פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא למדוד במדויק את ביטוי הגנים של פתוגן in vivo, כדי לשפוך אור על האופן שבו פתוגן מסתגל לסביבה הזיהומית וגורם נזק למאכסנו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מחלות הזיהום לבחון את דינמיקת ביטוי הגנים של פתוגנים במהלך זיהום ממשי בסוגי רקמות שונים ובנקודות זמן מרובות. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שהיא בעלת רגישות גבוהה וניתנת לשחזור רב.

שיטה זו מאפשרת לכמת את ביטוי הגנים של פתוגנים מכמות מזערית של רקמות מזיהום במציאות. כדי להתחיל בהכנת הריאגנטים, יש להוסיף 2-Mercaptoethanol לבאפר RLT ולערבב היטב. הכין תערובת של phenol-chloroform isoamyl alcohol alcohol ביחס של 25:24:1.

סמנו את מבחנות ההומוגניזציה מסוג M וקררו אותן על קרח. סמנו מבחנות עם מכסה הברגה בנפח שני מיליליטר והוסיפו לכל מבחנה כ-300 microliters של חרוזי זירקוניה. הכינו לשימוש את המכשירים הבאים, כולל ממיס רקמות (tissue dissociator), Bead beater, צנטריפוגת שולחנית עם מתאמים למבחנות של 50 milliliter ולפלטות של 96 בארות, ופוטומטר.

הוצאו כליות שהוקפאו בעבר, אשר בודדו מעכברים שהודבקו ב-C.albicans, ממקפיא של 80 מעלות צלזיוס והניחו אותן על קרח. הוסיפו 1.2 milliliters של באפר RLT לכל כליה. לאחר מכן, העבירו כל כליה יחד עם הבאפר לשפופרת הומוגניזציה מסוג M.

כמות באפר RLT שבה משתמשים נקבעת באופן אמפירי. כמות גדולה מדי של באפר RLT תדלל את ריכוז הדגימה, בעוד שכמות קטנה מדי תהפוך את ההומוגנאט לצמיגי מאוד ולקשה מאוד לטיפול. לאחר מכן, בעזרת מפרק רקמות (tissue dissociator) בהגדרה המוקדמת RNA 2.01, בצעו הומוגניזציה לכליות.

לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה ב-1000 x G למשך דקה אחת. העבירו 600 µL מכל הומוגנאט לשפופרת עם פקק הברגה המכילה חרוזי זירקוניה, ושמרו את שארית ההומוגנאט על קרח. הוסיפו 600 µL של phenol-chloroform isoamyl alcohol לכל שפופרת, סגרו את המכסים היטב, ובצעו וורטקס במכשיר ה-bead beater למשך שלוש דקות ב-4 °C.

סבבו בצנטריפוגה ב-15,000 G למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. העבירו בזהירות את הפאזה המימית למבחנה חדשה של 1.5 מיליליטר למיקרוצנטריפוגה, והוסיפו נפח שווה של 70% ethanol. לאחר מכן, העמיסו על עמודת ספין (spin column) וסבבו ב-8,000 x G. שטפו כל עמודת ספין פעם אחת עם 700 מיקרוליטר של buffer RW, ולאחר מכן בביצוע שתי שטיפות עם 500 מיקרוליטר של buffer RPE.

העבירו את העמודות למבחנות איסוף יבשות וסובבו במצנטריפוגה למשך דקה נוספת כדי להסיר שאריות נוזל. לבסוף, השתמשו ב-50 microliters של מים כדי לבצע אלוציה של ה-RNA. לאחר מכן, השתמשו בספקטרופוטומטר ב-OD 216 animeters כדי למדוד את ריכוז ה-RNA.

כדי לבצע פרופיל ביטוי גנים באמצעות קידוד ברקוד דיגיטלי, התחל בהפשרה של סט קודי הדחף (reporter code set) ושל סט קודי הלכידה (capture code set) על קרח. הוסף 130 µl של בופר היברידיזציה לסט קודי הדחף. הפוך את המבחנה לערבוב וסבב בצנטריפוגה להורדת הנוזל.

