Name: ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: למד ניתוח כמותי ברזולוציה גבוהה של חלבוני קרום בסינפסות רצועת הכלים הרשתית באמצעות שיטת immunogold. טכניקה זו מאפשרת זיהוי מיקום מדויק של קולטני גלוטמט ומיפוי צפיפות חלבונים סינפטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תוכניות המיפוי של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NINDS) ואת המכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות (NIDCD), של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). אנו מודים מתקן NINDS EM ואת ליבת ההדמיה המתקדמת NIDCD (קוד # ZIC DC 000,081-03) לקבלת סיוע.

טיפול הטיפול בבעלי חיים היו בהתאם טיפול בבעלי חיים NIH והנחיות ועדת שימוש. ביום הלידה (P) 15-21 חולדות Sprague-Dawley, הזריקו 1-1.2% CTB בילטרלי דרך colliculus מעולה, נשמרו על 12: אור 12-hr: מחזור כהה. 1. קיבוע רקמת הרשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את חומרים והכלים באים: מיקרוסקופ לנתח, 2 מלקחיים עם טיפים עדינים מאוד, מספריים, נייר סינון תאי, פיפטה פלסטיק שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדה בתא סגור עם 2.0 מ&quot;ל halothane (הרדמה נשימתית). לקבוע הרדמה נאותה בשיטות הבאות: חוסר נסיגת כפה האחורי לאחר קמצוץ הבוהן, או חוסר רפלקס מצמוץ. ואז לערוף מיד עם גיליוטינה. הסר את העיניים עם זוג מספריים איריס ומניחים בצלחת זכוכית המכיל paraformaldehyde 4% חיץ פוספט 0.1 M (PB) ב- pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להסיר את התירסea ידי ניתוק החלק הקדמי של גלגל העין. הסר את העדשה זגוגי מפני שטח הרשתית הפנימית עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלף את בלובן העין עם שני מלקחיים עד הרשתית מבודדת עיינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הרשתית מיד לתוך 100 - 200 רצועות מיקרומטר בעובי בתער, ובכפוף קיבעון pH משמרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן רצועות הרשתית paraformaldehyde 4% ב 0.1 M PB ב 6.0 pH למשך 20 - 30 דקות ולאחר מכן ב 4% paraformaldehyde בתוספת 0.01% glutaraldehyde ב- pH 10.5 במשך 10 - 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפות כמה PB עם 0.15 מ&quot;מ CaCl 2 (pH 7.4 ב 4 ° C), cryoprotect רצועות רשתית עם גליצרול (60 דקות כל אחד ב 10%, 20%, 30%, אז O / N ב 30%) ב 0.1 M PB לפני להקפיא חילוף. </li></ol> 2. החלפת Freeze הערה: השיטה זו להקפיא החלפה היא שונה מן הפרוטוקול שפורסם קודם לכן 19,20. כמו כן, חשוב כי המכשירים הם מאוד קרים (ללבוש כפפות); otherwise, הרקמה עשויה להפשיר חלקית כאשר נגע עם המכשירים. כל הצעדים האלה נעשים בתוך החדר AFS ו המכשירים הם לא יכולים לנוע מעל השוליים של החדר. באופן דומה, קירור הולם של כל הכימיקלים המשמשים AFS הוא הכרחי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול-להקפיא את רצועות הרשתית פרופן נוזלי -184 מעלות צלזיוס מכשיר cryopreservation EM (CPC). בעזרת המברשת בסדר, מניח את הדגימות על חתיכות קטנות של קלטת מקל פעמים המצורפות בדלי המתכת שהולכים על הקצה של המוטות הצוללות (פתיל את החיץ נוסף באמצעות המברשת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול את המוטות אל פרופן נוזלי ולשמור שם בערך 5 שניות, ולאחר מכן להעביר אל המכשיר להקפיא החלפה אוטומטית (AFS) באמצעות תא תחבורה קטן כי הוא מלא עם חנקן נוזלי ( &quot;LN 2 מקורר מיכל העברת cryo &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצבת מדגם ומכשירים קפוא (מלקחיים אזמל) לתוך AFS, לקרר את המכשירים בתא עבור seדקות veral לפני נגיעה רקמות, או לקרר אותם על ידי הנחת טיפים של