Name: CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: למד ליצור וקטורי CRISPR וליצור מוטנטים של שורשי עגבניות שעירים לחקר גנומי פונקציונלי. שיטה זו מאפשרת בניית מספר וקטורים בשלב אחד ומייעלת את יצירת המוטנטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע מענק IOS-1025642 (GBM). אנו מודים מריה הריסון למתן את המתח ARqua1.

1. עיצוב מדריך RNA ובינוי וקטור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות רצפי היעד עבור הגנים של עניין. יש מגוון של תוכניות יעד-מציאת CRISPR באינטרנט מתאימה בשלב זה 13,14. הערה: כאן אנו משתמשים מוטיב היעד GN 20 GG, אבל עיצובים אחרים עשויים להיות מתאימים בהתאם למערכת יישום או וקטור בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב 60-mer oligos gRNA לכלול את חלק 19 GN של מוטיבי היעד מוקפים 5 &#39;ו 3&#39; 20-NT רצפים שנדרשים הרכבת DNA. מוטיב 60-mer הסופי הוא: 5&#39;-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 &quot;. הערה: רגיל, desalted פריימרים לעבוד בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הארבע DNAs להרכבה (איור 1). ראה קובץ משלים רצפי DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר 1 - 5 מיקרוגרם של p201N: Cas9 10 פלסמיד עם אנזים הגבלה Spe לי ב 1x הצפת 4 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. טור-לטהר את לעכלccording להוראות היצרן. Resuspend ב ~ 15 μl של 10 mM Tris-HCl, ולכמת ידי spectrophotometry UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע לעכל שני עם אנזים ההגבלה Swa לי ב 1x הצפת 3.1 ב 25 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. בדקו 100 - 200 ng על ג&#39;ל agarose 0.8% כדי לאשר עיכול שלם. הערה: פלסמיד מתעכל כראוי יהיה להקה אחת ב 14,313 BP. הערה: איון חום של האנזים dephosphorylation אינו נדרש. פלסמיד מתעכל עשוי להיות מאוחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את truncatula Medicago (הר) DNAs האמרגן פיגום U6 מן הפלסמיד Puc gRNA הסעות 10 באמצעות פריימרים Swa I_MtU6F / MtU6R ו ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR, בהתאמה. השתמש פולימראז באיכות גבוהה עם תנאי PCR: 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות; 31 מחזורים (98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 72 ° C למשך 30 שניות); ו 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו ~ 3 aliquots μl של pr PCRoducts על ג&#39;ל agarose 1% כדי לאשר הגברה. Amplicon MtU6 הוא 377 נ&quot;ב ואת amplicon הפיגום הוא 106 נ&quot;ב. טור-לטהר את מוצרי ה- PCR שנותרו על פי הוראות היצרן, לכמת ידי לספקטרופוטומטריה UV ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הצינור כולו של oligos gRNA 100 מיקרומטר במים מעבדה כיתה. הוסף 1 μl של 100 מיקרומטר אוליגו 500 μl של 1x הצפת 2.1. מערבבים היטב. אם איגום oligos המרובה, להוסיף 1 μl של כל אוליגו 100 מיקרומטר אל צינור 1x הצפת 2.1. oligos המדולל ניתן לאחסן ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת Cycler תרמית להחזיק ב 50 מעלות צלזיוס, באמצעות מכסה מחומם. מערבבים 100 ננוגרם (0.011 pmol) של וקטור לינארית, 50 ng (0.2 pmol) של האמרגן MtU6, 12 ng (0.2 pmol) של הפיגום, 1 μl (0.2 pmol) של אוליגו gRNA מדולל (ים), ומים בהיקף של 5 μl. הוסף 5 μl של תמהיל מאסטר הרכבה DNA באיכות גבוהה 2x, מערבבים היטב ספין למטה. דגירת תגובה במשך 60 דקות ב50 ° C Cycler תרמית. אז במקום את התגובה על הקרח. הערה: ניתן להגדיל כמויות תגובה כדי להתאים תשואות DNA נמוכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform 2 μl של התגובה לתוך E. המוסמכת קולי תאים באמצעות טכניקות סטנדרטיות צלחת על LB בתוספת 50 מ&quot;ג ל -1 kanamycin (Kan 50). לגדול-תאים מצופים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שמור את תגובת ההרכבה DNA הנותר ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך המושבה על ידי PCR באמצעות פריימרים StUbi3P218R ו ISceIR. לדלל aliquot של תגובת ההרכבה DNA הנותרת במים 1: 5. השתמש 1 μl כביקורת חיובית עבור מסך המושבה 1 ננוגרם של p201N המעגלי: פלסמיד Cas9 כביקורת ללא הוספה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את התנאים; 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות; 31 מחזורים (95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 58 ° C למשך 30 שניות, 72 ° C למשך 30 שניות); ו ב 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. דמיינו מוצרי ה- PCR על ג&#39;ל 1% agarose. ודא הוספות נכונות יש להקה ב 725 נ&quot;ב ו וקטורי שנינותמוסיף Hout (למשל, וקטור נימול) תהיה להקה 310-BP. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול מושבות חיוביות LB Kan 50 תרבויות נוזלי הלילה בשעת 37 ° C ולטהר פלסמידים פי הוראות היצרן. רצף סנגר פלסמידים עם פריימר StUbi3P218R וליישר chromatograms אמרגן MtU6, היעד, רצפי הפיגום כדי להבטיח שאין טעויות הוכנסו במהלך שיבוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע אבחון לעכל ידי לעכל ~ 1 מיקרוגרם של פלסמיד עם RV אקו ואני בדיר דמיינו על ג&#39;ל 0.8% agarose. שברים (ב BP) הם: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, ו -174. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הרכבת DNA לבנות וקטורים עם gRNAs המרובה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבנות וקטור עם שתי קלטות gRNA, PCR להגביר את gRNA-העמדה הראשונה עם פריימרים Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR ואת gRNA שנייה עמדה עם פריימרים UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR מ -1 ng של כל אחד בהתאמהפלסמידים נבנה בשלבים 1.1 - 1.8. השתמש תנאי PCR בשלב 1.3.3. דמיינו ~ 3 aliquots μl של מוצרי ה- PCR על ג&#39;ל agarose 1% כדי לאשר הגברה. Amplicons הם ~ 500 נ&quot;ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים ומערבבים כמויות שווה של מוצרי ה- PCR מטוהרים האו&quot;ם בתוך שפופרת 200 μl (בדרך כלל 3 - 4 μl של כל אחד). להרכבה, להוסיף 1 μl בשילוב מוצרי ה- PCR, 50 ng של Swa לי ו SPE שאני לינארית p201N: Cas9, מים מעבדה כיתה 2.5 μl 2.5 μl של תמהיל מאסטר הרכבה DNA באיכות גבוהה 2x. מדגירים את Cycler תרמית 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הערה: מדריכי DNA ההרכבה ממליץ על דגירת 15 דקות עבור 2 - 3 שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform 1 - 2 μl לתוך E. המוסמכת תאי צלחת coli על LB Kan 50. לגדל תאים מצופים ב 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. שמור את התגובה הנותרים ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך מושבה על ידי PCR עם פריימרים StUbi3P218R ו ISceIR עם אותם התנאים כמו צעד 1.6. ג הנכונהlones תהיה amplicon 1,200 נ&quot;ב. לגדול מושבות חיוביות LB Kan 50 תרבויות נוזלי הלילה ולטהר פלסמידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמידים רצף סנגר עם StUbi3P218R פריימרים (מכסה-העמדה הראשונה gRNA) ו p201R (מכסה-העמדה השנייה gRNA). יישר chromatograms אל רצפי אמרגן, יעד, פיגום MtU6. האבחון לעכל עם RV אקו בדיר שאני אביא את שהברים הבאים (נ&quot;ב): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. שבר מודגש מכיל את gRNA השני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הפגישה כל הציפיות-בקרת איכות, להפוך פלסמידים לתוך Agrobacterium rhizogenes זן ARqua1 15. הוסף 1 μl של הכנה פלסמיד 50 μl של תאים electrocompetent ו electroporate ב קובט 1 מ&quot;מ עם הגדרות: 2.4 קילו וולט, 25 μF, ו -200 Ω. שחזור תאים ~ 500 μl של SOC ולנער על 28 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. פלייט על LB Kan 50 גרםשורה על 28 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. בצע מסך המושבה באמצעות באותו פריימרים ותנאי PCR כמו 1.3.3. הפוך מניות גליצרול של שיבוטים חיוביים. </li></ol> 2. טרנספורמציה שעירים שורש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר זרעי עגבניות ב אקונומיקה ביתית 20% במשך 15 דקות, עם ערבוב מתמיד. במנדף זרימה למינרית, להסיר את האקונומיקה ולשטוף במי מעבדת כיתה סטריליים 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 30 זרעים בקופסה GA-7 המכיל התקשורת ½ MS (2.22 גרם ל -1 מלחים MS + Gamborg ויטמינים, 10 גרם ל -1 סוכרוז, 3 גרם ל -1 מסטיק gellan, pH 5.8). לנבוט עבור ~ 2 ימים בחושך, ואז לעבור GA-7 תיבות אור. לגדל שתילים עבור ~ 4 ימים יותר באור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני השינוי, מתוך פס א rhizogenes תרבויות על LB Kan 50 ולגדול מוצק ב 28 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום של טרנספורמציה, בשכונת הזרימה למינרית להרכיב חומרים מעוקרים: 12 מיליליטר צינורות תרבות, 50 מ&quot;ל צינור חרוטים, ½ נוזל MS (לא גרם gellanאממ), 200 מיקרומטר acetosyringone, נייר סינון, צלחות פטרי, מלקחיים אזמל, טפטפות וטיפים פיפטה. הוסף 25 μl של acetosyringone 50 מ&quot;ל של ½ MS ויוצקים ~ 6 מ&quot;ל לתוך צינור אחד תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש טיפ 200 μl כפוף לגרד א rhizogenes תאים מהצלחת ו resuspend ב 6 מ&quot;ל של נוזל ½ MS. הצינור וורטקס resuspend התאים לחלוטין. לאחר resuspending תאים מפני כל וקטור, למדוד את הצפיפות האופטית (OD) של 1 מיליליטר של תאים באורך גל קבוע של 600 ננומטר. ודא OD הוא בין 0.2 ו 0.4; לדלל או להוסיף עוד תאים לפי הצורך. חזור על הפעולה עבור כל מבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ~ 2 מ&quot;ל של נוזל ½ MS כדי בצלחת פטרי עם נייר סינון סטרילי. cotyledons בלו מן השתילים ומניחים על נייר פילטר טבול. לאחר כל cotyledons כבר נאספו, לחתוך את דיסטלי ~ 1 ס&quot;מ הנחה של cotyledons, וכתוצאה מכך חלקים טבורית עם שני הקצוות לחתוך. להוסיף explants א פתרונות rhizogenes, לערבב, דגירה במשך 20 דקותעם היפוך מזדמן. הערה: כ 12 explants לכל לבנות משמשים באופן שגרתי, אם כי רבים כמו 80 explants כבר מחוסן ב 6 מ&quot;ל של א פתרון rhizogenes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך א דגירת rhizogenes, להוסיף נייר סינון כדי צלחות פטרי, לבנות לכל אחד טרנספורמציה. כמו כן נקבע ½ MS תקשורת מוצקה, ללא אנטיביוטיקה, בשכונת הזרימה למינרית לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סקופ cotyledons מתוך א פתרון rhizogenes עם מלקחיים ומניחים סטרילי על נייר סינון יבש. מכסים עם מכסה פטרי כדי להבטיח רקמות שלא יתייבשו תוך שתמשיך השינוי הבא. cotyledons הכתם על נייר הסינון והעברה, abaxial כלפי מעלה, כדי ½ תקשורת MS. גלישת צלחות עם הקלטת וכירורגי שיתוף לטפח בחושך בטמפרטורת החדר למשך 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שיתוף טיפוח, cotyledons העברה, abaxial כלפי מעלה, כדי ½ התקשורת MS בתוספת 300 מ&quot;ג ל -1 ticarcillin / חומצה clavulanic (טים 300, כדי למנוע את צמיחת residרע&quot;מ א rhizogenes) ו קאן 50 (לבחירת צמח) ולעטוף בעזרת פלסטר. לשמור על תרבויות תחת אורות הניאון בטמפרטורת החדר עם photoperiod 16 שעות ביממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ~ 1.5 - 2 שורשים שבועות לפחות 2 ס&quot;מ אורך הם נכרת מן cotyledons באמצעות מלקחיים סטרילית אזמל והועברו ½ MS Kan 50 טים 300 מדיה. העבר 10 עד 15 שורשי צלחת אחת. סמן את המיקום של טיפים שורש בטוש, לעטוף בעזרת פלסטר, ולשמור בחדר התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שבוע אחד, שורשי טרנספורמציה נראים הגוברים על התקשורת סלקטיבית. בציר subsample של שורשי טרנספורמציה להפקת DNA בשיטת DNA שאיבת המועדפת. הערה: צלחות עם cotyledons יכולות להישמר במשך 2 - 3 יבולים שבועיים, ולאחר מכן הם השורשים לצמוח לתוך בלגן סבוך וקשים לבודד. יכול להישמר רקמות השורש ללא שנקטפו ללא הגבלת זמן. מגוון של מבחנים יכול להתבצע על דגימת DNA המבודדתים כדי לקבוע תדירות מוטציה בדנ&quot;א וסוג. תוצאות מכמה מבחנים כאלה מתוארות להלן. </li></ol>

