CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

המטרה הכללית של הליך השכפול והטרנספורמציה היא ליצור ביעילות וקטורי CRISPR ושורשי עגבנייה מוטנטיים עם נוק-אאוט (knock out) שניתן להשתמש בהם במחקרים של גנומיקה תפקודית. שיטה זו מהווה כלי שימושי בתחום הגנומיקה של צמחים, שכן היא מאפשרת ליצור מספר רב של מוטנטי נוק-אאוט שניתן להשתמש בהם במגוון תהליכים בשורשים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את הליך השכפול בשלב אחד, מה שמבטיח שניתן יהיה להשיג את החומרים לקבוצה תוך שבועות ספורים בלבד.

ראשית, תכננו אוליגואנוקלאוטידים של RNA מדריך או gRNA כך שיכללו את חלק ה-GN19 של מוטיבי המטרה, כשהם מוקפים ברצפי 20 נוקלאוטידים בקצוות ה-five prime וה-three prime הנדרשים להרכבת ה-DNA. בוצעו עיכול של 1-5 µg של פלסמיד P201N caznine באמצעות אנזים ההגבלה Spe1 בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. לאחר טיהור של תוצרי העיכול בעזרת עמודה בהתאם להוראות היצרן, השביחו את הדגימה ב-15 µL של 10 mM Tris HCl.

כמת את כמות ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטריה ב-UV. בצע עיכול שני עם האנזים להגבלה Swa1 בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך שעתיים. בדוק 100 עד 200 nanograms על ג'ל אגרוזה בריכוז zero point eight percent כדי לאשר עיכול מלא.

פלסמיד שעבר עיכור נכון יראה פס בודד בגובה של 14,313 זוגות בסיסים. להגברה באמצעות PCR של medicago truncatula, השתמשו בשישה מקדמים ו-scaffold DNA מתוך פלסמיד המעבורת puck gRNA. השתמשו בפריימרים Swa1 ו-Mtu6F ו-MTU6R, וב-scaffold F ב-Spe1 scaffold R, עם פולימראז בעל נאמנות גבוהה (high fidelity polymerase).

בצעו ויזואליזציה של מנות (aliquots) בנפח של 3 µL של תוצרי PCR על ג'ל אגרוז בריכוז של 1% כדי לאשר את ההגברה. האמפליקון של MTU6 הוא בעל אורך של 377 זוגות בסיסים, והאמפליקון של ה-scaffold הוא בעל אורך של 106 זוגות בסיסים. טהרו את תוצרי ה-PCR הנותרים באמצעות טיהור בעמודות (column purification) לפי הוראות היצרן.

בצעו כימות באמצעות ספקטרופוטומטריית UV כפי שנעשה קודם לכן ואחסנו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השעיקו מחדש את כל שפופרת ה-gRNA oligos לריכוז של 100 micromolar במים בדרגת מעבדה. הוסיפו מיקרוליטר אחד של ה-oligos ל-500 microliters של 1xNEB buffer 2.1 וערבבו היטב.

תכננו תוכנית במכשיר תרמו-סייקליסט (thermal cycler) בעל מכסה מחומם כדי לשמור על טמפרטורה של 50 °C. ערבבו 100 ng של הווקטור הליניארי, 50 ng של מקדם MtU6, 12 ng של Scaffold ומיקרוליטר אחד של אוליגו gRNA מדולל במים לנפח סופי של 5 µL. הוסיפו 5 µL של 2X high fidelity DNA Assembly Mastermix.

ערבבו היטב וסבבו במספינטה להורדת הנוזלים. דגרו את התגובה למשך 60 דקות בטרמוסייקליר בטמפרטורה של 50 degree Celsius. לאחר השעה ב-50 degree Celsius, הניחו את התגובה על קרח ולאחר מכן השתמשו בשני µL לטרנספורמציה של תאי E.Coli כשירים באמצעות טכניקות סטנדרטיות.

פרוס את התרמיוס על מצע LB Agar המועשר ב-50 milligrams per milliliter Kanamycin והדגר ב-37 degrees Celsius למשך לילה. סרוק את המושבות באמצעות PCR עם הפריימרים StUb3p 218R ו-1Sce1R. דלל מנה מהתגובה שנותרה של הרכבת ה-DNA במים ביחס של אחת לחמש, והשתמש ב-one microliter כביקורת חיובית לסריקת המושבות.

