מאפשרת ניתוח חלבונים ביעילות ובמהירות במחקר פרוטאומיקה.

עיבוד אנזימתי תענית חלבונים עבור איתור MS עם microreactor זרימה דרך

גלה סרטונים נוספים