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Zhou, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (509), 487-491 (2014).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), (2014).</li>
<li>Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+plant+genomes+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Editing plant genomes with CRISPR/Cas9.</a> Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).</li>
<li>Bortesi, L., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas9+system+for+plant+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.</a> Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Jia, H. G., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+of+sweet+orange+using+Cas9%2FsgRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA.</a> Plos One. 9, (2014).</li>
<li>Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Guided+Genome+Editing+for+Target+Gene+Mutations+in+Wheat%5BTitle%5D)+AND+%22G3-Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).</li>
<li>Ron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+transformation+using+Agrobacterium+rhizogenes.+as+a+tool+for+exploring+cell+type-specific+gene+expression+and+function+using+tomato+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model.</a> Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).</li>
<li>Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modifications+in+soybean+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9.</a> BMC Biotechnology. 15, (2015).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+SNPs+for+biallelic+CRISPR+mutations+in+the+outcrossing+woody+perennial+Populus+reveals+4-coumarate%3ACoA+ligase+specificity+and+redundancy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy.</a> New Phytologist. , (2015).</li>
<li>Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCTop%3A+An+Intuitive%2C+Flexible+and+Reliable+CRISPR%2FCas9+Target+Prediction+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool.</a> Plos One. 10, (2015).</li>
<li>Lei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-P%3A+A+Web+Tool+for+Synthetic+Single-Guide+RNA+Design+of+CRISPR-System+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants.</a> Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).</li>
<li>Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRANSGENIC+ROOT-NODULES+OF+VICIA-HIRSUTA+-+A+FAST+AND+EFFICIENT+SYSTEM+FOR+THE+STUDY+OF+GENE-EXPRESSION+IN+INDETERMINATE-TYPE+NODULES%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).</li>
<li>Zhu, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Scientific Reports. 4 (8), (2014).</li>
<li>Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genome+editing+made+easy%3A+targeted+mutagenesis+in+model+and+crop+plants+using+the+CRISPR%2FCas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system.</a> Plant Methods. 9 (1), 39(2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Li, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+and+homologous+recombination-mediated+genome+editing+in+Arabidopsis+and+Nicotiana+benthamiana+using+guide+RNA+and+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9.</a> Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).</li>
<li>Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li>
<li>Torella, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+nucleotide+sequence-guided+assembly+of+repetitive+DNA+parts+for+synthetic+biology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications.</a> Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).</li>
<li>Ono, N. N., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiplicity+of+hairy+root+cultures%3A+Prolific+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities.</a> Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).</li>
<li>Tepfer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+several+species+of+higher+plants+by+Agrobacterium+rhizogenes.%3A+sexual+transmission+of+the+transformed+genotype+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype.</a> Cell. 37 (3), 959-967 (1984).</li>
<li>Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misexpression+of+miR482%2C+miR1512%2C+and+miR1515+Increases+Soybean+Nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation.</a> Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).</li>
<li>Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vitro.+composite+plants%3A+an+inexpensive%2C+rapid+method+for+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology.</a> Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

