Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

שלום, אני טים דוסו מחקלאות ומזון חקלאי קנדה. בסרטון זה, נדגים פרוטוקול לקביעת הנוכחות והשפע של מיקרואורגניזמים ספציפיים בדגימה קלינית או סביבתית מורכבת באמצעות מכשיר ביו פלקס. פרוטוקול זה משתמש בחרוזי פוליסטירן פלואורסצנטיים המחוברים כימית לבדיקה אוליגונוקלאוטיד ספציפית למין.

אמפליקון נוצר מהדגימה באמצעות פריימרים אוניברסליים של PCR והאמפליקון מוכלא לחרוזים המצומדים לבדיקה. שני אותות נוצרים עם מכשיר הביו פלקס. אחד מזהה את החרוז ואחד מכמת את אות ההכלאה.

המטרה הכוללת של ההליך היא לקבוע פרופיל של המיקרוביוטה המעניינת בצורה מהירה וחצי כמותית. יישמנו טכניקה זו כדי לקבוע פרופילי חיידקים במקלוני הנרתיק ולהשתמש בנתונים שנוצרו כדי לאבחן וגינוזיס חיידקי, מצב קליני המאופיין בשינוי במיקרוביוטה שבה אורגניזמים לקטובצילוס הופכים פחות נפוצים ואורגניזמים אחרים כגון Gardnerella, vais ו-apoian vae הופכים לניתנים לזיהוי במקלוני הנרתיק. עם זאת, חשוב לזכור שניתן ליישם טכניקה זו על כל מיקרוביוטה אחרת שעבורה רצוי בדיקת מולטיפלקס מהירה.

נתחיל בתיאור אופן הפעולה של ההליך. פרופיל מיקרוביאלי נוצר על ידי הגברת חלבון וציפוי גן מלווה ב-60 מכל האורגניזמים הקיימים בתמצית DNA של הספוגית. אחד הפריימרים האוניברסליים להגברה משתנה על ידי הוספת ביוטין, כמו גם הכללת בסיסים ששונו על ידי פוספו.

בקצה החמישי הראשוני, האמפליקון נעשה חד-גדילי באמצעות T שבע אקסון נוקלאז, אשר משפיל רק את גדיל האנטיסנס. מכיוון שגדיל החישה מוגן על ידי פריימר PCR ששונה בפוספו, בדיקות אוליגונוקלאוטידים המשלימות לגדיל הנותר מחוברות קוולנטית לחרוזי פוליסטירן פלואורסצנטיים. כאשר כל צבע חרוז ייחודי מכיל בדיקה המזהה אורגניזם אחר, ניתן להשתמש בעד מאה חרוזים שונים לדגימה אחת.

תוצר ה-PCR החד-גדילי ממקלון הנרתיק מוכלל לתערובת חרוזים מצומדת בדיקה המכילה בדיקות עבור כל האורגניזמים המעניינים. מתווסף אתין FICO מדווח פלואורסצנטי שנקשר לבדיקות הביוטיניליות באמצעות מצומד סטרפטוק. לבסוף, תערובת ההכלאה מנותחת על מכשיר לומינקס או ביו פלקס, הבוחן כל חרוז בנפרד עבור אות זהות והכלאה.

תוצאות ניתוח זה מצביעות על נוכחותם של מיקרואורגניזמים ספציפיים ועוצמת אות ההכלאה קשורה לשפע של אותו אורגניזם. בדגימה, נוכחות של אורגניזמים הקשורים ל-BV יכולה לשמש לאבחון BV. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הכתם הגדול, הוא שנוצר מידע על נוכחותם של מיקרואורגניזמים ספציפיים ושפעם.

תדגים את ההליך ג'ניפר טאון, עוזרת מחקר במעבדה שלנו, Re להשהות את המיקרוספירות על ידי מערבולת למשך כ-20 שניות. העבירו 400 מיקרוליטר של מיקרוספירות לצנטריפוגה של צינור איינור ב-14, 000 פעמים G למשך דקה אחת, הסירו והשליכו את ה-snat Resus. השעו את המיקרוספירות ב -50 מיקרוליטר של 0.1 מולרי MES pH 4.5.

הוסף אנימו אחד של אוליגו לכידה למיקרוספירות וערבב על ידי מערבולת. הוסף 2.5 מיקרוליטר של תמיסת EDC טרייה למיקרוספרות. דגרו את התגובה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.

השליכו את תמיסת ה-EDC שהוכנה קודם לכן והכינו דגימה טרייה של 10 מיליגרם למיליליטר EDC במים. כאמור, הוסף עוד 2.5 מיקרוליטר של תמיסת EDC טרייה למיקרוספירות ולמערבולת למשך חמש שניות. דוגרים שוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.

שטפו את החרוזים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.02% מערבולת 20 כדי להשעות מחדש את צנטריפוגת החרוזים ב 14, 000 פעמים G.למשך דקה אחת, הסר והשליך את הסופרנטנט. שטפו שוב את החרוזים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.1% SDS Resus. תלו את החרוזים ב -100 מיקרוליטר של מאגר te.