הוסיפו גם ננוגרם אחד של פלסמיד מעגלי P201N casnine כביקורת ללא רצף מושבב (no insert control). לאחר הגברה באמצעות PCR לפי הפרמטרים המופיעים בחלק הכתוב של הפרוטוקול, הדמיאנו את תוצר ה-PCR על ג'ל אגרוז בריכוז של אחוז אחד. להשבחות נכונות תהיה פס של 725 base pairs, ולוקטורים ללא רצפי מושבב תהיה פס של 310 base pair.

גדלו מושבות חיוביות בתרביות נוזליות של LB Can50 למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. למחרת, טהרו את הפלסמידים באמצעות ערכה לניקוי פלסמידים לפי הוראות היצרן. לאחר ביצוע ריצוף סנגר (Sanger sequencing) לפלסמידים המטוהרים באמצעות הפריימר StuB3P218R, ביצעו יישור (alignment) של הכרומטוגרמות לרצפי ה-MtU6 promoter, ה-Target וה-scaffold כדי לוודא שלא נכנסו שגיאות במהלך השכפול.

בצע עיקור דיאגנוסטי על ידי עיקור של מיקרוגרם אחד של פלסמיד באמצעות EcoR5 ו-Sti1. כאשר הדגימה תוצג על ג'ל אגרוז בריכוז 0.8%, תבנית פסים זו צריכה להופיע. לבסוף, העבר את הפלסמידים לתוך זן ARqua1 של Agrobacterium rhizogenes על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של תכשיר הפלסמיד ל-50 מיקרוליטר של תאים אלקטרו-קוֹמפֶּטנטיים, ובצע אלקטרופורציה בקוויט של 1 מילימטר.

הוסיפו כ-500 microliters של SOC Media ונערה בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך שעתיים. לאחר מכן, זרעו על מצעי LB Can50 והדריגו בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך יומיים. התחילו חלק זה של הפרוטוקול על ידי עיקור זרעי עגבנייה ב-20 percent אקונומיקה ביתית למשך 15 דקות תוך ערבוב קבוע.

לאחר מכן, העבירו את הזרעים למנדף זרימה למינרית. הסירו את האקונומיקה ושטפו במים סטריליים בדרגת מעבדה שלוש פעמים. זרעו 30 זרעים בקופסת GA7 המכילה מחצית מריכוז של MS Media.

יש להניח להם להנביט במשך כשניים ימים בחושך. לאחר שהזרעים הנביטו, העבירו את קופסאות ה-GA7 לאור. יום לפני הטרנספורמציה, זרעו תרבישי A.rhizogenes על מצע LB מוצק המכיל Can50 והגדילו בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך הלילה. ביום הטרנספורמציה, עבדו במCב laminar flow hood כדי להוסיף 25 microliters של Acetosyringone ל-50 milliliters של חצי מצע MS, ומזגו שישה milliliters לכל מבחנה תרבית.

השתמשו בטיפ של 200 מיקרוליטר שקופוף כדי לגרד תאי A.rhizogenes מהצילחת והשעיו אותם בשישה מיליליטר של מצע MS נוזלי בריכוז של חצי. ערבבו את המבחנה ב-Vortex כדי להשעיות את התאים באופן מלא. לאחר השעיית התאים מכל וקטור, קחו מיליליטר אחד של תאים ומדדו את הצפיפות האופטית באורך גל קבוע של 600 ננומטר.

הוסיפו שני מיליליטרים של תמיסת MS נוזלית בריכוז חצי לפטריה עם נייר סינון סטרילי. חתכו את העליים (cotyledons) מהנבטים והניחו אותם על נייר הסינון הלח. לאחר איסוף כל העליים, חתכו את הסנטימטר המרוחק ביותר (distal) מהעליים, כך שיתקבלו חלקי עלים עם שני קצוות חתוכים.