מכיוון שהרכבת DNA משמשת לשילוב מחדש של רצפי DNA חופפים, ניתן ליישם שיטת שיבוט זו על כל מבנה וקטור CRISPR. רוב תוכניות השיבוט של CRISPR משתמשות בסינתזה גנטית של ה-gRNA, אנזימי הגבלה מסוג IIS17,18, או PCR19 עם הרחבה חופפת. לכל אחת מהטכניקות הללו יש יתרונות וחסרונות מובנים, אך הן בדרך כלל דורשות שלבי שיבוט מעשיים מרובים. היתרון העיקרי של שיטת השיבוט המוצגת כאן הוא שהתהליך כולו מתרחש בתגובה אחת של שעה וניתן לאגד אוליגוס gRNA כדי לייעל עוד יותר את הליך השיבוט. יתר על כן, מנגנון הרכבת ה-DNA אינו תלוי באנז...

היכולת ליצור שינויי DNA ממוקדים עם CRISPR / יש Cas9 פוטנציאל גדול ללימודי גנומיקה תפקודית. ישנם שני מרכיבים של מערכת CRISPR / Cas9; nuclease Cas9, נגזר pyogenes Staphylococcus ו RNA מדריך כ 100-NT (gRNA) מולקולה שמנתב Cas9 לאתר DNA ממוקד (ים) 1. זיהוי מטרות הוענק על היד הראשונה ~ 20-NT של gRNA, המאפשר לייצור תפוקה גבוהה של וקטורי מיקוד 2,3. רוב האורגניזמים שיכול להיות מהונדסים, כבר היה עם CRISPR / Cas9 הטכנולוגיה 4,5. בצמחים, יזמים מכוננים, כמו המקדם 35S CaMV, משמשים בדרך כלל לנהוג הביטוי של nuclease Cas9 6. GRNAs באים לידי ביטוי באמצעות היזמים U6 או U3 RNA פולימראז III המגביל את הבסיס הראשון של gRNA או א G עבור U6 או עבור U3, שעתוק יעיל. עם זאת RNA פולימראז II לנשףoters, שהם ללא הגבלות אלה, יש גם שימש 7,8. gRNAs שונים לגרום מוטציות DNA עם יעילות שונים, ולכן זה יכול להיות חשוב כדי לאמת וקטורים CRISPR הראשון לפני השקעה טרנספורמציות כל-צמח או הגדרת מסכי פנוטיפי נרחב. ביטוי חולף של CRISPR בונה בצמחים, באמצעות agroinfiltration למשל, בדרך כלל תוצאות בתדירות נמוכה יותר של שינוי ה- DNA לעומת צמחים יציבים 6, ביצוע זיהוי של מוטציות מבחני פנוטיפי קשות מעשיים עם גישות כאלה. מה שנקראו שורשי שעירים הם מערכת נוחה, חלופה מאז מספר רב של עצמאיים, חומרים טרנספורמציה ביציבות יכול להיוצר תוך מספר שבועות, בניגוד לחודשים לצמחים יציבים. וקטורי CRISPR יעילים מאוד גרימת מוטציות DNA ב שורשי שעירי 9,10. שיטות הרכבת DNA ולקשור ביעילות שברת DNA המכיל overlapping מסתיים 11. יתרון עיקרי של כמה שיטות הרכבת DNA הוא היכולת לשלב ssDNA (כלומר, oligos) לתוך המוצרים הנאספים. מאז gRNAs הוא רק ~ 20-NT ארוך מטרות חדשות יכולות להתבצע עם oligos המסונתז, שיטות הרכבת DNA אלה בהחלט מתאימות לשיבוט CRISPR. הפרוטוקולים המתוארים כאן מבוססים על סדרת P201 של וקטורי CRISPR כי נעשה שימוש בהצלחת סויה 10, צפצפת 12 ועכשיו עגבניות. תהליך השכפול הציג מציע מספר יתרונות על פני שיטת השיבוט הנוכחית 10. כלומר, וקטורים מתפקדים במלואה יכולים להיוצר תגובת שיבוט יחידה ביום אחד. בניית וקטור ניתנת ותקווה גם כדי לייצר וקטורי CRISPR מרובים במקביל, מקטינה עוד יותר ידות על עלויות זמן וחומר. כמו כן, אנו מציגים פרוטוקול ההדור של שורשי שעירים עגבניים כמו שיטה יעילה להפקת חומרים מהונדסים עם מחיקות גן ממוקדות. שורשי שעירים משמשים תקףאכלו הווקטורים CRISPR ולספק חומר לניסויים הבאים.