בשלב הבא, העבירו 20 µL מהתערובת לכל אחד מ-12 מבחנות התגובה. לאחר מכן, הוסיפו 10 µg של RNA רקמה כולל לכל מבחנה וערבבו באמצעות פיפטור. בהתאם למודל הזיהום, לגודל האינוקולום ולזן הפתוגן שבו נעשה שימוש, אחוז ה-RNA של הפתוגן בתוך ה-RNA הכולל משתנה בין 0 ל-2%. לכן, יש לבצע אופטימיזציה אמפירית לכמות ה-RNA הכוללת שיש להוסיף לכל דגימה.

כעת הוסיפו חמישה µL של capture code set לכל מבחנה. ערבבו על ידי הפיכת המבחנות וסובבו אותן במהירות בצנטריפוגה (spin down). לאחר מכן, דגרו את התגובות בטרמ 사이קלר (thermal cycler) בטמפרטורה של 65 °C עם מכסה מחומם למשך כ-18 שעות.

הוצא מחסנית דגימה אחת מ-20 °C והנח לה להגיע לטמפרטורת החדר. הוצא שתי פלטות ריאגנטים מ-4 °C וסובב אותן בצנטריפוגת שולחנית ב-670 x G למשך שתי דקות. לאחר מכן, הגדר את תחנת ההכנה בהתאם להוראות שלב אחר שלב המופיעות על המסך, ובחר באפשרות לרגישות גבוהה.

לאחר מכן, הוצא את התגובות מהמעגל התרמי (thermal cycler) והעמס אותן מיד לתחנת ההכנה. לאחר הרצת תוכנית הרגישות הגבוהה שנמשכת שלוש שעות, הוצא את המחסנית והשתמש בסרט שקוף לאטימת הנתיבים. מרח שמן מינרלי בתחתית המחסנית במידת הצורך.

לאחר מכן, טענו את המחסנית אל המנתח הדיגיטלי. הגדירו את המנתח הדיגיטלי בהתאם להוראות השלב-אחר-שלב המופיעות על המסך, ובחרו באפשרות לסריקה ברזולוציה גבוהה. לאחר הרצת תוכנית הסריקה, הורידו את התוצאות או בחרו לקבלן בדואר אלקטרוני, וייבאו את נתוני הגלם לתוכנת היצרן.

נתחו את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לפרוטוקול המוצג בסרטון זה יש יתרון ייחודי בכך שהוא משתמש הן בבדיקה ללכידה (capture probe) והן בבדיקה לדיווח (report probe) כדי להגביר את הספציפיות ולהפחית את הרעש הנובע מה-RNA של המארח. כפי שמוצג כאן, ספירות הגולמיות של הרקע מדגימת רקמה שאינה מזוהמת היו כולן נמוכות מ-10, בעוד שספירות גולמיות משתי דגימות רקמה מזוהמות היו כולן מעל 10.

ספירות גולמיות משני דגימות ביולוגיות הראו מתאם טוב מאוד עם ערך R squared של 0.945. הפלטפורמה מספקת גם טווח דינמי מספיק כדי להקיף רמות ביטוי ביולוגיות טבעיות. באמצעות מערך גששים המגדיר 248 גנים של תגובה סביבתית, נקבעו שני שלבים של ביטוי גנים של פתוגנים.

תגובת ביטוי גנים מוקדמת כוללת גנים עם רמות RNA השונות באופן מובהק בין דגימות האינוקולום לדגימות 12 שעות לאחר ההדבקה. כמו כן, התגלתה תגובת ביטוי גנים מאוחרת הכוללת גנים עם רמות RNA השונות באופן מובהק בין נקודת ה-12 שעות לדגימות 48 שעות לאחר ההדבקה. תוצאות אלו מעידות על כך שביטוי הגנים של C.albicans מווסת באופן דינמי במהלך זיהום פולשני של מאח ממлекоים.

שיטה זו היא פשוטה ומהירה. התהליך כולו, מאיסוף הרקמה ועד להצגת הנתונים, נמשך פחות מ-48 שעות. זמן העבודה המעשית הוא כארבע שעות עבור 12 דגימות.

בעוד ששיטה זו פותחה כדי ללכוד ביטוי גנים של פתוגנים in vivo, ניתן להשתמש בה גם כדי לבחון ביטוי גנים של המאכסן. לפיכך, חוקרים יכולים להפיק מידע שימושי משני צדי הזיהום בו-זמנית.