Name: ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: למד הדמיה אופטית של שינויי פוטנציאל ממברנה באמצעות חיישני מתח מקודדים גנטית. השיטה מאפשרת צפייה בזמן אמת בפעילות עצבית ומאפשרת ניתוח רציומטרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המכון ברמה עולמית (WCI) של קרן המחקר הלאומית של קוריאה במימון מענק משרד החינוך, המדע והטכנולוגיה של קוריאה WCI 2009-003 ופרויקט התוכנית המוסדית של המכון הקוריאני למדע וטכנולוגיה 2E24210. Sungmoo Lee נתמכה על ידי תוכנית מלגות הדוקטורט הגלובלית (NRF-2013H1A2A1033344) של הקרן הלאומית למחקר (NRF) תחת משרד החינוך (MOE, קוריאה).

<ol><li>Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+impulses+in+individual+neurones+of+an+invertebrate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system.</a> Nature. 246, 508-509 (1973).</li>
<li>Cohen, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+axon+fluorescence+during+activity%3A+molecular+probes+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membrane+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential.</a> J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).</li>
<li>Tasaki, I., Warashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-membrane+interaction+and+its+changes+during+nerve+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation.</a> Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).</li>
<li>Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+action+potentials+and+subthreshold+electrical+events+imaged+in+neurons+with+a+fluorescent+protein+voltage+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe.</a> Neuron. 75, 779-785 (2012).</li>
<li>Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154, 904-913 (2013).</li>
<li>St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+optical+reporting+of+neuronal+electrical+activity+with+an+ultrafast+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor.</a> Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).</li>
<li>Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+mutagenesis+of+the+voltage-sensing+domain+enables+the+optical+resolution+of+action+potentials+firing+at+60+Hz+by+a+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential.</a> J Neurosci. 35, 372-385 (2015).</li>
<li>Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+length+and+fusion+site+composition+improve+the+optical+signal+of+genetically+encoded+fluorescent+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophoton%22%5BJournal%5D)">Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors.</a> Neurophoton. 2, 021012(2015).</li>
<li>Dimitrov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+an+enhanced+fluorescent+protein+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor.</a> PLoS One. 2, e440(2007).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).</li>
<li>Sung, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+fast+fluorescent+protein+voltage+sensors+by+optimizing+FRET+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions.</a> PLoS One. 10, e0141585(2015).</li>
<li>Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+action+potentials+in+mammalian+neurons+using+a+microbial+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin.</a> Nat Methods. 9, 90-95 (2012).</li>
<li>Flytzanis, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaerhodopsin+variants+with+enhanced+voltage-sensitive+fluorescence+in+mammalian+and+Caenorhabditis+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons.</a> Nat Commun. 5, 4894(2014).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nat Methods. 11, 825-833 (2014).</li>
<li>Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+spiking+in+brain+tissue+using+FRET-opsin+protein+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors.</a> Nat Commun. 5, 3674(2014).</li>
<li>Zou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+fast+multicoloured+voltage+reporters+via+electrochromic+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET.</a> Nat Commun. 5, 4625(2014).</li>
<li>Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+approach+to+measuring+electrical+activity+in+genetically+specified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons.</a> Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).</li>
<li>Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+voltage+sensor+imaging+of+electrical+activity+from+neurons+in+hippocampal+slices+from+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice.</a> J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).</li>
<li>Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+voltage+sensor+imaging+of+eGFP-F+expressing+neurons+in+chicken+midbrain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices.</a> J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).</li>
<li>Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaters%2C+JC+%22Methods+in+Cell+Biology+Volume+81%22">Methods in Cell Biology Volume 81</a>. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).</li>
<li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca2%2B-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+clamping%3A+an+introductory+guide+to+patch+clamp+electrophysiology%22">Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).</li>
<li>Osorio, N., Delmas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+from+enteric+neurons+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording from enteric neurons in situ.</a> Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).</li>
<li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The mammalian unfolded protein response.</a> Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).</li>
<li>Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+shot+noise+limits+on+optical+detection+of+neuronal+spikes+and+estimation+of+spike+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing.</a> Biophys J. 104, 51-62 (2013).</li>
<li>Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+genetically+encodable+fluorescent+voltage+sensor+exploiting+fast+Ci-VSP+voltage-sensing+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements.</a> PLoS One. 3, e2514(2008).</li>
<li>Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+voltage+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging voltage in neurons.</a> Neuron. 69, 9-21 (2011).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

מערכת העצבים משתמשת מתח במספר הדרכים שונים, עיכוב גורם hyperpolarization קל, קלט סינפטי גורם שלילת קוטביות קלה וכן תוצאות פוטנציאל פעולה לשינוי מתח גדול יחסית. היכולת למדוד שינויים בפוטנציאל הממברנה על ידי GEVIs מציעה את הפוטנציאל המבטיח של ניתוח מספר מרכיבים של מעגלים עצביים בו זמנית. בדו&quot;ח זה אנו מדגימים שיטת יסוד לשינויי הדמיה בפוטנציאל הממברנה באמצעות GEVIs. מפתח מרכזי לשינויי הדמית מתח הוא הביטוי היעיל ...