<table><tbody><tr><td>NEBuilder&reg; (תערובת הרכבת DNA HiFi)</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E5520</td><td></td></tr><tr><td>p201N:Cas9</td><td>Addgene</td><td>59175</td><td>הפלסמיד p201H:Cas9 (59176) תואם גם לחפיפות ולאנזימים המדווחים.</td></tr><tr><td>pUC gRNA Shuttle</td><td>Addgene</td><td>47024</td><td></td></tr><tr><td>SwaI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0604S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>Zymo נקי ורכז-5 טיהור עמודות</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>NEB CutSmart (מאגר 4)</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 3.1</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>EconoSpin מיני טור ספין (הכנת פלסמיד)</td><td>Epoch Life Sciences</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF&reg;</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>StyI-HF&reg;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R3500S</td><td></td></tr><tr><td>מלחי MS + ויטמינים גמבורג</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>M404</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel&trade; (מסטיק גלאן)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>GA-7 קופסאות</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V8505</td><td></td></tr><tr><td>Micropore&trade; סרט כירורגי</td><td>3M</td><td>1535-0</td><td></td></tr><tr><td>Timentin&reg; (טיקרצילין/חומצה קלבולנית)</td><td>שונות</td><td>0029-6571-26</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים 5' &#8594; 3'SwaI_MtU6F</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MtU6R&nbsp; &nbsp;</td><td>AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיגומיF&nbsp;</td><td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeI_Scaffold R</td><td>GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StUbi3P218R&nbsp;</td><td>ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISceIR</td><td>GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG</td><td>לא ניתן להשתמש בריצוף סנגר מכיוון שיש אתר קשירה שני על UNS1_Scaffold הפלסמיד</td><td></td></tr><tr><td>R&nbsp;</td><td>GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNS1_MtU6 F&nbsp; &nbsp;</td><td>CATTACTCGCATCCATTCTCATCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p201R&nbsp;</td><td>CGCGCCGAATTCTAGTGATCG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רצפים מודגשים מציינים חפיפות של 20-nt עם p201N:Cas9 ליניארי.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

crispr וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי dna על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

מוטציות DNA ממוקדות שנוצרו על ידי וקטורים עם טכנולוגיית CRISPR/Cas9 הוכחו כשימושיות למחקרי גנומיקה פונקציונלית. בעוד שרוב אסטרטגיות השיבוט פשוטות לביצוע, הן בדרך כלל משתמשות במספר שלבים ויכולות לדרוש מספר ימים כדי ליצור את המבנים האולטימטיביים. השיטה המוצגת כאן מבוססת על הרכבת DNA ויכולה לייצר וקטורי CRISPR פונקציונליים לחלוטין בתגובת שיבוט אחת. ניתן גם לאגד בניית וקטור, מה שמגדיל עוד יותר את היעילות והתועלת של התהליך. שינוי של השיטה משמש ליצירת וקטורי CRISPR עם מטרות גנים מרובות. לאחר מכן, וקטורי CRISPR הופכים לשורשים שעירים של עגבניות כדי ליצור חומרים טרנסגניים עם שינויים ממוקדים ב-DNA. שורשים שעירים הם מערכת שימושית לבדיקת פונקציונליות וקטורית מכיוון שהם פשוטים מבחינה טכנית לייצור וניתנים לייצור בקנה מידה גדול. לשיטות המוצגות כאן יהיה יישום רחב מכיוון שניתן להשתמש בהן ליצירת מגוון וקטורים של CRISPR ולהשתמש בהן במגוון רחב של מיני צמחים.

בניית וקטור CRISPR עם הרכבת DNA בדרך כלל מייצרת עשרות עד מאה שיבוטים עצמאיים. הקרנת מושבה על ידי PCR בקלות מזהה שיבוטים נכונים ויכולה להבחין בין פלסמידים עם ובלי הוסיף (איור 2 א) וזה שימושי לפתרון בעיות. בדרך כלל, כל השיבוטים מכילים אינסרט לבין משתמש יכול לבחור לדלג על שלבי הקרנת מושבה לגמרי. מעכל אבחון (איור 2 ב) ו רצף סנגר משמשים לבקרת איכות. כאשר טעויות מתרחשות, הם בדרך כלל הם נצפו באזורי DNA החופפים, כלומר,...

באמצעות הרכבת DNA, וקטורי CRISPR מרובים ניתן לבנות במקביל לתגובת שיבוט יחידה, מה שהופך את הבנייה של מספר רב של CRISPR וקטורי משימה פשוטה. עגבניות שורשי שעירים מהווים מערכת מודל מצוינת כדי לאמת וקטורי CRISPR וליצור חומרי מוטציה.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

