ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדווח אופטית על השינויים הפוטנציאליים של הממברנה באמצעות מחוון מתח מקודד גנטית. שיטה זו תתאר את החוזקות והחולשות של הדמיה עם בדיקות מתח פלואורסצנטיות שונות המקודדות גנטית. לדוגמה, בדיקות מבוססות FRET יציעו את היתרון של הדמיה רציומטרית אך יתנו אות נמוך יותר.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לדמיין את הפעילות העצבית בזמן אמת. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיחס האות לרעש אינו גדול במיוחד וישנם מספר מקורות רעש ושלבים מרובים שיכולים להשתבש. משתמשים חדשים מבולבלים לעתים קרובות והפרעות נתפסות כאותות האמיתיים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כדי לוודא את תקפות הבדיקות המשמשות ומה היא מציינת בפועל. לצורך ההתקנה, מותקן מפצל תמונה בין מצלמות ה-CCD האיטיות והמהירות להדמיה של GEBI מבוסס FRET. לפני הניסוי, הכנס קוביית פילטר עם מראה דיכרואית ושני מסנני פליטה במפצל התמונה.

הסר את קוביית המסנן השנייה הזו בעת הדמיית GEVI עם חלבון פלואורסצנטי יחיד. כדי להתחיל בניסוי, אתר תא HEK293 בריא המראה פלואורסצנטיות ממברנה חזקה ומקומית בהשוואה לפלואורסצנציה הפנימית והימנע מתיקון תאים מעגליים כשהם מתחלקים או מתים. לאחר מכן הפעל דופק בדיקה כדי לבדוק את התגובה הנוכחית.

לאחר מכן, הורד את פיפטת מהדק התיקון ימינה מעל פני התא. לאחר מכן, הורד לאט את הפיפטה עד שהיא נוגעת בעדינות בקרום התא. התנגדות הממברנה צריכה לעלות למגה-אוהם אחד עד שניים.

לאחר מכן צור איטום ג'יגה-אוהם על ידי הפעלת לחץ שלילי בעדינות דרך הפיפטה. לאחר השגת איטום ג'יגה-אום, הגדר את פוטנציאל הפיפטה בפוטנציאל ההחזקה הרצוי. לאחר מכן, מקד את מצלמת ה-CCD המהירה בגוף התא.

עבור הקלטת GEVI מבוססת FRET, התאם את גודל התמונות המפוצלות כדי לקבל מרווח שווה view עבור כל אורך גל פליטה באמצעות הכפתורים במפצל התמונה. לאחר מכן קרע את קרום התא על ידי הפעלת לחץ שלילי על מנת ליצור את כל תצורת התא. כעת, פתח את תוכנת ההדמיה.

לאחר מכן לחץ על רכישת תפריט מצלמת SciMeasure כדי לפתוח את דף הרכישה של CCD. לאחר מכן, צור קובץ נתונים חדש כדי לשמור את ההקלטה. לחץ על פלט אנלוגי ולאחר מכן קרא ASCII כדי לפתוח קובץ פרוטוקול דופק על מנת לבצע את ההדמיה.

לאחר מכן לחץ על ממוצע החזרות הפנימיות כדי לממוצע את מספר הניסיונות. לאחר מכן סגור את דף הפלט האנלוגי. הגדר את פרמטרי הרכישה הספציפיים בדף הרכישה של CCD.

לאחר מכן הזן את הערכים הספציפיים למספר הפריימים לרכישה ומספר הניסיונות. לאחר מכן, לחץ על לקחת אופטיקה נתונים בתוספת BNC כפתור כדי להתחיל בהקלטה. בזמן שהדמיית המתח מתרחשת, עקוב אחר האוסילוסקופ כדי להבטיח תצורה יציבה של תא שלם לאורך כל ההקלטה.

כדי לחשב את שינוי הקרינה החלקית, לחץ על קובץ ולאחר מכן קרא קובץ נתונים כדי לפתוח קובץ נתונים שהוקלט בשלב הקודם. יש לראות את תמונת התא בעוצמת האור במנוחה בצד ימין. לאחר מכן, לחץ על הצג BNC כדי להציג את ערכי מתח הקצה הנוכחיים.

