ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לפתח גישה חדשה לניתוח חלבוני ממברנה בסינפסות סרט הרשתית מבחינה כמותית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה של הרשתית כגון המיקום המדויק של חלבונים בסינפסות בתוך המעגל. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא יכולה להעריך את המספר, הצפיפות והמהירות של חלבונים מרובים בסינפסות סרט הרשתית.

כדי להדגים את הליך ההקפאה-החלפה והחתך הדק במיוחד, יש לנו את הרופאים רון פטרליה ויה-שיאן וואנג מליבת ההדמיה המתקדמת של NIDCD. כדי להתחיל בהליך זה, נתח גלגל עין מתחת למיקרוסקופ. לשם כך, הסר תחילה את הקרנית.

לאחר מכן הסר את העדשה והזגוגית מהמשטח הבין-רשתית בעזרת מלקחיים. לאחר מכן, מקלפים את הסקלרה עד לבידוד הרשתית מכוס העין. חותכים את הרשתית מיד לרצועות בעובי 100 200 מיקרומטר בעזרת סכין גילוח.

לאחר מכן, מערבבים את רצועות הרשתית ב-4% פרפורמלדהיד ב-0.1 PB מולארי. לאחר מכן, ב-4% פרפורמלדהיד בתוספת 0.01% גלוטרלדהיד בטמפרטורת החדר. לאחר מספר שטיפות ב-PB, עם 0.15 מילי-מולרי סידן כלורי, הגן בהקפאה על רצועות הרשתית עם גליצרול ב-0.1 PB מולארי, לפני החלפת הקפאה. לפני הנחת הרקמה הקפואה במחזיקי ההטבעה השטוחים, חותכים עיגול דק מגיליון פלסטיק שקוף ומניחים אותו בתחתית כל מחזיק כדי לאפשר הסרה קלה יותר של קופסת הדגימה המפולימרית בסיום.

כעת, הגדר את הרצף האוטומטי ב-AFS. מלא את ה-AFS בחנקן נוזלי והנח את מחזיקי ההטבעה השטוחים ב-AFS. מלאו אותם ב-1.5% אורניל אצטט במתנול וקררו אותם מראש.

כדי לצלול ולהקפיא את רצועות הרשתית בפרופאן נוזלי בטמפרטורה של 184 מעלות צלזיוס, השתמש במברשת דקה כדי להניח את הדגימות על חתיכות קטנות של סרט כפול המחובר לדפי המתכת בקצה מוטות הצלילה. לאחר מכן, נדפו חיץ נוסף באמצעות המברשת. צללו את המוטות לתוך הפרופאן הנוזלי למשך כחמש שניות.

לאחר מכן, העבירו אותם ל-AFS באמצעות תא הובלה קטן שמלא בחנקן נוזלי. לאחר הנחת הדגימה והמכשירים הקפואים, המלקחיים והאזמל, לתוך ה-AFS, יש לקרר את המכשירים בתא למשך מספר דקות לפני שנוגעים ברקמה. לחלופין, קררו אותם על ידי הנחת קצות המכשירים למשך כמה שניות לתוך תא ההובלה הקטן המלא בחנקן נוזלי.

לאחר מכן, הסר את הדגימה והסרט מהבדל בעזרת אזמל עדין. לאחר מכן, הניחו שתי חתיכות של חלקים קפואים בכל אחת משבע הבארות במחזיק האלומיניום השטוח עם 1.5% אורניל אצטט במתנול. שמור אותם על 90 מעלות צלזיוס למשך 32 שעות לפחות ב-AFS.

לאחר מכן, הגדל את הטמפרטורה בשלבים ל-45 מעלות צלזיוס ברצף האוטומטי. לאחר מכן, שטפו את הדגימות שלוש פעמים במתנול מקורר מראש. לאחר מכן, הסתנן לדגימות בהדרגה עם שרפי הטמעה בטמפרטורה נמוכה כמדיום הטבעה.

למחרת, החלף שוב את השרף והתאם את רמת השרף כדי להגיע לקצה העליון של הבארות. הגדר את נורת ה-UV על ה-AFS ופלמר את הדגימות באור UV ב-AFS עד סוף הרצף האוטומטי. לאחר מכן, הסר את הדגימות מה-AFS.

