פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא למדוד במדויק את ביטוי הגנים של פתוגן in vivo על מנת לשפוך אור על האופן שבו פתוגן מסתגל לסביבה הזיהומית וגורם נזק למארח שלו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחלות הזיהומיות לחקור את דינמיקת ביטוי הגנים של פתוגנים במהלך זיהום אמיתי בסוגי רקמות שונים ובנקודות זמן מרובות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא רגישה מאוד וניתנת לשחזור במיוחד.

שיטה זו מאפשרת לכמת את ביטוי הגנים של פתוגן מכמות זעירה של רקמות מזיהום בחיים האמיתיים. כדי להתחיל בהכנת ריאגנטים, הוסף 2-מרקפטואתנול כדי לחצץ RLT ולערבב היטב. הכינו תערובת 25:24:1 של תמיסת אלכוהול פנול-כלורופורם איזואמיל.

סמן צינורות הומוגניזציה מסוג M ומצנן על קרח. סמן שני צינורות מכסה בורג מיליליטר והוסף כ -300 מיקרוליטר חרוזי זירקוניה לכל צינור. הכינו את המכשירים הבאים לשימוש, כולל מפריד רקמות, מקצף חרוזים, צנטריפוגה שולחנית עם מתאמים לצינורות של 50 מיליליטר וצלחות 96 בארות ופוטומטר.

הסר כליות שהוקפאו בעבר שבודדו מעכברים נגועים בקלוביקן ממקפיא של 80 מעלות צלזיוס והניח קרח. הוסף 1.2 מיליליטר RLT לכל כליה. לאחר מכן שפכו כל כליה עם בופר לתוך צינור הומוגניזציה מסוג M.

כמות המאגר RLT בשימוש נקבעת אמפירית. יותר מדי מאגר RLT ידלל את ריכוז הדגימה בעוד שמעט מדי יהפוך את ההומוגנאט לצמיג מאוד וקשה מאוד לטיפול. לאחר מכן, באמצעות דיסוציאטור רקמות על ההגדרה הטעונה מראש RNA 2.01, הומוגניזציה של הכליות.

לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1000 x G למשך דקה אחת. מעבירים 600 מיקרוליטר מכל הומוגנט לצינור מכסה בורג המכיל חרוזי זירקוניה ושומרים את ההומוגנאט הנותר על קרח. הוסף 600 מיקרוליטר של אלכוהול איזואמיל פנול-כלורופורם לכל צינור, סגור היטב את המכסים ומערבול על מקצף החרוזים למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

צנטריפוגה בחום של 15, 000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו בזהירות את השלב המימי לצינור מיקרופוגה חדש של 1.5 מיליליטר, והוסיפו נפח שווה של 70% אתנול. לאחר מכן טען על עמוד הסיבוב וסובב ב-8, 000 x G.עם 700 מיקרוליטר של חיץ RW, שטפו כל עמוד סיבוב פעם אחת, ואחריו שתי שטיפות עם 500 מיקרוליטר RPE חיץ.

העבירו את העמודים לצינורות איסוף יבשים וסובבו דקה נוספת כדי להסיר את כל הנוזלים שנותרו. לבסוף, השתמש ב-50 מיקרוליטר מים כדי לסלק את ה-RNA. לאחר מכן השתמש בספקטרופוטומטר באנימטר OD 216 כדי למדוד את ריכוז ה-RNA.

כדי לבצע פרופיל ביטוי גנים באמצעות קידוד בר-דיגיטלי, התחל בהפשרת ערכת קוד המדווח וקוד הלכידה שהוגדר על קרח. הוסף 130 מיקרוליטר של מאגר הכלאה לערכת הקוד של המדווח. הפוך כדי לערבב ולהסתובב כלפי מטה.

לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר מהתערובת לכל אחד מ-12 צינורות התגובה. לאחר מכן מוסיפים 10 מיקרוגרם של רנ"א רקמה כולל לכל צינור ומערבבים על ידי פיפטינג. בהתאם למודל ההדבקה, גודל החיסון וזן הפתוגן בו נעשה שימוש, אחוז ה-RNA הפתוגן בתוך סך ה-RNA משתנה בין 0 ל-2% לכן יש לבצע אופטימיזציה אמפירית של הכמות הכוללת של RNA שיש להוסיף עבור כל אחד.

כעת הוסף חמישה מיקרוליטרים של קוד לכידה לכל צינור. מערבבים על ידי היפוך הצינורות ומסתובבים במהירות. לאחר מכן דגרו את התגובות במחזור תרמי בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס עם מכסה מחומם למשך כ -18 שעות.

הסר מחסנית דגימה אחת מ-20 מעלות צלזיוס ותן לה להתחמם לטמפרטורת החדר. הסר שתי לוחות ריאגנטים מארבע מעלות צלזיוס וסובב בצנטריפוגה על השולחן ב-670 x G למשך שתי דקות. לאחר מכן, הגדר את תחנת ההכנה בהתאם להוראות שלב אחר שלב על המסך, ובחר באפשרות הרגישות הגבוהה.

לאחר מכן הסר את התגובות מהמחזור התרמי והעמיס מיד על תחנת ההכנה. לאחר הפעלת תוכנית הרגישות הגבוהה של שלוש שעות, הסר את המחסנית והשתמש בסרט שקוף כדי לאטום את הנתיבים. מרחו שמן מינרלי על תחתית המחסנית במידת הצורך.

לאחר מכן טען את המחסנית על המנתח הדיגיטלי. הגדר את המנתח הדיגיטלי בהתאם להוראות המפורטות על המסך, ובחר באפשרות הסריקה ברזולוציה גבוהה. לאחר הפעלת תוכנית הסריקה, הורד את התוצאות או בחר לקבל אותן בדוא"ל ולייבא את הנתונים הגולמיים לתוכנת היצרן.

נתח את הנתונים על פי פרוטוקול הטקסט. לפרוטוקול המודגם בסרטון זה יש יתרון ייחודי בכך שהוא משתמש הן בבדיקת לכידה והן בבדיקת דוח כדי להגדיל את הספציפיות ולהפחית את הרעש מה-RNA המארח. כפי שמוצג כאן, ספירות גולמיות ברקע מדגימת רקמה לא נגועה היו כולן מתחת ל-10, בעוד שספירות גולמיות משתי דגימות רקמה נגועות היו כולן מעל 10.

לספירות גולמיות משתי דגימות ביולוגיות היה מתאם טוב מאוד עם ערך R בריבוע של 0.945. הפלטפורמה מספקת גם טווח דינמי מספיק כדי להקיף רמות ביטוי ביולוגיות טבעיות. באמצעות ערכת בדיקה המציינת 248 גנים לתגובה סביבתית, נקבעו שני שלבים של ביטוי גנים פתוגניים.

תגובה מוקדמת לביטוי גנים כוללת גנים עם רמות RNA שונות באופן משמעותי בין החיסון לדגימות 12 שעות לאחר ההדבקה. כמו כן התגלתה תגובה מאוחרת לביטוי גנים הכוללת גנים עם רמות RNA השונות באופן משמעותי בין דגימות של 12 שעות ל-48 שעות לאחר ההדבקה. תוצאות אלה מצביעות על כך שביטוי הגן C.albicans מווסת באופן דינמי במהלך זיהום פולשני של פונדקאי יונקים.

שיטה זו קלה ומהירה. כל ההליך מאיסוף הרקמות ועד לביטוי הנתונים לוקח פחות מ-48 שעות. הזמן המעשי הוא כארבע שעות עבור 12 דגימות.

בעוד ששיטה זו פותחה כדי ללכוד ביטוי גנים של פתוגן in vivo, ניתן להשתמש בה גם כדי לענות על ביטוי גנים מארח. לכן, חוקרים יכולים לקבל מידע שימושי משני צידי הזיהום בו זמנית.