המוקד העיקרי של מאמר זה היא להדגים את דימות אופטי של השינויים הפוטנציאלים קרום במבחנה באמצעות חלבוני ניאון מקודדים גנטית. שינויי הדמיה בפוטנציאל הממברנה מציעים את האפשרות המרגשת של לימוד הפעילות של מעגלים עצביים. כאשר שינויי תוצאת פוטנציאל הממברנה לשינוי עוצם קרינה, כל פיקסל של המצלמה הופך אלקטרודה פונדקאית המאפשרים מדידות מפריעה של פעילות עצבית. במשך למעלה מארבעים שנה, צבעי מתח רגישים אורגניים היו מועילים להתבוננות שינויי קרום 1-4 פוטנציאלי. עם זאת, צבעים אלה חסרים סגוליים הסלולר. בנוסף, סוגי תאים מסוימים שקשה להכתים. גנטית אינדיקטורים מתח מקודד (GEVIs) להתגבר על המגבלות האלה ע&quot;י התאים להיחקר במיוחד להביע את החללית מתח רגיש ניאון. ישנם שלושה סוגים של GEVIs. המחזור הראשון של GEVI משתמש voltage חישת מחשבים מתוך phosphatase חישת המתח גם עם חלבון פלואורסצנטי יחיד (FP) 5-9 או תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) זוג 10-12. השיעור השני של חיישנים משתמש rhodopsin מיקרוביאלי כאינדיקטור ניאון ישירות 13-15 או באמצעות electrochromic סריג 16,17. המחזור השלישי מנצל שני מרכיבים, המרכיב הגנטי להיות FP מעוגן קרום ומרכיב השני להיות צבע מרווה קרום הנכנס 18-20. בעוד המעמדות השניות והשלישיות שימושיות בניסויים במבחנה פרוס 19,20, רק המחזור הראשון של החיישנים שימושיים כיום עבור in vivo מנתח 6. בדו&quot;ח זה נדגים את ההדמיה של פוטנציאל הממברנה באמצעות המחלקה הראשונה של GEVIs (איור 1) במבחנה. מחלקה ראשונה זו של חיישנים מתח היא הקלה ביותר לעבור הדמיה in vivo. מאז GEVIs utilizing תחום חישה מתח התמזגו FP הם על פי 50 בהיר יותר מאשר בכיתה rhodopsin של חיישנים, הם יכולים להיות צילמו באמצעות תאורה מנורת קשת ולא לדרוש לייזר בעלת עוצמה אדירה. תוצאה נוספת של הפער הבהיר היא כי המחזור הראשון של GEVIs יכול לחרוג פלואורסצנציה האוטומטית של מוח בקלות. הבדיקות מבוססות rhodopsin לא יכולות. המחזור השלישי של חיישן הוא פשוט בהיר כמו המחלקה ראשונה אבל דורש תוספת של מרווה כימי אשר קשה לנהל in vivo. אנו, אם כן, להדגים את רכישת בדיקה עם סינגל FP (Bongwoori) 8 ו בדיקה המורכבת זוג סריג (נבי 2) 12. לדאוג בונה בדוח זה הם גרסאות פרפר של VSFP-CR (חלבוני ניאון רגיש מתח - תלתן-mRuby2) 11 המורכב תורם פלואורסצנטי ירוק, תלתן, וכן acceptor ניאון אדום, mRuby2, בשם נבי 2.242 ונבי 2.244 <sעד&gt; 12. במבוא סוגים אלה של הקלטות צריך לתת לחוקרים הבנה טובה יותר של סוג של GEVIs מידע יכול לספק. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53566/53566fig1.jpg" /> איור 1. שני סוגים של אינדיקטורים מתח מקודדים גנטיים (GEVIs) צלמו הדוח (א) FP מונה מבוסס GEVI שיש תחום חישת מתח קרום טרנס חלבון פלואורסצנטי. (ב) GEVI סריג מבוסס מורכב תחום טרנס-קרום חישת מתח, תורם סריג acceptor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53566/53566fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>עדשת אובייקטיבית 60X (צמצם מספרי = 1.35)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>מסנן עירור</td><td>Semrock</td><td>&nbsp; FF02-472/30</td><td>להדמיית מתח של pHluorin סופר אקליפטי</td></tr><tr><td>במראה דיכרואית</td> של Bongwoori <td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פליטה</td><td>Semrock</td><td>FF01-497/LP</td><td></td></tr><tr><td>75W מנורת קשת קסנון</td><td>CAIRN</td><td>OptoSource Illuminator</td><td>נוריות LED ולייזרים הם גם מקורות אור יעילים</td></tr><tr><td>מצלמת CCD במהירות איטית</td><td>Hitachi</td><td>KP-D20BU</td><td></td></tr><tr><td>מתאם מצלמה עם יציאה כפולה</td><td>Olympus</td><td>U-DPCAD</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD במהירות גבוהה</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>מפצל תמונה</td><td>CAIRN</td><td>Optosplit 2</td><td></td></tr><tr><td>מסנן עירור</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/23-25</td><td>להדמיית מתח של GEVI מבוסס זוג FRET המורכב מתלתן ו-mRuby2)</td></tr> <tr><td>מראה דיכרואית</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פליטה</td><td>Chroma</td><td>ET520/40</td><td></td></tr><tr><td>מראה דיכרואית</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25X36</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פליטה</td><td>Chroma</td><td>ET645/75</td><td></td></tr><tr><td>מערכת בידוד רעידות</td><td>מערכות קינטיות</td><td>250BM-IC, 5702E-3036-31</td><td></td></tr><tr><td>תא תיקון</td><td>מכשירי וורנר</td><td>RC-26G, 64-0235</td><td></td></tr><tr><td>#0 Micro Coverglass (22 x 40 מ"מ)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-20</td><td></td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>#0 (0.08 ~ 0.13 מ"מ) - כיסוי זכוכית בקוטר 10 מ"מ Ted</td><td>Pella</td><td>260366</td><td></td></tr><tr><td>Lipofection Agent</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>מגיב סידן פוספט</td><td>Clontech - Takara</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>מגבר מהדק תיקון</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 מגבר</td><td></td>USB</tr><tr><td>תוכנה לרכישת נתונים רב-ערוצית</td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לרכישה וניתוח תמונות</td><td>RedShirtImaging</td><td>Neuroplex</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת יישום גיליון אלקטרוני</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel 2010</td><td></td></tr> תוכנה <tr><td>לניתוח נתונים</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 8.6.0</td><td></td></tr><tr><td>Demagnifier</td><td>Qioptiq LINOS</td><td>Optem מצמד מצלמה סטנדרטי 0.38x SC38 J מהדק</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>ניקון</td><td>ניקון A1R מיקרוסקופ</td><td></td>קונפוקלי</tr><tr><td>מגיב נגד דהייה</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

