עיבוד אנזימתי תענית חלבונים עבור איתור MS עם microreactor זרימה דרך

מוצג פרוטוקול מהיר לעיכול פרוטאוליטי עם מיקרו-ריאקטור טריפטי שנבנה בזרימה פנימית יחד עם ספקטרומטר מסה של יינון אלקטרו-ספריי (ESI). מתוארים ייצור המיקרו-כור, מערך הניסוי ותהליך רכישת הנתונים.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר את הייצור של מירקורקטור טריפטי זרימה המבצע עיכול אנזימטי מהיר של חלבונים כדי לאפשר זיהוי חלבון עם ספקטרומטר מסה יינון אלקטרוספריי. השיטה יכולה לעזור להמחיש את רצף חומצות האמינו של חלבונים מבודדים ומטוהרים כדי לתמוך באפיון במורד הזרם של מבנה ותפקוד. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מהיר, חסכוני ונוטה לשילוב בתהליכי עבודה העושים שימוש בפלטפורמות מיקרו-מפוברקות.

כדי להתחיל, השתמש בקליבר נימי זכוכית כדי לחתוך את צינור נימי הזכוכית הגדול יותר לאורך של שבעה עד שמונה סנטימטרים, ואת הקטן יותר לאורך של שלושה עד חמישה סנטימטרים. השתמש במיקרוסקופ כדי לוודא שלשני הקצוות הנימים יש חתך נקי וישר, ללא כתמים בולטים. הכנס את הנימים הקטנים יותר כשישה מילימטרים לקצה אחד של הגדול יותר.

לאחר מכן, השתמש ב-Q-tip כדי למרוח טיפת דבק קטנה סביב צומת הנימים, ותן לדבק להתרפא למשך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חותכים את הנימים המוכנסים לאורך של כ -10 עד 15 מילימטרים. קצה זה ישמש כפולט יינון אלקטרו-ספריי.

הכנס את הקצה הנגדי של הנימים בקוטר הגדול יותר לתוך צינור PEEK בגודל 1/32 אינץ' שנחתך מראש באורך של ארבעה עד חמישה סנטימטרים ומחובר לאיחוד PEEK. לאחר מכן, הכנס והדק את החתיכה באורך חמישה סנטימטרים של צינור PTFE 1/16 לקצה הנגדי של האיחוד. בקובץ זכוכית נקי ויבש של שני מיליליטר, שקלו ארבעה מיליגרם של חלקיקי C18 ולאחר מכן הוסיפו 0.5 מיליליטר איזופרופנול.

סגור את הבקבוקון. הנח אותו באמבט אולטרה-סאונד וסוניקט כדי לפזר את החלקיקים באופן שווה בתמיסה. לאחר מכן, השתמש במזרק של 250 מיקרוליטר כדי לשאוב 200 מיקרוליטר של תמיסת C18.

הכנס את המזרק לתוך צינור ה-PTFE בגודל 1/16 אינץ' והוציא את התרחיץ לאט לתוך הנימים הגדולים. התבונן במיקרוסקופ כאשר הנימים מתמלאים בחלקיקים, עד להשגת שניים עד שלושה מילימטרים של אריזת חלקיקים. הצינור הנימי הקטן יותר שומר על חלקיקים אלה במיקרו-כור באמצעות אפקט אבן ראש.

לבסוף, יש לשטוף את המיקרו-כור ב-50 מיקרוליטר של תמיסה של 50 עד 50 מים ואצטוניטריל, ואחריו 50 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 49 מיקרוליטר מים, מעורבב עם מיקרוליטר אחד של אצטוניטריל. נתק את המיקרו-כור הנימים מאיחוד PEEK וחבר אותו ל-PEEK-T. לאחר מכן, הכנס חוט פלטינה באורך שני סנטימטרים, מבודד בשרוול PEEK בגודל 1/32 אינץ' כדי לספק חיבור ללא דליפות לזרוע הצד של ה-PEEK-T.

חבר נימי העברת דגימה באורך חצי מטר לקצה הנגדי של ה-PEEK-T. השתמש בשרוול PEEK בגודל 1/32 אינץ' כדי לספק חיבור ללא דליפות. אבטח את ה-PEEK-T ב-XYZ stage.

ומקם את פולט היינון האלקטרו-ספריי במרחק של כשני מילימטרים מנימי כניסת ספקטרומטר המסה. לאחר מכן, חבר את חוט הפלטינה למקור אספקת החשמל ליינון אלקטרוספריי של ספקטרומטר המסה. כמו כן, חבר את הקצה הנגדי של נימי העברת הדגימה לאיחוד הנירוסטה, באמצעות שרוול PEEK בגודל 1/16 אינץ' כדי לספק חיבור ללא דליפות.

לאחר מכן, חבר חתיכה באורך ארבעה עד חמישה סנטימטרים של צינור PTFE באורך 1/16 אינץ' לקצה הנגדי של איחוד הנירוסטה. הזן את פרמטרי רכישת הנתונים הטנדם של MS כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה לחבילת התוכנה השולטת במכשיר MS. שמור אותם כקובץ שיטה כדי להכין את ההתקנה לביצוע הניתוח.