המכשירים במשך כמה שניות לתוך תא תחבורה קטן (מלאים בחנקן נוזלי ( &quot;LN 2 מקורר מיכל העברת cryo &#39;)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדי פעם את AFS, להסיר את מדגם הקלטת מן הבדל באמצעות אזמל בסדר. כמו כן, לשמור על בקרת זרימת גז חנקן, TF (TF מתואר שליטת רגולטור עבור LN 2 vaporiser &#39;) פתוחה במהלך הליכים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הצבת הרקמה הקפואה לתוך מחזיקי שטוח הטבעה (כלומר, לפני הגדרת AFS), לחתוך עיגול דק מסדין פלסטיק שקוף ומניחים אותו לתוך החלק התחתון של בעל כדי השורה התחתונה של כל טוב. זה מאפשר הסרה יחסית קלה של אבן polymerized הדגימה בסיום. הערה: בעבר, השתמשתי בשיטה אלטרנטיבית לבעלי ההטבעה השטוחים, והעסקת קפסולות רייכרט + ג&#39;לטין כפולות (ראה Petralia ו Wenthold, 1999) &lt;sup&gt; 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש רצף אוטומטית הבאים AFS (תוך שימוש בטרמינולוגיה מכשיר): T1 = -90 מעלות צלזיוס במשך 32 שעות, S1 = הטמפרטורה לעלייה של 4 מעלות צלזיוס / hr (11.3 שעות), T2 = -45 מעלות צלזיוס במשך 50 שעות, S2 = הטמפרטורה לעלייה של 5 מעלות צלזיוס / hr (9 שעות), T3 = 0 מעלות צלזיוס למשך 40 שעות (סה&quot;כ = 142.3 שעות). זה עלול לקחת 2 - 4 שעות למקום דגימות AFS (ב -90 ° C) לפני תחילת רצף מתוזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את החלקים הקפואים ב יצטט uranyl 1.5% מתנול ב -90 מעלות צלזיוס במשך&gt; 32 שעות ב AFS. מניח שתי חתיכות של רקמות (בדרך כלל) בכל אחד משבע הבארות בעל אלומיניום שטוח הטבעה (שלוש להשתלב AFS). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרקמה + הקלטת לתוך מתנול יצטט uranyl / בבארות והסירו את הסרט מאוחר יותר, בסמוך עד בינוני הטבעת תחילה (כגון Lowicryl HM20) הסתננות, אם זה קשה מדי כדי להסיר את רקמה מהקלטת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להגדיל את בשלבי הטמפרטורה ל -45 מעלות צלזיוס (+ 4 ° C לכל hr; ברצף האוטומטי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הדגימות שלוש פעמים מתנול precooled, באמצעות פיפטה פלסטיק קנס שקצו להסיר את הפתרון ישן מכל בעל שטוח הטבעה, ולאחר מכן באמצעות אחר פיפטה פלסטיק רגיל להוסיף מתנול הטרי precooled. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, תוך שימוש באותה השיטה, לחדור הדגימות בהדרגה עם שרפי הטבעה בטמפרטורה נמוכה כגון הטבעה הבינונית (HM20 / מתנול ב 1: 1 ו -2: 1, כל אחד עבור 2 שעות, ואחריו שרף טהור עבור שעה 2 ולאחר מכן לשנות את השרפים ולשמור O / N). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את השרף שוב למחרת, התאמת רמת השרף להגיע רק עד לקצה העליון של הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפלמר הדגימות (-45 ° C עד 0 ° C ברצף אוטומטי; + 5 ° C לכל hr) עם האור UV במשך 40 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להסיר את הדגימות מן AFS. בדרך כלל, בלוקים מדגמים עדיין להראות קצת הוורדרדות בצבע. מניח את הדגימות קרובות אור ניאון במנדף כימי, ב RT O / N או יותר עד שהם אפליקציההאוזן לגמרי ברור. </li></ol> 3. Postembedding EM immunogold Immunocytochemistry הערה: immunocytochemistry Postembedding מתבצע כמתואר 23,24,25. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי 1 מיקרומטר החלק עם ultramicrotome, סעיפי כתם עם 1% toluidine כחול, ולבחון אותם להתמצאות סעיף; כוון את לחסום הרקמות כדי להשיג את המטוס הרוחבי האופטימלי של חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 70 סעיפים ultrathin ננומטר עבה עם ultramicrotome ולאסוף אותם על רשתות חריץ ניקל מצופה Formvar-חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ורשתות פעם אחת המזוקק H 2 O ואחריו מלוח טריס שנאגר שלוש פעמים (TBS, 0.05 חיץ M טריס, 0.7% NaCl, pH 7.6) לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רשתות ב 20 טיפות μl של BSA 5% ב TBS למשך 30 דקות, ולאחר מכן ב 20 טיפות μl של תערובת המכילה עז נגד CTB (1: 3,000) ו נוגדן כדי GluN2A (נגד ארנב למקטע NMDAR אחד 01:50 , GluN2B 1:30), או GluA2 נגד ארנב / 3 (1:30)ב TBS-טריטון (TBST, 0.01% Triton X-100, pH 7.6) עם BSA 2% ו 0.02 M NaN 3 O / N ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשתות לשטוף על שלוש טיפות נפרדות (20 μl) של TBS (pH 7.6) במשך 10, 10, ו -20 דקות, ואחריו TBS (pH 8.2) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רשתות עבור שעה 2 על טיפות (20 μl) של תערובת המכילה IgG נגד ארנב חמור (1:20) מצמידים 10 חלקיקי זהב ננומטר IgG נגד עז חמור (1:20) מצמידים את חלקיקי זהב 18 ננומטר ב TBST (pH 8.2) עם 2% BSA ו 0.02 M NaN 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רשתות ב 20 טיפות μl של TBS (pH 7.6) במשך 5, 5, ו -10 דקות, ולאחר מכן במים ultrapure ולאחר מכן לייבש אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשתות Counterstain עם אצטט uranyl 5% ו -0.3% ציטראט הובלת H המזוקק 2 O עבור 8 ו -5 דקות בתנאים כהים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים משולש תיוג, דגירת רשתות O / N ב RT עם 20 טיפות μl של תערובת של אנטי-העז CTB (1: 3,000), אנטי עכבר PSD-95 (1: 100), ו GluN2A נגד ארנב (1 : 50). ואז דגירה רשתות עבור שעה 2 על 20 טיפות μl של תערובת של IgGs מצמידים 18, 10, ו -5 חלקיקי זהב ננומטר TBST (pH 8.2) עם 2% BSA ו 0.02 M NaN 3. שמור אותו נוהל כמו תיוג כפול לרחצה counterstaining בין ואחרי הדגירה נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרות בוצעו בו נוגדנים משני יושמו לבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשתות צפה על תמונות EM ו digitalize. לעבד נתונים סופיים ב- Adobe Photoshop 6.0 ​​רק עבור בהירות והניגודיות אם יש צורך 24. </li></ol> כימות 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני באזורים הנבחרים של שכבת plexiform הפנימי (IPL) ללא חורים או סדקים בהגדלת 8,000X, ואז באקראי פוטומונטאז את מלוא עומקה של IPL בהגדלת 25,000X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה דנדריטים RGC ב צמדים דו קוטביים חרוטים כשהם א) מכילים את אות CTB מועבר retrogradely (חלקיקים זהב גדולים), ב) ממברנות מוגדרות היטב תערוכה, בתרי, צפיפויות postsynaptic, ג) להכיל לפחות שני חלק זהב קטןicles בתוך PSD, או יותר חלקיק זהב אחד קטן לאורך הממברנה extrasynaptic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 45 - 55 דנדריטים RGC, על פי קריטריונים לעיל, על ניתוח כמותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את האורכים של PSD ו קרום פלזמת extrasynaptic של דנדריטים RGC פרט עם תוכנת ImageJ NIH. רוזן חלקיקי זהב בתוך 10 ננומטר של קרום כמו קרום קשור, המבוסס על עובי ממוצע של 7 - 9 ננומטר עבור קרום פלזמת 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב צפיפות החלקיקים כמספר חלקיקי זהב לכל מיקרומטר ליניארי (זהב / מיקרומטר). למדוד את המרחק בין מרכז של כל חלקיק זהב באמצע PSD (עבור מיקום הסינפטי) או קצה PSD (עבור מיקום extrasynaptic). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בביצוע ניתוחים סטטיסטיים על ידי התוכנה. השתמש שני זנב t- הבדיקות להשוות אמצעים. להסיק משמעות כאשר P &lt;0.05. אלא אם צוין אחרת, ערכי דוח כמו הממוצע ± SEM 18. </li></ol>