המטרה הכללית של הליך השכפול והטרנספורמציה היא ליצור ביעילות וקטורי CRISPR ושורשי עגבנייה מוטנטיים עם נוק-אאוט (knock out) שניתן להשתמש בהם במחקרים של גנומיקה תפקודית. שיטה זו מהווה כלי שימושי בתחום הגנומיקה של צמחים, שכן היא מאפשרת ליצור מספר רב של מוטנטי נוק-אאוט שניתן להשתמש בהם במגוון תהליכים בשורשים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את הליך השכפול בשלב אחד, מה שמבטיח שניתן יהיה להשיג את החומרים לקבוצה תוך שבועות ספורים בלבד.ראשית, תכננו אוליגואנוקלאוטידים של RNA מדריך או gRNA כך שיכללו את חלק ה-GN19 של מוטיבי המטרה, כשהם מוקפים ברצפי 20 נוקלאוטידים בקצוות ה-five prime וה-three prime הנדרשים להרכבת ה-DNA. בוצעו עיכול של 1-5 µg של פלסמיד P201N caznine באמצעות אנזים ההגבלה Spe1 בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. לאחר טיהור של תוצרי העיכול בעזרת עמודה בהתאם להוראות היצרן, השביחו את הדגימה ב-15 µL של 10 mM Tris HCl.כמת את כמות ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטריה ב-UV. בצע עיכול שני עם האנזים להגבלה Swa1 בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך שעתיים. בדוק 100 עד 200 nanograms על ג'ל אגרוזה בריכוז zero point eight percent כדי לאשר עיכול מלא.פלסמיד שעבר עיכור נכון יראה פס בודד בגובה של 14,313 זוגות בסיסים. להגברה באמצעות PCR של medicago truncatula, השתמשו בשישה מקדמים ו-scaffold DNA מתוך פלסמיד המעבורת puck gRNA. השתמשו בפריימרים Swa1 ו-Mtu6F ו-MTU6R, וב-scaffold F ב-Spe1 scaffold R, עם פולימראז בעל נאמנות גבוהה (high fidelity polymerase).בצעו ויזואליזציה של מנות (aliquots) בנפח של 3 µL של תוצרי PCR על ג'ל אגרוז בריכוז של 1% כדי לאשר את ההגברה. האמפליקון של MTU6 הוא בעל אורך של 377 זוגות בסיסים, והאמפליקון של ה-scaffold הוא בעל אורך של 106 זוגות בסיסים. טהרו את תוצרי ה-PCR הנותרים באמצעות טיהור בעמודות (column purification) לפי הוראות היצרן.בצעו כימות באמצעות ספקטרופוטומטריית UV כפי שנעשה קודם לכן ואחסנו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השעיקו מחדש את כל שפופרת ה-gRNA oligos לריכוז של 100 micromolar במים בדרגת מעבדה. הוסיפו מיקרוליטר אחד של ה-oligos ל-500 microliters של 1xNEB buffer 2.1 וערבבו היטב.תכננו תוכנית במכשיר תרמו-סייקליסט (thermal cycler) בעל מכסה מחומם כדי לשמור על טמפרטורה של 50 °C. ערבבו 100 ng של הווקטור הליניארי, 50 ng של מקדם MtU6, 12 ng של Scaffold ומיקרוליטר אחד של אוליגו gRNA מדולל במים לנפח סופי של 5 µL. הוסיפו 5 µL של 2X high fidelity DNA Assembly Mastermix.ערבבו היטב וסבבו במספינטה להורדת הנוזלים. דגרו את התגובה למשך 60 דקות בטרמוסייקליר בטמפרטורה של 50 degree Celsius. לאחר השעה ב-50 degree Celsius, הניחו את התגובה על קרח ולאחר מכן השתמשו בשני µL לטרנספורמציה של תאי E.Coli כשירים באמצעות טכניקות סטנדרטיות.פרוס את התרמיוס על מצע LB Agar המועשר ב-50 milligrams per milliliter Kanamycin והדגר ב-37 degrees Celsius למשך לילה. סרוק את המושבות באמצעות PCR עם הפריימרים StUb3p 218R ו-1Sce1R. דלל מנה מהתגובה שנותרה של הרכבת ה-DNA במים ביחס של אחת לחמש, והשתמש ב-one microliter כביקורת חיובית לסריקת המושבות.הוסיפו גם ננוגרם אחד של פלסמיד מעגלי P201N casnine כביקורת ללא רצף מושבב (no insert control). לאחר הגברה באמצעות PCR לפי הפרמטרים המופיעים בחלק הכתוב של הפרוטוקול, הדמיאנו את תוצר ה-PCR על ג'ל אגרוז בריכוז של אחוז אחד. להשבחות נכונות תהיה פס של 725 base pairs, ולוקטורים ללא רצפי מושבב תהיה פס של 310 base pair.גדלו מושבות חיוביות בתרביות נוזליות של LB Can50 למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. למחרת, טהרו את הפלסמידים באמצעות ערכה לניקוי פלסמידים לפי הוראות היצרן. לאחר ביצוע ריצוף סנגר (Sanger sequencing) לפלסמידים המטוהרים באמצעות הפריימר StuB3P218R, ביצעו יישור (alignment) של הכרומטוגרמות לרצפי ה-MtU6 promoter, ה-Target וה-scaffold כדי לוודא שלא נכנסו שגיאות במהלך השכפול.בצע עיקור דיאגנוסטי על ידי עיקור של מיקרוגרם אחד של פלסמיד באמצעות EcoR5 ו-Sti1. כאשר הדגימה תוצג על ג'ל אגרוז בריכוז 0.8%, תבנית פסים זו צריכה להופיע. לבסוף, העבר את הפלסמידים לתוך זן ARqua1 של Agrobacterium rhizogenes על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של תכשיר הפלסמיד ל-50 מיקרוליטר של תאים אלקטרו-קוֹמפֶּטנטיים, ובצע אלקטרופורציה בקוויט של 1 מילימטר.