שנה את מצב העמוד ממסגרת RLI להפחתת מסגרת על מנת לנצל את פונקציית חיסור המסגרת כדי לזהות את הפיקסלים עם אותות אופטיים מגיבים. לאחר מכן, בחר שתי נקודות זמן לחיסור וזהה את אזור התא המציג אותות בתגובה לשינוי פוטנציאל הממברנה. לאחר מכן, ייעד את הפיקסלים שיש לנתח על-ידי גרירה או לחיצה על כל פיקסל.

הייצוג הגרפי של עוצמת הקרינה הממוצעת מהפיקסלים שנבחרו אמור להופיע בצד שמאל של חלון התוכנה. חלקו את הפיקסלים המופחתים בעוצמת האור במנוחה על ידי לחיצה על כפתור החלק ב-RLI כדי לקבל את ערכי שינוי הקרינה החלקית. כדי לייצא את הנתונים, הסר את גרף מתח הקצה הנוכחי על ידי ביטול לחיצה על הצג את התפריט של BNC.

עבור לפלט, שמור עקבות כפי שמוצג ASCII כדי לייצא את עקבות הקרינה בפורמט קובץ ASCII לניתוח התאמת העקומה. בהליך זה, צייר את גרף שינוי הקרינה לעומת המתח על ידי התוויית שינויי הקרינה החלקית בתגובה למתח בתוכנית ניתוח נתונים. לאחר מכן התאם את העקומה לפונקציית בולצמן על מנת לקבוע את טווח המתח של האות האופטי על ידי לחיצה על ניתוח, התאמה, התאמה סיגמואידית ואז פתח תיבת דו-שיח.

שרטט מחדש את שינויי הקרינה השברירית המנורמלת בתגובה למתח באמצעות תוכנית ניתוח הנתונים. כדי לחשב את מהירות התגובה האופטית, פתח את קובץ ה-ASCII ושרטט את עקבות שינוי הקרינה החלקית לעומת הזמן. לאחר מכן לחץ על בורר הנתונים בתוכנת ניתוח הנתונים ובחר נקודת זמן אחת המתאימה לתחילת דופק מתח מדורג ונקודת זמן שנייה שבה האות האופטי הגיע למצב יציב.

התאם טווח זה לפונקציית דעיכה מעריכית בודדת וכפולה על ידי לחיצה על ניתוח, התאמה, התאמה מעריכית ולאחר מכן פתח תיבת דו-שיח ודווח על ההתאמה הטובה יותר. איור זה מציג את השינוי הקרינה של תא HEK המבטא GEVI Bongwoori מבוסס FP יחיד. זהו שינוי פלואורסצנטי טיפוסי בתגובה לפולסי המתח המדורגים.

כאן צולם תא HEK293 עם מצלמת CCD מהירה. תמונה זו מציגה את עוצמת האור במנוחה של תא המבטא בונגוורי. וזוהי תמונת חיסור מסגרת המציינת את הפיקסלים שבהם נצפה שינוי הקרינה.

מוצגת כאן ההקלטה האופטית של פוטנציאל הפעולה המושרה מהנוירונים הראשוניים של ההיפוקמפוס של העכבר המבטאים בונגוורי. פוטנציאל הפעולה התעורר במצב מהדק זרמי התא השלם. עקבות שינוי הקרינה החלקית נבחרו מהפיקסלים הקשורים לסומה.

באיור זה, שינוי הקרינה של תא HEK המבטא GEVI מבוסס FRET מראה את התגובות לפולסי המתח המדורגים בשני אורכי גל. הוקלט בקילו-הרץ אחד עם מצלמת CCD מהירה. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור לבדוק רמות פלואורסצנטיות משתנות מכיוון שביטוי יתר של פלואורסצנטיות יכול להשפיע על בריאות התא.

בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו קידוד פורס על מנת לענות על שאלות נוספות הקשורות לפעילות נוירונים של מעגלים שונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לצלם את פוטנציאל הממברנה באמצעות סוגים שונים של בדיקה.