<ol><li>Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+endogenous+excitatory+amino+acids+from+turtle+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors.</a> Nature. 341, 536-539 (1989).</li>
<li>Wässle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).</li>
<li>Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+activation+of+two+types+of+glutamate+receptor+mediates+excitation+of+salamander+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells.</a> J. Physiol. 428, 175-197 (1990).</li>
<li>Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+synaptic+transmission+in+the+inner+retina%3A+paired+recordings+of+bipolar+cells+and+neurons+of+the+ganglion+cell+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer.</a> J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).</li>
<li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+NMDA+and+non-NMDA+receptors+to+the+light-evoked+input-output+characteristics+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells.</a> Neuron. 11, 725-738 (1993).</li>
<li>Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA-preferring+receptors+mediate+excitatory+synaptic+inputs+to+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells.</a> J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).</li>
<li>Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake+limits+synaptic+excitation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells.</a> J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).</li>
<li>Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spontaneous+excitatory+synaptic+currents+in+salamander+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells.</a> J. Physiol. 486, 207-221 (1995).</li>
<li>Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+PDZ+%28DHR%2C+GLGF%29+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains.</a> Trends. Biochem. Sci. 20, 350(1995).</li>
<li>Kim, E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDZ+domain+proteins+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PDZ domain proteins of synapses.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).</li>
<li>Migaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+long-term+potentiation+and+impaired+learning+in+mice+with+mutant+postsynaptic+density-95+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein.</a> Nature. 396, 433-439 (1998).</li>
<li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+immunocytochemical+detection+of+PSD-95%2C+PSD-93%2C+SAP-102%2C+and+SAP-97+at+postsynaptic%2C+presynaptic%2C+and+nonsynaptic+sites+of+adult+and+neonatal+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex.</a> Synapse. 40, 239-257 (2001).</li>
<li>Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+members+of+the+PSD-95+family+of+MAGUK+proteins+at+the+synaptic+region+of+inner+and+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Synapse. 40, 258-268 (2001).</li>
<li>Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+developmental+expression+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR2A+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina.</a> J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+subcellular+distribution+of+NMDA+receptor+subunit+NR2B+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina.</a> J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).</li>
<li>Ottersen, O. P., Landsend, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+glutamate+receptors+at+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of glutamate receptors at the synapse.</a> Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).</li>
<li>Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetralia%2C+RS+%22Receptor+Localization%3A+Laboratory+Methods+and+Procedures%22">Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures</a>. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).</li>
<li>Petralia, R. S., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry+of+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry of NMDA receptors.</a> Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).</li>
<li>Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+and+NMDA+receptors%3A+similarities+and+differences+in+their+synaptic+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).</li>
<li>Qin, P., Pourcho, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+AMPA-selective+glutamate+receptor+subunits+in+the+cat+retina%3A+a+light-+and+electron-microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study.</a> Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).</li>
<li>Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+GABAergic+amacrine+cells+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Visual.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina.</a> Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).</li>
<li>Zhang, J., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+perisynaptic+and+synaptic+localization+of+NMDA+and+AMPA+receptors+on+ganglion+cells+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).</li>
<li>Zhang, J., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-+and+Pathway-Specific+Localization+of+NMDA+Receptors+and+Scaffolding+Proteins+at+Ganglion+Cell+Synapses+in+Rat+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina.</a> J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).</li>
<li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+fine+structure+of+the+nervous+system%3A+neurons+and+their+supporting+cells%2C+3rd+ed%22">The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed</a>. , Oxford University Press. New York. (1991).</li>
<li>Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabotropic+glutamate+receptor+%28mGluR1%29+is+concentrated+at+perisynaptic+membrane+of+neuronal+subpopulations+as+detected+by+immunogold+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction.</a> Neuron. 11, 771-787 (1993).</li>
<li>Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-substitution+and+Lowicryl+HM20+embedding+of+fixed+rat+brain%3A+Suitability+for+immunogold+ultrastructural+localization+of+neural+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hist.+Cyt%22%5BJournal%5D)">Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens.</a> J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).</li>
<li>Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+AMPA+receptor+subunits+at+a+glutamate+synapse%3A+A+quantitative+immunogold+analysis+of+hair+cell+synapses+in+the+rat+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti.</a> J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).</li>
<li>Petralia, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+NMDA+receptors+at+extrasynaptic+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations.</a> Neuroscience. 167, 68-87 (2010).</li>
<li>Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerighi%2C+A+%22Electron+Microscopic+Immunocytochemistry%3A+Principles+and+Practice%22">Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice</a>. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).</li>
<li>Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+organization+of+a+type+of+peripheral+glutamate+synapse%3A+the+afferent+synapses+of+hair+cells+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear.</a> Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).</li>
<li>Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21, 545-559 (1998).</li>
<li>Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+expression+of+AMPA+and+NMDA+receptors+in+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses.</a> Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).</li>
<li>Grimes, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+inhibitory+microcircuitry+regulates+retinal+signaling+near+visual+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold.</a> J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).</li>
<li>Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+ionotropic+glutamate+receptors+at+dendrodendritic+synapses+in+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).</li>
</ol>