ספרו את החרוזים בציטומטר המו כדי לקבוע את ריכוז המלאי. הכן תערובת מאסטר מיקרוספרה על ידי דילול כל חרוז לריכוז סופי של 100 חרוזים למיקרוליטר במאגר החיץ te החרוזים המצומדים על פי הפלקס הרצוי של הבדיקה אחסן את תערובת המאסטר של המיקרוספירה בארבע מעלות בחושך. ניתן לאחסן תערובת זו במשך חודשים אם נשמרת בתנאים אלה, לייצר מוצר PCR עבור כל דגימה.

כלול את ערכת הפריימר הראשוני של פוספולאט וביוטין מיד לאחר השלמת ה-PCR. הוסף שני מיקרוליטר של T 7 exonuclease לכל צינור PCR דגירה בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות. בתום הדגירה הזו, הוסיפו 12.5 מיקרוליטר של 0.5 מולארי E-D-T-A-P-H 8.0 בתערובת.

זה נותן בסך הכל כ-64.5 מיקרוליטר של מוצר PCR חד-גדילי. תערובת מאסטר של Resus Bend Microsphere עם פיפטה. יש להוציא כמות מתאימה לתוך שפופרת עינור.

מכסים את הצינור וסוניקט בסוניקה של אמבט מים למשך שתי דקות. הוצא 17 מיקרוליטר של מוצר PCR חד גדילי לבארות המתאימות בפרופיל נמוך 96. ובכן, צלחת מוסיפים 33 מיקרוליטר של תערובת חרוזים סוניקטיבית מושעה לכל אחד.

ובכן, מכסים את הצלחת בכיסוי סיליקון ומקישים. הכניסו בעדינות את הצלחת לתרמסייקלר עם תוכנית של 95 מעלות למשך חמש דקות, 60 מעלות למשך 10 דקות, 60 מעלות החזיקו או השעו 60 מעלות למשך חמש דקות. סיום, התחל את התוכנית.

הכינו תמיסת סטרפטוקוס עדן FICO Ethin טרייה. תזדקק ל-25 מיקרוליטר לבאר. הכינו סטרפטוקוקוס ואתין FICO על ידי דילול הגבעול במיליגרם אחד למיליליטר.

אחד מכל 50 עד 20 מיקרוגרם למיליליטר עם מאגר tmac חד פעמי. כאשר Thermocycler מגיע לשלב החזקה של 60 מעלות, פתח את המכסה, הסר את מכסה הסיליקון והוסף תמיסת סטרפטוק דין FICO ethin ישירות לכל אחד. ובכן, החזר את מכסה הסיליקון, סגור את מכסה התרמו-סייקלר וחדש את התוכנית.

בסיום התוכנית, הוצא את הצלחת והעביר אותה במהירות למכונת הביו פלקס לקריאה. יש לקרוא את הצלחת תוך 10 דקות. קרא את הצלחת בחום של 60 מעלות.

ודא שהביו פלקס התחמם מראש לטמפרטורה זו. זה מראה את התוצאות של כתמי גרם מתאימים ופרופילי לומינקס של דגימות אורך מפרט בודד בזמן אפס. כתם הגרם עולה בקנה אחד עם אבחנה קלינית של bv, וזה מאושש על ידי בדיקת Fiveplex Luminex המציגה אותות הכלאה חיוביים עבור אורגניזמים הקשורים ל-BV, כולל Gardner Relic, vais ו-Apoian Vae.

לקטובצילוס אינרס מזוהה גם ברמות נמוכות ככל שהזמן מתקדם. פרט זה עובר ממיקרוביוטה BV למיקרוביוטה רגילה כפי שמוצג על ידי כתמי גרם. ניתוח לומינקס של אותן דגימות מראה כי שפע Gardnerella Vaginalis מגיע לשיא ודעיכה בעוד שהלקטובצילוס אינרס גדל והופך לאורגניזם הדומיננטי בנקודת הזמן הסופית.

שימוש בשיטה זו לפרופיל המיקרוביוטה נוצר מידע על נוכחותם של אורגניזמים ספציפיים כמו גם על שפעם. מכיוון שהשיטה מבוססת על רצף, ניתן ליידע את תכנון הבדיקה על ידי ניתוח ריצוף עמוק וניתן לעקוב אחר מיקרואורגניזמים המזוהים על ידי שיטות ריצוף מהדור הבא בדגימות בצורה מהירה ובעלות נמוכה יחסית. צפייה בסרטון זה הייתה אמורה לתת לך הבנה טובה כיצד ליצור פרופיל מיקרוביאלי מדגימה באמצעות מכשיר Luminex או Bio Plex.

הראינו לך כיצד לחבר בדיקות אוליגונוקלאוטידים לחרוזים הפלואורסצנטיים, ליצור אליקון חד גדילי מדגימה קלינית או סביבתית, לבצע הכלאה ולקבוע את התוצאות במכשיר Luminex או Bio Plex. בהצלחה בניסויים שלך.