מחווני מתח מקודדים גנטית (GEVIs) השתפרו עד לנקודה שבה הם מתחילים להיות שימושיים עבור הקלטות in vivo. בעוד שהמטרה הסופית היא לדמות פעילות עצבית in vivo, אדם חייב להיות מסוגל לדמות פעילות של תא בודד כדי להבטיח תכשירים מוצלחים in vivo. הליך זה יתאר כיצד לדמות פוטנציאל ממברנה בתא בודד כדי לספק בסיס לתמונה בסופו של דבר in vivo. כאן אנו מתארים שיטות להדמיית GEVIs המורכבות מתחום חישת מתח המותך לחלבון פלואורסצנטי יחיד (FP) או לשני חלבונים פלואורסצנטיים המסוגלים להעביר אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) במבחנה. שימוש במפצל תמונה מאפשר הקרנה של תמונות שנוצרו על ידי שני אורכי גל שונים על אותה מצלמת מכשיר מצמד מטען (CCD) בו-זמנית. מפצל התמונה ממקם קוביית מסנן שנייה בנתיב האור. קוביית סינון שנייה זו מורכבת ממסנני פליטה דיכרואיים ושני מסנני פליטה כדי להפריד בין אורכי הגל הפלואורסצנטיים של התורם והמקבל בהתאם ל-FPs של ה-GEVI. הגדרה זו מאפשרת הקלטה בו-זמנית של השותפים הפלואורסצנטיים המקבלים והתורמים תוך מניפולציה של פוטנציאל הממברנה באמצעות תצורת מהדק תיקון תא שלם. בעת שימוש ב-GEVI המורכב מ-FP יחיד, ניתן להסיר את קוביית המסנן השנייה ומאפשרת למראות במפצל התמונה להקרין תמונה בודדת על מצלמת ה-CCD.