למחברים אין גילוי נאות.

תארנו ארבע טכניקות שלאחר הטבעת כמותית מוצלחת immunogold EM: 1) קיבוע קצר וחלש, 2) להקפיא-החלפה, 3) שלאחר הטבעה מכתימה immunogold, ו -4) כימות. EM immunogold מאפשרת זיהוי של חלבונים ספציפיים בסעיפי רקמות ultrathin. נוגדנים שכותרתו עם חלקיקי זהב ניתן דמיינו ישירות באמצעות EM. בעוד עוצמה באיתור לוקליזציה subsynaptic של קולטן קרום, immunogold EM יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, ודורש אופטימיזציה קפדני של שיטות עיבוד קי...

גלוטמט הוא הנוירוטרנסמיטר העיקרי המעורר ברשתית 1. תאי גנגליון רשתית (RGCs), קבלת הקלט הסינפטי glutamatergic מתאי דו קוטבית 2, הם נוירונים הפלט של הרשתית ששולחות מידע חזותי אל המוח. מחקרים פיזיולוגיים הראו כי עירור הסינפטי של RGCs מתווכת postsynaptically ידי קולטני NMDA (NMDARs) ואת הקולטנים AMPA (AMPARs) 3,4,5. למרות זרמים סינפתטי (EPSCs) ב RGCs מתווכות על ידי AMPARs ו NMDARs 3,5,6,7,8, EPSCs מיניאטורי ספונטנית (mEPSCs) על RGCs להפגין רק מרכיב בתיווך AMPARs 4,5,9. עם זאת, צמצום ספיגת גלוטמט חשף מרכיב NMDAR ב EPSCs ספונטנית 5, דבר המצביע על כך NMDARs על דנדריטים RGC יכול להיות ממוקם מחוץ סינפסות מעוררות. קינאזות guanylate קרום הקשורים (MAGUKs) כגון PSD-95 כי קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכול, כולל קולטני גלוטמט ערוץ יוןים באתרי הסינפטי, גם להפגין דפוסי ביטוי subsynaptic ברורים 10,11,12,13,14. במהלך העשורים האחרונים, אימונוהיסטוכימיה confocal ו מיקרוסקופ אלקטרונים טרום הטבעה (EM) אימונוהיסטוכימיה הועסק ללמוד ביטוי קולטן קרום. למרות immunostaining confocal חושף דפוסים רחבים של ביטוי הקולטן, הרזולוציה הנמוכה יותר שלה עושה את זה אי אפשר להשתמש בו כדי להבחין במיקום subcellular. מחקרי EM טרום מוטבע הרשתית יונקת עולים כי יחידות משנת NMDAR נוכחי אלמנטי postsynaptic ב סינפסות סרט מדוך דו קוטבי 15,16,17. זאת בניגוד לכאורה ראיות פיזיולוגיות. עם זאת, דיפוזיה של מוצר התגובה הנה חפצה ידועה בשיטת אימונו-טרום ההטבעה. לפיכך, הגישה זו לא כוללת בדרך כלל נתונים אמינים סטטיסטית ועשויים לכלול הבחנה בין לוקליזציה קרום הסינפטי לעומת 18,19,20,21 קרום extrasynaptic. עַלמצד השני, נתונים פיסיולוגיים אנטומיים עולים בקנה אחד עם לוקליזציה הסינפטי של AMPARs על RGCs 3,5,7,9,22. לפיכך, קולטני גלוטמט MAGUKs ב סינפסה סרט רשתית הם נקודות לא רק על-סינפטי אלא גם על תאי קרום perisynaptic או extrasynaptic. עם זאת, ניתוח כמותי ברזולוציה גבוהה של חלבונים בממברנה אלו סינפסה סרט רשתית עדיין יש צורך. הנה, פיתחנו טכניקה immunogold postembedding EM לבחון את לוקליזציה subsynaptic של יחידות משנה NMDAR, תת-יחידות AMPAR ו PSD-95 ואחריו בהערכת מספר, צפיפות והשונות של החלבונים האלה ב סינפסות על RGCs חולדה שכותרתו באמצעות B למקטע רעלן הכולרה (CTB) שיטות איתור מדרדרות.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>EMS</td><td>16019</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>ו-2HPO4</td><td>Sigma</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-8106</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>JT Baker</td><td>V015-05</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Gibco BRL</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Lowicryl HM 20</td><td>Polysciences</td><td>15924-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>04997-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GluN2A</td><td>דילול AB1555P Millipore</td><td></td><td>1/50</td></tr><tr><td>אנטי-GluN2B</td><td>דילול AB1557P Millipore</td><td></td><td>1/30</td></tr><tr><td>אנטי-GluA2/3</td><td>דילול Millipore</td><td>AB1506</td><td>1/30</td></tr><tr><td>אנטי-PSD-95</td><td>Millipore</td><td>MA1&ndash; 046</td><td>דילול 1/100</td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב IgG-10 ננומטר חלקיקי זהב</td><td>EMS</td><td>25704</td><td>דילול 1/20</td></tr><tr><td>חמור נגד עכבר IgG-10 ננומטר חלקיקי זהב</td><td>EMS</td><td>25814</td><td>דילול 1/20</td></tr><tr><td>חמור נגד עכבר IgG-5 ננומטר חלקיקי זהב</td><td>EMS</td><td>25812</td><td>דילול 1/20</td></tr><tr><td>חמור נגד עזים IgG-18 ננומטר חלקיקי זהב</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>705-215-147</td><td>דילול 1/20</td></tr><tr><td>רשתות חריצי ניקל מצופות Formvar-Carbon.</td><td>EMS</td><td>FCF2010-Ni</td><td></td></tr><tr><td>אורניל אצטט</td><td>EMS</td><td>22400-1</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>EMS</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>ציטראט עופרת</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM AFS</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM CPC</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JEOL 1200 EM</td><td>חנקן נוזלי JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>רוברטס חמצן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרופאן</td><td>רוברטס חמצן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTB</td><td>רשימה מעבדות ביולוגיות</td><td>104</td><td>1 - 1.2%</td></tr> <tr>רשימת <td>אנטי CTB</td><td>מעבדות ביולוגיות</td><td>703</td><td>דילול 1/4,000</td></tr></tbody></table>

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

תאי גנגליון רשתית (RGCs) מקבלים קלט גלוטמטרגי מעורר מתאים דו קוטביים. עירור סינפטי של RGCs מתווך באופן פוסט-סינפטי על ידי קולטני NMDA (NMDARs) וקולטני AMPA (AMPARs). נתונים פיזיולוגיים הצביעו על כך שקולטני גלוטמט ב-RGCs מתבטאים לא רק בתאי ממברנה פוסט-סינפטיים אלא גם בתאי ממברנה פרי-סינפטיים או חוץ-סינפטיים. עם זאת, לא נקבעו מיקומים אנטומיים מדויקים לקולטני גלוטמט בסינפסות RGC. למרות שנעשה שימוש נרחב בניתוח כמותי ברזולוציה גבוהה של קולטני גלוטמט בסינפסות מרכזיות, גישה זו זכתה להצלחה מוגבלת בלבד ברשתית. פיתחנו שיטת אימונוגולד לאחר הטמעה לניתוח קולטני ממברנה, המאפשרת להעריך את המספר, הצפיפות והשונות של קולטנים אלה בסינפסות סרט הרשתית. כאן אנו מתארים את הכלים, הריאגנטים והצעדים המעשיים הדרושים ל: 1) הכנה מוצלחת של קיבוע הרשתית, 2) החלפת הקפאה, 3) הטמעת אימונוציטוכימיה של מיקרוסקופ אלקטרונים אימונוגולד (EM) ו, 4) הדמיה כמותית של קולטני גלוטמט בסינפסות סרט.