בדרך כלל, בלוקים לדוגמה עדיין מראים מעט ורוד וצבע. הנח את הדגימות קרוב לאור הפלואורסצנטי במכסה האדים הכימי בטמפרטורת החדר למשך הלילה, או עד שהן נראות צלולות לחלוטין. בשלב זה, חותכים חלקים דקים במיוחד בעובי 70 נונומטר עם אולטרה-מיקרוטום, ואוספים אותם על רשתות הניקל המצופות פחמן פורמבר.

שוטפים את הרשתות במים מזוקקים פעם אחת, ולאחר מכן שלוש שטיפות של TBS. לאחר מכן, דגרו את הרשתות ב-20 מיקרוליטר של 5% BSA ב-TBS למשך 30 דקות, ולאחר מכן ב-20 מיקרוליטר של תערובת המכילה אנטי-CTB עזים ונוגדנים לתת-יחידת NMDAR אחת למשך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הרשתות שלוש פעמים עם 20 מיקרוליטר TBS בכל פעם ב-pH 7.6.

לאחר מכן, שטפו את הרשתות פעם אחת עם TBS ב-pH 8.2 למשך חמש דקות. דגרו את הרשתות במשך שעתיים עם 20 מיקרוליטר של תערובת המכילה IGG נגד ארנב של חמור יחד עם חלקיקי זהב של 10 ננומטר, ו-IGG נגד עזים של חמור יחד עם חלקיקי זהב של 18 ננומטר. לאחר שעתיים, שטפו את הרשתות ב-20 מיקרוליטר TBS, ב-pH 7.6 שלוש פעמים, ולאחר מכן שטפו במים הטהורים במיוחד ולאחר מכן יבשו את הרשתות.

לאחר מכן, צבעו את הרשתות עם 5% אורניל אצטט במים מזוקקים למשך שמונה דקות, ולאחר מכן 0.3% ציטראט עופרת במים מזוקקים למשך חמש דקות בחושך. לניסויי תיוג משולש, דגרו את הרשתות למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם 20 מיקרוליטר של תערובת של CTB נגד עזים, PSD-95 נגד עכבר ואנטי ארנב UN2A. לאחר מכן, דגרו על הרשתות למשך שעתיים עם 20 מיקרוליטר של תערובת של IGGs יחד עם חלקיקי זהב של 18, 10 ו-5 ננומטר.

בחלק זה, הגדר תחילה את סרגל קנה המידה. לאחר מכן מדוד את אורך ה-PSD של דנדריטים RGC בודדים עם תוכנת ImageJ. לאחר מכן, ספרו את חלקיקי הזהב בטווח של 10 ננומטר מהממברנה בהתבסס על עובי ממוצע של שבעה עד תשעה ננומטר עבור קרום הפלזמה.

חשב את צפיפות החלקיקים כמספר חלקיקי הזהב למיקרומטר ליניארי. לאחר מכן, מדוד את המרחק בין מרכז כל חלקיק זהב לאמצע ה-PSD עבור מיקום סינפטי, או את קצה ה-PSD, עבור מיקום חוץ-סינפטי. תמונה זו מציגה את התווית הכפולה של אימונו-זהב של GluA2/3 ו-CTB.

זהו הסרט הקדם-סינפטי וחלקיקי הזהב הקטנים מקובצים ב-PSD של תהליכי ה-RGC. תמונה זו מציגה את התווית הכפולה של אימונוגולד של GluN2B ו-CTB. חלקיקי הזהב הקטנים נמצאים על קרום הפלזמה החוץ-סינפטי.

והתמונה הזו מציגה את התיוג הכפול של אימונוגולד של GluN2A ו-CTB. בדומה ל-GluA2/3, חלקיקים קטנים מקובצים בתוך ה-PSD. התווית המשולשת של אימונוגולד של GluN2A, PSD-95 ו-CTB מוצגת כאן.

חלקיקי זהב GluN2A וחלקיקי זהב PSD-95 ממוקמים במשותף בתוך ה-PSD על דנדריטים RGC חיוביים ל-CTB. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתקן את הרקמה בעדינות רבה, מכיוון שחלק מהאנטיגניות של החלבון, כמו זו של קולטני NMDA, פוחתת באופן ניכר עם קיבוע ממושך חזק. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות ולנתח חלבוני ממברנה בדיוק רב בסינפסות סרט הרשתית.