זמני תאים transfected יכול להפגין וריאציה משמעותית בעוצמת הקרינה ואת מידת הביטוי קרום הפלזמה. אפילו באותו coverslip כמה תאים יהיו רמות שונות של הקרינה הפנימית. זהו ככל הנראה בשל כמות של סוכן transfection נספג על ידי התא. לפעמים, יותר מדי ביטוי גורם לתא לחוות את תגובת חלבון פרש וכתוצאה מכך אפופטוזיס 27 (בהיר, מעוגל תאים, עם קרינה פנימית גבוהה). הנסיין לכן הזהיר לבחון הן תאים בהירים תאים עמומים עם קרינה פנימית כמה שפחות מאז הביטוי הפנימי י...

מתוארת שיטה להדמיית שינויים בפוטנציאל הממברנה באמצעות מחווני מתח מקודדים גנטית.

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

המטרה הכללית של הליך זה היא דיווח אופטי על שינויים בפוטנציאל הממברנה באמצעות אינדיקטור למתח מקודד גנטית. שיטה זו תתאר את היתרונות והחסרונות של דימות באמצעות גששים פלואורסצנטיים שונים למתח המקודדים גנטית. לדוגמה, גששים המבוססים על FRET יעניקו את היתרון של דימות רציומטרי, אך יספקו אות חלש יותר.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת להדמיות של הפעילות העצבית בזמן אמת. בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקשיים מכיוון שיחס אות לרעש אינו גבוה מאוד, קיימים מספר מקורות לרעש ומספר שלבים שבהם עלולות להתרחש שגיאות. משתמשים חדשים נוטים לעיתים לבלבול, כאשר הפרעות נתפסות כאותים אמיתיים.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כדי לוודא את תקפות הגששים שבהם נעשה שימוש ואת המשמעות הממשית של התוצאות. עבור ההגדרה, מותקן מפצל תמונות בין מצלמות ה-CCD האיטיות והמהירות לצורך הדמיה של GEVI מבוסס FRET. לפני הניסוי, הכנס למפצל התמונות קוביית פילטר הכוללת מראה דיכרואית ושני מסנני פליטה.הסר את קוביית המסנן השנייה כאשר מדמיינים GEVI עם חלבון פלואורסצנטי בודד. כדי להתחיל בניסוי, אתר תא HEK293 בריא המראה פלואורסצנציית ממברנה חזקה וממוקמת בהשוואה לפלואורסצנציה הפנימית, והימנע מביצוע פאץ' (patching) לתאים עגולים כיוון שהם נמצאים בתהליך של חלוקה או מוות. לאחר מכן, החל פולס בדיקה כדי לבחון את תגובת הזרם.לאחר מכן, הורד את פיפטת ה-patch clamp אל מעל פני התא. לאחר מכן, הורד את הפיפטה באיטיות עד שתגע בעדינות בממברנת התא. התנגדות הממברנה צריכה לעלות ל-one to two megaohm.לאחר מכן, צרו חתימה של ג'יגה-אוהם על ידי הפעלת לחץ שלילי עדין דרך הפפיטה. ברגע שהושגה חתימת ג'יגה-אוהם, הגדירו את פוטנציאל הפפיטה לפוטנציאל השמירה הרצוי. לאחר מכן, התמקדו באמצעות מצלמת ה-CCD המהירה בגוף התא.עבור הקלטת GEVI המבוססת על FRET, התאימו את גודל התמונות המפוצלות כדי להשיג תצוגה במרווחים שווים עבור כל אורך גל של פליטה באמצעות הכפתורים במפצל התמונות. לאחר מכן, קרעו את ממברנת התא על ידי הפעלת לחץ שלילי כדי ליצור את קונפיגורציית התא השלם. כעת, פתחו את תוכנת הדימוג.לאחר מכן, לחצו על acquire בתפריט מצלמת SciMeasure כדי לפתוח את דף רכישת ה-CCD. בשלב הבא, צרו קובץ נתונים חדש לשמירת ההקלטה. לחצו על analog output ולאחר מכן על read an ASCII כדי לפתוח קובץ פרוטוקול פולסים לצורך ביצוע הדימוי.בשלב הבא, לחצו על average the internal repetitions כדי לבצע ממוצע למספר הניסיונות. לאחר מכן, סגרו את דף ה-analogue output. הגדירו את פרמטרי הרכישה הספציפיים בדף ה-CCD acquire.לאחר מכן, הזינו את הערכים הספציפיים עבור מספר הפריימים לרכישה ומספר הניסיונות. לאחר מכן, לחצו על כפתור take data optics plus BNC כדי להתחיל את ההקלטה. בזמן ביצוע דימות המתח, עקבו אחר האוסצילוסקופ כדי להבטיח תצורת whole-cell יציבה לאורך כל ההקלטה.