הוסיפו כ-500 microliters של SOC Media ונערה בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך שעתיים. לאחר מכן, זרעו על מצעי LB Can50 והדריגו בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך יומיים. התחילו חלק זה של הפרוטוקול על ידי עיקור זרעי עגבנייה ב-20 percent אקונומיקה ביתית למשך 15 דקות תוך ערבוב קבוע.לאחר מכן, העבירו את הזרעים למנדף זרימה למינרית. הסירו את האקונומיקה ושטפו במים סטריליים בדרגת מעבדה שלוש פעמים. זרעו 30 זרעים בקופסת GA7 המכילה מחצית מריכוז של MS Media.יש להניח להם להנביט במשך כשניים ימים בחושך. לאחר שהזרעים הנביטו, העבירו את קופסאות ה-GA7 לאור. יום לפני הטרנספורמציה, זרעו תרבישי A.rhizogenes על מצע LB מוצק המכיל Can50 והגדילו בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך הלילה. ביום הטרנספורמציה, עבדו במCב laminar flow hood כדי להוסיף 25 microliters של Acetosyringone ל-50 milliliters של חצי מצע MS, ומזגו שישה milliliters לכל מבחנה תרבית.השתמשו בטיפ של 200 מיקרוליטר שקופוף כדי לגרד תאי A.rhizogenes מהצילחת והשעיו אותם בשישה מיליליטר של מצע MS נוזלי בריכוז של חצי. ערבבו את המבחנה ב-Vortex כדי להשעיות את התאים באופן מלא. לאחר השעיית התאים מכל וקטור, קחו מיליליטר אחד של תאים ומדדו את הצפיפות האופטית באורך גל קבוע של 600 ננומטר.הוסיפו שני מיליליטרים של תמיסת MS נוזלית בריכוז חצי לפטריה עם נייר סינון סטרילי. חתכו את העליים (cotyledons) מהנבטים והניחו אותם על נייר הסינון הלח. לאחר איסוף כל העליים, חתכו את הסנטימטר המרוחק ביותר (distal) מהעליים, כך שיתקבלו חלקי עלים עם שני קצוות חתוכים.הוסיפו את החלקים המטוללים (ex plants) לתמיסאות A.rhizogenes וערבבו. דגרו למשך 20 דקות עם היפוך מדי פעם. במהלך הדגירה של A.rhizogenes, הוסיפו פיסת נייר סינון לפיתרי עם עבור כל טרנספורמציה של קונסטרוקט.בנוסף, יש להניח מצע מוצק של MS בחצי ריכוז ללא אנטיביוטיקה במכסה הזרימה הלמינרית לייבוש. השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להוציא את העלים הראשוניים (cotyledons) מתמיסת ה-A.rhizogenes ולהניחם על נייר סינון יבש. כסו בנייר סינון במכסה של פטריה כדי להבטיח שהרקמות לא יתייבשו בעודכם ממשיכים לטרנספורמציה הבאה.בשלב הבא, ייבשו את העלים הראשוניים (cotyledons) על נייר סינון והעבירו אותם לצלח המכיל מצע MS בריכוז חצי, כאשר הצד האבקסייאלי (abaxial) פונה כלפי מעלה. עטפו את הצלחות בסרט הדבקה כירורגי והבקיעו אותם יחד (co-cultivate) בחושך בטמפרטורת החדר למשך יומיים. לאחר התרבית המשותפת, העבירו את העלים הראשוניים, בצד האבקסייאלי פונה כלפי מעלה, למצע MS בריכוז חצי המועשר בתוספים.עטפו בסרט דביק כירורגי. שמרו על התרביות תחת תאורה פלואורסצנטית בטמפרטורת החדר עם מחזור תאורה של 16 שעות. לאחר שבוע וחצי עד שבועיים, השתמשו בפינצטה סטרילית ובסקלפל כדי לחתוך שורשים באורך של לפחות שני סנטימטרים מהקוטילידונים, והעבירו אותם למצע MS בריכוז חצי המכיל Ticarcillon/Clavulanate Acid ו-Kanamycin.העבירו עשרה עד 15 שורשים לצלחת אחת. סמנו את מיקום קצות השורשים בעזרת טוש. עטפו בסרט הדבקה כירורגי ושמרו בחדר התרביות.לאחר שבוע, ניתן להבחין בשורשים שעברו טרנספורמציה הגדלים על המצע הסלקטיבי. אספו תת-דגימה של שורשים שעברו טרנספורמציה לצורך מיצוי DNA באמצעות שיטת מיצוי ה-DNA המועדפת. ניתן להבחין בשורשים שיערניים (Hairy roots) הבוקעים מהקוטילידונים 11 ימים לאחר הטרנספורמציה.השורשים נבחרים על מצע MS חצי ריכוז, המועשר ב-Ticarcillon/Clavulanate Acid וב-Kanamycin, למשך כשבוע. פסים אפורים מציינים את מיקום קצות השורשים בזמן הזריעה. זוהי דוגמה לשבט וריצוף של תוצרי PCR לקביעת מוטציות ב-DNA עם שני יעדי גנים שונים בארבעה אירועי שורשים שיעריים שונים.התיבה האפורה מציינת את רצף המטרה GN20 GG וסימן הדלתא מציין את סוג המוטציה. מספר השיבוטים עם המוטציה המצוינת מוצג מצד ימין. זוהי דוגמה לג'ל פוליאקרילאמיד לקביעת מוטציות ב-DNA.מחיקות גדולות ופסים של Heteroduplex מעידים על נוכחות של מוטציות DNA ברצפים המטרה. שישה מתוך 12 אירועים עצמאיים סווגו כמוטנטים, כפי שמצוין על ידי סמל הדלתא. WT מציין את בקרת סוג הפרא (wild type) ו-NT את בקרת היעדר התבנית (no template control).ברגע שהשיטה תשלט, ניתן לייצר עשרות עד מאות וקטורי CRISPR בשבוע אחד, ולהשיג חומרי קבוצות trendulate תוך מספר שבועות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להסיר ולעכב את צמיחתם של שאריות Agrobacterium. צמיחה יתר של Agrobacterium תעכב ותהרוג כל חומר שורש.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי הדרך ליצירת וקטורי CRISPR באמצעות הרכבת DNA, וכיצד לבחון וקטורים אלו באמצעות מערכת מודל של שורשים שיריים ועגבנייה.