התוצאות המוצגות כאן להפגין דפוסי לוקליזציה subsynaptic שונות לחלוטין של GluA 2/3 ו- NMDARs על דנדריטים RGC ברשתית חולדה, כפי שתואר לעיל 24,25. 77% של חלקיקים immunogold GluA 2/3 פרופילים הדנדריטים RGC אותרו בתוך PSD (איור 1 א), בדומה למרבית סינפסות המרכזית. עם זאת, NMDARs אותרו גם synaptically או extrasynaptically. 83% של חלקיקים immunogold GluN2A היו נקודתיים של PSD (איור 1 ג, 2 א, 2 ב), מעדיפים ב סינפס...

שיטת אימונוגולד לאחר ההטמעה היא אחת הדרכים היעילות ביותר לספק ניתוחים ברזולוציה גבוהה של לוקליזציה תת-תאית של מולקולות ספציפיות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח כמותי של קולטני גלוטמט בסינפסות סרט הרשתית.

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לפתח גישה חדשה לניתוח כמותי של חלבוני ממברנה בסינפסות סרט (ribbon synapses) ברשתית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה של הרשתית, כגון המיקום המדויק של חלבונים בסינפסות בתוך המעגל העצבי. היתרון המרכזי של הטכניקה הוא היכולת להעריך את המספר, הצפיפות וקצב התחלופה של חלבונים מרובים בסינפסות סרט ברשתית.להדגמת הליך ההחלפה בהקפאה (freeze-substitution) והחיתוך לדקיקים אולטרה-דקים, נסייע רון פטרליה ויא-שיאן ואנג מליבת הדימיון המתקדם של NIDCD. כדי להתחיל בהליך זה, יש לבצע דיסקציה של גלגל עין תחת מיקרוסקופ. לשם כך, הסר תחילה את הקרנית.לאחר מכן, הסר את העדשה והזגוגית מהשטח הבין-רשתיתי באמצעות פינצטה. לאחר מכן, קלף את הלובן עד שהרשתית תבודד מהגביע של העין. חתוך את הרשתית באופן מיידי לרצועות בעובי 100 200 micrometer באמצעות תער.לאחר מכן, ערבבו את רצועות הרשת ב-4%paraformaldehyde ב-0.1 molar PB. לאחר מכן, ב-4%paraformaldehyde בתוספת 0.01%glutaraldehyde בטמפרטורת החדר. לאחר מספר שטיפות ב-PB, עם 0.15 millimolar calcium chloride, בצעו קריו-הגנה לרצועות הרשת באמצעות glycerol ב-0.1 molar PB, לפני ביצוע freeze-substitution. לפני הנחת הרקמה הקפואה לתוך מחזיקי השיקוע השטוחים, גזרו עיגול דק מגיליון פלסטיק שקוף והניחו אותו בתחתית כל מחזיק כדי לאפשר הוצאה קלה יותר של קופסת הדגימה הפולימרית בסיום התהליך.כעת, הגדירו את הרצף האוטומטי ב-AFS. מלאו את ה-AFS בחנקן נוזלי והניחו את מחזיקי ההטמעה השטוחים בתוך ה-AFS. מלאו אותם ב-1.5% uranyl acetate במתנול וקררו אותם מראש.כדי לבצע הקפאה מהירה (plunge-freeze) של רצועות הרשת בנוזל פרופאן בטמפרטורה של 184 מעלות צלזיוס, השתמשו במברשת עדינה להנחת הדגימות על פיסות קטנות של סרט דביק דו-צדדי המחוברות לבסיסי המתכת (stubs) בקצה מוטות ההשקעה. לאחר מכן, ספגו עודפי באפר באמצעות המברשת. השקיעו את המוטים לתוך נוזל הפרופאן למשך כחמש שניות.לאחר מכן, העבירו אותם ל-AFS באמצעות תא מעבר קטן ממולא בחנקן נוזלי. לאחר הנחת הדגימה הקפואה והמכשירים, פינצטה וסכין מנתחים, בתוך ה-AFS, קררו את המכשירים בתא למשך מספר דקות לפני נגיעה ברקמה. לחלופין, קררו אותם על ידי הנחת קצות המכשירים למשך מספר שניות בתוך תא המעבר הקטן הממולא בחנקן נוזלי.לאחר מכן, הסר את הדגימה ואת הסרט מהבסיס (stub) באמצעות סכין מנתחים עדינה. בשלב הבא, הנח שתי חתיכות של חתכים קפואים בכל אחת משבעת הבארות במחזיק האלומיניום השטוח להטמעה עם 1.5% uranyl acetate במתנול. שמור אותם בטמפרטורה של 90 degrees Celsius למשך 32 שעות לפחות ב-AFS.לאחר מכן, הגבירו את הטמפרטורה באופן מדורג ל-45 °C ברצף האוטומטי. לאחר מכן, שטפו את הדגימות שלוש פעמים במתנול מקורר מראש. בשלב הבא, בצעו חדירה הדרגתית של שרפי שימור בטמפרטורה נמוכה אל תוך הדגימות כתווך שימור.