מערכת LTQ MS מצוידת במקור ESI שונה הכולל שלב XYZ ביתי, המאפשר התממשקות של ספקטרומטר מסה לגישות קלט הדגימה השונות. טען מזרק של 250 מיקרוליטר עם תמיסה מימית של 50 מילי-מולרית ביקרבונט מומס ב-2% של אצטוניטריל. לאחר מכן, חבר את המזרק למיקרו-כור והנח אותו מתחת למשאבת המזרק.

שוטפים את המיקרו-כור ושני מיקרוליטר לדקה למשך חמש דקות, כדי להכין אותו לניתוח. לאחר מכן, טען את דגימת החלבון המעניינת למזרק של 250 מיקרוליטר והחדיר את תמיסת הדגימה בשני מיקרוליטר לדקה למשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו מזרק של 250 מיקרוליטר טעון בתמיסת טריפסין של חמישה מיקרו-מולרים מתחת למשאבת המזרק, והחדירו מעל החלבון הנספג על המיקרו-כור במהירות של שני מיקרוליטר לדקה למשך דקה עד שלוש דקות.

זה קריטי להפשיר טרי ולהכין את תמיסת הטריפסין לפני כל ניסוי. זה יבטיח שהאנזים הפרוטוליטי ישמור על פעילותו ועל ה-pH התפעולי שלו של המיקרו-כור, שהוא pH של כ-8. טען מזרק נוסף של 250 מיקרוליטר עם תמיסה מימית המורכבת מ-0%1% של חומצה טריפלואורואצטית בתוספת 2% אצטוניטריל.

השתמש בתמיסה זו כדי להרוות את תהליך העיכול הפרוטאוליטי על ידי שטיפת המיקרו-כור בשני מיקרוליטר לדקה למשך חמש דקות. לאחר מכן, עבור למזרק מלא בחומצה טריפלואורואצטית 01% המוסיפה ל-50% אצטוניטריל, והפעל את תהליך רכישת הנתונים של MS במתח היינון של Electrospray לכ-2000 וולט. השתמש בתמיסה המחומצת כדי להתחיל להוציא את עיכול החלבון מהמיקרו-ריאקטור במהירות של 300 ננוליטר לדקה למשך 20 עד 30 דקות.

רכוש נתוני מפרט המוני באמצעות פרמטרי רכישת הנתונים המסופקים בפרוטוקול הטקסט הנלווה. עבד את קבצי הגלם של LTQ MS באמצעות מסד נתונים חלבוני מיותר מינימלי על ידי העלאת הנתונים הגולמיים תחילה במנוע החיפוש. לאחר מכן, הגדר את סובלנות מסת היונים של האב והשבר לשניים ואחד דלטון בהתאמה, והשתמש רק בשברים טריפטיים מלאים עם עד שני מחשופים שהוחמצו לחיפוש.

בנוסף, הגדר את שיעורי גילוי השווא ברמת ביטחון גבוהה ובינונית ל-1% ו-3% בהתאמה, ואל תאפשר שינויים לאחר התרגום, אלא אם כן מחפשים שינויים מסוימים. לבסוף, סנן את הנתונים כדי לבחור רק את התאמות הפפטיד ברמת המהימנות הגבוהה. מוצג כאן ספקטרום מסה המורכב מפפטידים טריפטיים שנוצרו מתערובת חלבונים שהייתה נתונה לפרוטאוליזה במיקרו-כור.

תוויות אלה מייצגות את יוני הפפטיד הטריפטיים האינטנסיביים ביותר ומספקות את הרצף שלהם ואת מזהה החלבון המתאים. מיקרו-כור זה מספק ניסוי קל ליישום המוגדר לביצוע עיכול אנזימטי של חלבונים ומאפשר ניתוח וזיהוי מסה תוך פחות מ-30 דקות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ששמירה על ניקיון הבקבוקונים והמכשור שבאים במגע עם תמיסות היא קריטית למניעת זיהום דגימה.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות לרכישת נתונים של ספקטרומטריית מסה כדי לאפשר אפיון טוב יותר של הפפטידים הגנרטיביים ולענות על שאלות נוספות הקשורות למבנה החלבונים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפרוטאונומיקה לפתח פרוטוקולים מהירים יותר לניתוח חלבונים ולחקור את הפיתוח של פלטפורמות מיקרופליטיות חדשות המאפשרות חקר תפוקה גבוהה של דגימות ביולוגיות. טכניקה זו מוגבלת לניתוח של תערובות חלבון פשוטות למדי המייצרות 25 עד 50 פפטידים.

ניתן לנתח פפטידים אלה על ידי ניסויי עירוי פשוטים ואינם מחייבים הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית לפני ניתוח טרשת נפוצה. אל תשכח שעבודה עם ממיסים אורגניים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הימנעות מלהבות פתוחות בעת ביצוע הליך זה.