high-throughput-crispr-vector-construction-characterization-dna

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדגימים כיצד צמחים שורש שעיר המשולב יכול לשמש כדי ללמוד צמחים rhizobium אינטראקציות nodulation ב קשות להפוך...

דור של צמחים Composite ב Medicago truncatula המשמש מבחני Nodulation

שיטת הקרח יתר מאפשר לגדל צמחים צלחות 96-היטב שאינם destructively שורש רקמה מן הקציר שתיל אחד. הדנ"א מופק רקמות השורש הזה יכול לשמש התגובות genotyping. מצאנו כי קרח יתר עובד היטב...

Ice יתר: שיטה גידול ארבידופסיס צמחים עגבניות ב 96-פלטות היטב genotyping תפוקה גבוהה

צמחים מציעים מערכת חדשנית לייצור של חלבוני תרופות בהיקף מסחרי, כי הוא יותר ניתן להרחבה, יעיל וחסכונית ובטוחה יותר מפרדיגמות ביטוי הנוכחיות. במחקר זה, אנו מדווחים גישה פשוטה ונוחה, אך ניתן להרחבה להציג את היעד של גן...

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

אגרואינפיציה ו- PVX agroinfection הם מבחנים תפקודיים שגרתיים לביטוי חוץ רחמי חולף של גנים בצמחים. שיטות אלה הן מבחנים יעילים באסטרטגיות אפקטאורומיות (התנגדות מהירה ותגלית גנים ארסית) וחיוניות למחקר מודרני בפתולוגיה של צמחים מולקולריים. הם עונים על הביקוש לניתוח תפקודי חזק בעל תפוקה גבוהה בצמחים.

אגרוינפינציה ו- PVX אגרוינבינציה בתפוח אדמה וניקוטיאנה בנתאמיאנה

ניתוח ביטוי יזם מכריעים לשיפור ההבנה של הכונה וביטוי ייתכן היעד גנים. במסמך זה אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות, לבודד לשבט מקדם הצמח. עוד יותר, אנו מתארים את האפיון של האמרגן גולה ספציפיים שורשים שעירים שעועית נפוצות.

מי קולחין יזם: זיהוי ואפיון של השורש גולה יזם ספציפי בתוך השעועית נפוצות

הביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana טבק העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים. בזאת הוא תיאר נוהל מפורט לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה (5 ימים) של triterpenes, תחליפי ניצול פלטפורמה חזקה זו מבוססת על צמחים.

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

כאן, אנו מציגים שיטה רב-תכליתית לשינוי בשורש העגבניות ולאחריה החיסון לביצוע ניתוח גנטי פשוט לחקר מחלות וילט בקטריאלי.

שורש עגבניות המרה ואחריו חיסונים עם Ralstonia Solanacearum ניתוח גנטי פשוט של מחלת וילט חיידקי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של שורשים שעירים סויה מהונדסים.

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול המפורט של שיטת טרנספורמציה חד-שלבית בתיווך Agrobacterium tumefaciens לייצור צמחים מרוכבים.

שיטה יעילה וניתנת לשחזור לייצור צמחים מרוכבים על ידי טרנספורמציית שורשים שעירים מבוססי קנה שורש אגרובקטריום

הפרוטוקול מתאר השראת שורשים שעירים באמצעות גבעולי תפרחת ראשוניים Arabidopsis והיפוקוטיל Brassica napus . ניתן לגדל את השורשים השעירים ולהשתמש בהם כצמחים להתחדשות צמחים טרנסגניים.

טרנספורמציה והתחדשות של שורשים שעירים ב-Arabidopsis thaliana וב-Brassica napus

למד ליצור וקטורי CRISPR וליצור מוטנטים של שורשי עגבניות שעירים לחקר גנומי פונקציונלי. שיטה זו מאפשרת בניית מספר וקטורים בשלב אחד ומייעלת את יצירת המוטנטים.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

גלה סרטונים נוספים