ביום למחרת, החליפו שוב את השרף והתאימו את מפלס השרף כך שיגיע לקצה העליון של הבארות. הגדירו את תאורת ה-UV במכשיר ה-AFS ובצעו פולימריזציה של הדגימות באמצעות תאורת UV ב-AFS עד לסיום הרצף האוטומטי. לאחר מכן, הוציאו את הדגימות מה-AFS.בדרך כלל, בלוקי הדגימות עדיין מראים גוון ורוד וצבע. מקמו את הדגימות קרוב למנורה הפלורסצנטית בתוך מנדף כימיים בטמפרטורת החדר למשך הלילה, או עד שהם ייראו שקופים לחלוטין. בשלב זה, חתכו חתכים דקים מאוד (ultra-thin sections) בעובי 70 nonometer באמצעות אולטרה-מיקרוטום, ואספו אותם על גבי רשתות ניקל מצופות פחמן ו-formvar.שטפו את הסריגים במים מזוקקים פעם אחת, ולאחר מכן בשלוש שטיפות של TBS. לאחר מכן, הדגירו את הסריגים ב-20 microliters של 5%BSA ב-TBS למשך 30 דקות, ולאחר מכן ב-20 microliters של תערובת המכילה goat anti-CTB ונוגדן לתת-יחידה אחת של NMDAR למשך לילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הסריגים שלוש פעמים עם 20 microliters של TBS בכל פעם ב-ph 7.6.לאחר מכן, שטפו את הרשתות פעם אחת עם TBS ב-pH 8.2 למשך חמש דקות. דגרו את הרשתות למשך שעתיים עם 20 µL של תערובת המכילה donkey anti-rabbit IgG המשורשר לחלקיקי זהב של 10 nm, ו-donkey anti-goat IgG המשורשר לחלקיקי זהב של 18 nm. לאחר שעתיים, שטפו את הרשתות ב-20 µL של TBS, ב-pH 7.6 שלוש פעמים, ולאחר מכן שטפו במים אולטרה-טהורים ואז ייבשו את הרשתות באוויר.לאחר מכן, בצעו צביעה נגדית של הרשתות ב-5% uranyl acetate במים מזוקקים למשך שמונה דקות, ולאחר מכן ב-0.3% lead citrate במים מזוקקים למשך חמש דקות בחושך. עבור ניסויי סימון משולש, הדגרינו את הרשתות למשך לילה בטמפרטורת החדר עם 20 µL של תערובת של anti-goat CTB, anti-mouse PSD-95 ו-anti-rabbit UN2A. לאחר מכן, הדגרינו את הרשתות למשך שעתיים עם 20 µL של תערובת IGGs המשורשרים לחלקיקי זהב בגודל 18, 10 ו-5 nm.בסעיף זה, הגדירו תחילה את סרגל המقياس. לאחר מכן, מדדו את אורכו של ה-PSD של דנדריטים בודדים של RGC באמצעות תוכנת ImageJ. לאחר מכן, ספרו את חלקיקי הזהב הנמצאים בטווח של 10 nanometers מהממברנה, בהתבסס על עובי ממוצע של שבעה עד תשעה nanometers עבור ממברנת הפלזמה.חשבו את צפיפות החלקיקים כמספר חלקיקי הזהב למיקרומטר ליניארי. לאחר מכן, מדדו את המרחק בין מרכזו של כל חלקיק זהב למרכז ה-PSD עבור מיקום סינפטי, או לקצה ה-PSD עבור מיקום חוץ-סינפטי. תמונה זו מציגה סימון כפול בזהב אימונו-כימי של GluA2/3 ו-CTB.זהו הסרט הפרה-סינפטי, והחלקיקי הזהב הקטנים מקבצים ב-PSD של שלוחות ה-RGC. תמונה זו מראה סימון כפול של GluN2B ו-CTB באמצעות Immunogold. חלקיקי הזהב הקטנים נמצאים על קרומי הפלסמה חוץ-סינפטיים.ותמונה זו מראה סימון דובל-אימונו-גולד (double immunogold labeling) של GluN2A ו-CTB. בדומה ל-GluA2/3, חלקיקים קטנים מקבצים בתוך ה-PSD. כאן מוצג סימון טריפל-אימונו-גולד (triple immunogold labeling) של GluN2A, PSD-95 ו-CTB.חלקיקי זהב של GluN2A וחלקיקי זהב של PSD-95 ממוקמים יחד בתוך ה-PSD בדנדריטים בודדים של RGC חיוביים ל-CTB. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לקבע את הרקמה בעדינות רבה, מכיוון שחלק מהאנטיגניות של חלבונים, כגון זו של רצפטורי NMDA, פוחתת באופן ניכר בקיבוע חזק וממושך. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבין היטב כיצד לזהות ולנתח חלבוני ממברנה בדיוק רב בסינפסות מסרט (ribbon synapses) ברשתית.

high-resolution-quantitative-immunogold-analysis-membrane-receptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון זה אנו מדגימים כיצד התווית לדמיין שלפוחית ​​יחיד exocytosis הסינפטי וסחר רשתית דג זהב תאים דו קוטבית באמצעות הקרינה הכוללת פנימי ההחזרה (TIRF) מיקרוסקופיה.

הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

מקור: Schönherr, S., et. al. תיוג אימונולוגי משולב של העתק אופטוגנטי ושבר הקפאה כדי לבחון סידור ספציפי לקלט של קולטני גלוטמט באמיגדלה של העכבר. J. Vis. exp. (2016)סרטון זה מדגים את התיוג החיסוני של העתקים שבורים בהקפאה של רקמת מוח עכבר למיקרוסקופ אלקטרונים. ההעתקים השבורים והמצופים מתעכלים כדי לחשוף קולטנים. נוגדנים משניים ראשוניים ובעלי תווית זהב מתווספים כדי לסמן קולטנים ספציפיים של ממברנה עצבית. ההעתק מותקן על רשת ומוצג תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.

תיוג חיסוני של חלבוני ממברנה עצבית בדגימה שסועה בהקפאה של רקמת מוח של עכבר

מקור: Zhang, J., et al. ניתוח אימונוגולד כמותי ברזולוציה גבוהה של קולטני ממברנה בסינפסות סרט הרשתית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים טכניקת מיקרוסקופ אלקטרונים להמחשת לוקליזציה של קולטני נוירוטרנסמיטורים בסינפסות רשתית. חלקי הרשתית מכילים תאי גנגליון ברשתית המציגים קולטנים נוירוטרנסמיטורים הקשורים לממברנה ומסומנים בתת-יחידה B של רעלן כולרה (CTB). עם תיוג הסמנים בנוגדנים מצומדים לננו-חלקיקי זהב וצביעה נגדית של הקטע במתכות כבדות, קולטני ה-RGC מוצגים במיקרוסקופ.

הדמיה ברזולוציה גבוהה של קולטנים נוירוטרנסמיטורים בסינפסות רשתית

הלוקליזציה וההפצה של חלבונים מספקים מידע חשוב להבנת הפונקציות הסלולריות שלהם. הרזולוציה מרחבית המעולה של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) ניתן להשתמש כדי לקבוע את לוקליזציה subcellular של אימונוהיסטוכימיה ניתנה בעקבות אנטיגן. לרקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), שמירה על שלמות מבנית תוך שמירת antigenicity כבר קשה במיוחד במחקרי EM. כאן, אנו לאמץ נוהל אשר כבר משמש לשימור מבנים ואנטיגנים של מערכת העצבים המרכזיים ללימוד ואפיון חלבונים סינפטיים בCA1 נוירונים ביפוקמפוס עכברוש פירמידה.

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

הפרוטוקול המתואר כאן מיועד להערכה מבנית של תכשיר רשתית שלם. זה כולל תיאורים של דיסקציה של רקמות, הרכבה על תוספת ממברנה פוליטטרפלואורואתילן הידרופילית (PTFE), העמסת בולוס עם סמנים פלואורסצנטיים, והשוואה של קיבוע עם קרבודימיד ופרפורמלדהיד לניתוח אימונוהיסטוכימי של רכיבים תאיים וסינפטיים.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

מאמר זה ממחיש כיצד ניתן לכמת את הביטוי של קולטני נוירוטרנסמיטורים ולנתח את הדפוס בסינפסות עם אלמנטים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים מזוהים באמצעות שילוב של התמרה ויראלית של כלים אופטוגנטיים וטכניקת תיוג חיסוני העתק הקפאה-שבר.

בשילוב optogenetic ולהקפיא-שבר Replica immunolabeling לבחינת הסדר ספציפי קלט של גלוטמט הקולטנים עכבר האמיגדלה

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להתאים את שיטת הבהירות של רקמות המוח עבור רטינות הר שלם כדי לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ואת המבנים התת תאיים שלהם.

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים של הטמעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים, תוך התמקדות בחקר מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים ברשתית.

חקירת מעגלי רשתית ולוקליזציה מולקולרית על ידי הטבעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים

פרוטוקול זה מספק הליך הכנה אופטימלי ומשוכלל לדגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. הוא מתאים ליישומים הכוללים ניתוח של סינפסות באורגנואידים רשתית בוגרים.

הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

למד ניתוח כמותי ברזולוציה גבוהה של חלבוני קרום בסינפסות רצועת הכלים הרשתית באמצעות שיטת immunogold. טכניקה זו מאפשרת זיהוי מיקום מדויק של קולטני גלוטמט ומיפוי צפיפות חלבונים סינפטיים.

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

גלה סרטונים נוספים