כדי לחשב את השינוי הפרוקציונלי בفلורסצנציה, לחצו על file ולאחר מכן על read data file כדי לפתוח קובץ נתונים שהוקלט בשלב הקודם. תמונית התא בעצימות האור במצב מנוחה אמורה להופיע בצד ימין. לאחר מכן, לחצו על show BNC's כדי להציג את ערכי מתח הקצה הנוכחיים.שנו את מצב הדף ממסגרת RLI להחסרת מסגרות (frame subtraction) כדי להשתמש בפונקציית החסרת המסגרות לזיהוי הפיקסלים בעלי אותות אופטיים תגובתיים. לאחר מכן, בחרו שתי נקודות זמן להחסרה וזהו את אזור התא המראה אותות בתגובה לשינוי בפוטנציאל הממברנה. לאחר מכן, הגדירו את הפיקסלים שיש לנתח באמצעות גרירה או לחיצה על כל פיקסל.הייצוג הגרפי של עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת מהפיקסלים הנבחרים אמור להופיע בצד שמאל של חלון התוכנה. חלק את הפיקסלים לאחר החסרה בעוצמת האור במצב מנוחה על ידי לחיצה על כפתור divide by RLI כדי לקבל את ערכי השינוי השברי של הפלואורסצנציה. כדי לייצא את הנתונים, הסר את גרפי מתח הקצה הנוכחיים על ידי ביטול הסימון בתפריט show BNC.עברו לתפריט output ושמרו את העקבות כ-displayed ASCII כדי לייצא את עקבת הפלואורסצנציה בפורמט קובץ ASCII עבור ניתוח התאמת העקומות. בהליך זה, שרטטו את הגרף של שינוי הפלואורסצנציה לעומת המתח על ידי שרטוט שינויי הפלואורסצנציה השבריים בתגובה למתח בתוכנה לניתוח נתונים. לאחר מכן, התאימו את העקומה לפונקציית Boltzmann כדי לקבוע את טווח המתח של האות האופטי, על ידי לחיצה על analysis, לאחר מכן fitting, ואז sigmoidal fit ולאחר מכן open dialog.שרטט מחדש את השינויים השבריים הנורמליים של הפלואורסצנציה בתגובה למתח באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים. כדי לחשב את מהירות התגובה האופטית, פתח את קובץ ה-ASCII ושרטט את עקומת השינוי השברי של הפלואורסצנציה כפונקציה של זמן. לאחר מכן, לחץ על בורר הנתונים בתוכנת ניתוח הנתונים ובחר נקודת זמן אחת המתאימה לתחילת פולס מתח מדורג, ונקודת זמן שנייה שבה האות האופטי הגיע למצב יציב.התאימו טווח זה הן לפונקציית דעיכה מעריכית בודדת והן לפונקציית דעיכה מעריכית כפולה על ידי לחיצה על analysis, fitting, exponential fit ולאחר מכן open dialog, ודווחו על ההתאמה הטובה יותר. איור זה מציג את שינוי הפלואורסצנציה של תא HEK המבטא GEVI Bongwoori בודד המבוסס על FP. זהו שינוי פלואורסצנציה טיפוסי בתגובה לפולסי מתח מדורגים.כאן תועד תא HEK293 באמצעות מצלמת CCD במהירות גבוהה. תמונה זו מראה את עוצמת האור במצב מנוחה של תא המבטא Bongwoori. וזוהי תמונת חיסור פריימים (frame subtraction) המצביעה על הפיקסלים שבהם נצפה שינוי בפלואורסצנציה.מוצגת כאן הקלטה אופטית של פוטנציאלי פעולה מושריים מנוירונים ראשוניים של היפוקמפוס של עכבר המבטאים Bongwoori. פוטנציאלי הפעולה עוררו תחת מצב current clamp של תא שלם. עקבה של שינוי פלואורסצנציה שברי הוא נבחרה מהפיקסלים המתואמים לסומה.באיור זה, השינוי בפלואורסצנציה של תא HEK המבטא GEVI מבוסס-FRET מראה את התגובות לפולסי מתח מדורגים בשני אורכי גל. ההקלטה בוצעה בתדר של 1 kHz באמצעות מצלמת CCD מהירה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבחון רמות פלואורסצנציה משתנות, כיוון שביטוי יתר של פלואורסצנציה עלול להשפיע על בריאות התא.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון קידודים של פרוסות (slicer codings), כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לפעילות נוירונלית של מעגלים שונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן הדמיית פוטנציאל ממברנה באמצעות סוגים שונים של גששים.