הוסיפו את החלקים המטוללים (ex plants) לתמיסאות A.rhizogenes וערבבו. דגרו למשך 20 דקות עם היפוך מדי פעם. במהלך הדגירה של A.rhizogenes, הוסיפו פיסת נייר סינון לפיתרי עם עבור כל טרנספורמציה של קונסטרוקט.

בנוסף, יש להניח מצע מוצק של MS בחצי ריכוז ללא אנטיביוטיקה במכסה הזרימה הלמינרית לייבוש. השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להוציא את העלים הראשוניים (cotyledons) מתמיסת ה-A.rhizogenes ולהניחם על נייר סינון יבש. כסו בנייר סינון במכסה של פטריה כדי להבטיח שהרקמות לא יתייבשו בעודכם ממשיכים לטרנספורמציה הבאה.

בשלב הבא, ייבשו את העלים הראשוניים (cotyledons) על נייר סינון והעבירו אותם לצלח המכיל מצע MS בריכוז חצי, כאשר הצד האבקסייאלי (abaxial) פונה כלפי מעלה. עטפו את הצלחות בסרט הדבקה כירורגי והבקיעו אותם יחד (co-cultivate) בחושך בטמפרטורת החדר למשך יומיים. לאחר התרבית המשותפת, העבירו את העלים הראשוניים, בצד האבקסייאלי פונה כלפי מעלה, למצע MS בריכוז חצי המועשר בתוספים.

עטפו בסרט דביק כירורגי. שמרו על התרביות תחת תאורה פלואורסצנטית בטמפרטורת החדר עם מחזור תאורה של 16 שעות. לאחר שבוע וחצי עד שבועיים, השתמשו בפינצטה סטרילית ובסקלפל כדי לחתוך שורשים באורך של לפחות שני סנטימטרים מהקוטילידונים, והעבירו אותם למצע MS בריכוז חצי המכיל Ticarcillon/Clavulanate Acid ו-Kanamycin.

העבירו עשרה עד 15 שורשים לצלחת אחת. סמנו את מיקום קצות השורשים בעזרת טוש. עטפו בסרט הדבקה כירורגי ושמרו בחדר התרביות.

לאחר שבוע, ניתן להבחין בשורשים שעברו טרנספורמציה הגדלים על המצע הסלקטיבי. אספו תת-דגימה של שורשים שעברו טרנספורמציה לצורך מיצוי DNA באמצעות שיטת מיצוי ה-DNA המועדפת. ניתן להבחין בשורשים שיערניים (Hairy roots) הבוקעים מהקוטילידונים 11 ימים לאחר הטרנספורמציה.

השורשים נבחרים על מצע MS חצי ריכוז, המועשר ב-Ticarcillon/Clavulanate Acid וב-Kanamycin, למשך כשבוע. פסים אפורים מציינים את מיקום קצות השורשים בזמן הזריעה. זוהי דוגמה לשבט וריצוף של תוצרי PCR לקביעת מוטציות ב-DNA עם שני יעדי גנים שונים בארבעה אירועי שורשים שיעריים שונים.

התיבה האפורה מציינת את רצף המטרה GN20 GG וסימן הדלתא מציין את סוג המוטציה. מספר השיבוטים עם המוטציה המצוינת מוצג מצד ימין. זוהי דוגמה לג'ל פוליאקרילאמיד לקביעת מוטציות ב-DNA.

מחיקות גדולות ופסים של Heteroduplex מעידים על נוכחות של מוטציות DNA ברצפים המטרה. שישה מתוך 12 אירועים עצמאיים סווגו כמוטנטים, כפי שמצוין על ידי סמל הדלתא. WT מציין את בקרת סוג הפרא (wild type) ו-NT את בקרת היעדר התבנית (no template control).

ברגע שהשיטה תשלט, ניתן לייצר עשרות עד מאות וקטורי CRISPR בשבוע אחד, ולהשיג חומרי קבוצות trendulate תוך מספר שבועות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להסיר ולעכב את צמיחתם של שאריות Agrobacterium. צמיחה יתר של Agrobacterium תעכב ותהרוג כל חומר שורש.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי הדרך ליצירת וקטורי CRISPR באמצעות הרכבת DNA, וכיצד לבחון וקטורים אלו באמצעות מערכת מודל של שורשים שיריים ועגבנייה.