imaging-membrane-potential-with-two-types-genetically-encoded

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שדה חשמלי חיצוני משרה מתח על הממברנה של התא, כינה את מתח קרום מושרה (ΔΦ). באמצעות צבע פוטנציומטרית di-8-ANEPPS, אפשר למדוד את ΔΦ noninvasively. וידאו זה מציג את הפרוטוקול למדידת ΔΦ באמצעות di-8-ANEPPS.

מדידת מתח ממברנה מושרה עם Di-8-ANEPPS

טכניקת הדמיה למעקב אחר שינויים אפשריים בממברנה עם רזולוצית המשנה מיקרומטר מרחבית ותת זמנית האלפית השנייה מתוארת. הטכניקה, המבוססת על ליזר עירור של צבעי מתח רגישים, מאפשרת מדידות של אותות באקסונים וטחונות האקסון, סניפי מסוף דנדריטיים, וקוצים הדנדריטים בודדים.

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים לחקור את התכונות החשמליות של תאים מעוררים בתנאים הפיזיולוגיים הלא פולשניים ביותר על ידי שימוש בעוברי דג הזברה במערכת in vivo יחד עם מחוון מתח מקודד גנטית (GEVI) מבוסס העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET) המתבטא באופן סלקטיבי בסוג התא המעניין.

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

כאן אנו מציגים שיטה אופטית התמונה פוטנציאל פעולה, במיוחד cardiomyocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה דמוי חדרית. השיטה מבוססת על הביטוי מונחה המקדם של חלבון פלואורסצנטי רגיש מתח.

סוג משנה ספציפי פוטנציאל הפעולה אופטי הקלטות-אנוש המושרה Cardiomyocytes חדרית נגזר תאי גזע Pluripotent

כאן אנו מציגים פרוטוקול סידן התמונה איתות באוכלוסיות של סוגי תאים בודדים באזור צומת עצב-שריר מאתר.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

אנו מציגים את המתודולוגיה עבור בידוד של מוציטים מורטין וכיצד להשיג מתח או סימני הסידן במקביל עם הקיצור סרקומר באמצעות מכשירי האור הפלואורסצנטית עם מדידות הגיאומטריה הדיגיטלית בו.

הדמיה אופטית של מודציטים מבודדים המוח החדרית

כאן אנו מתארים רכישה אופטית ואפיון של פוטנציאל פעולה מתאי גזע פלוריפוטנטים המושרים שמקורם בקרדיומיוציטים באמצעות מערכת פוטומטריה מודולרית במהירות גבוהה.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקר חלבוני ממברנה אלקטרוגניים על ידי מדידת שינויים בפוטנציאל הממברנה. בדיקה זו מספקת פלטפורמה לקריאה פונקציונלית של תעלות יונים מרובות המבוטאות אנדוגנית בשורות תאי אפיתל.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות של פוטנציאל ממברנה למחקר פונקציונלי בתפוקה גבוהה של שתי תעלות יונים אנדוגניות בשני קווי תאי אפיתל

לחקר תגובות של תאים מעוררים במבחנה, הפרוטוקול מתאר ניטור אופטי של שינויים ביצירת פוטנציאל הפעולה עקב אלקטרופורציה במודל תא מעורר פשוט של תאי HEK מהונדסים גנטית וכן שינויים במתח הטרנסממברני עם מיצוי אוטומטי של פרמטרים רלוונטיים.

ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

למד הדמיה אופטית של שינויי פוטנציאל ממברנה באמצעות חיישני מתח מקודדים גנטית. השיטה מאפשרת צפייה בזמן אמת בפעילות עצבית ומאפשרת ניתוח רציומטרי.

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

גלה סרטונים נוספים