גומל אור מיקרוסקופי אלקטרונים ללמוד microglial אינטראקציות עם הפלאק β-עמילואיד

מאמר זה מתאר פרוטוקול המאפשר הדמיה פלאק Aβ עמילואיד בעכברי מודל למחלת אלצהיימר באמצעות methoxy-X04, אשר חוצה את מחסום הדם-מוח סלקטיבי נקשר בטא קפלים גליונות נמצא הפלאק Aβ ליבה צפופה. זה מאפשר הקרנת טרום סעיפים רקמה המכילה פלאק לפני immunostaining ועיבוד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות פלאק בטא-עמילואיד בקטעי מוח ממודלים של עכברים של מחלת אלצהיימר לפני הטמעה מוקדמת של צביעה חיסונית ועיבוד רקמות למיקרוסקופ אלקטרונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירואימונולוגיה כגון האינטראקציה של תא מיקרוגליה עם הסינפסה ליד חלקות בטא עמילואיד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לסנן מראש קטעי רקמת מוח המכילים חלקות בטא עמילואיד באזורים ובשכבות המעניינות.

למרות שניתן ליישם שיטה זו על מחלת אלצהיימר, ניתן ליישם אותה גם על כל מחלה או רקמות אחרות שבהן קיימת עמילואידוזיס. ראשית, הכינו תמיסה של חמישה מיליגרם למיליליטר של תרכובת מתוקסי X04. בעזרת איזון מירקו, שקלו חמישה מיליגרם של מתוקסי X04.

מתחת למכסה אדים, ממיסים את המתוקסי X04 ב-100 מיקרוליטר DMSO ומערבבים עד לקבלת תמיסה צלולה וירקרקה. מוסיפים ברציפות 450 מיקרוליטר פרופילן גליקול ו-450 מיקרוליטר מלח פוספט תוך כדי ערבוב. המשיכו לערבב את התמיסה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת יש לראות תחליב ירוק-צהבהב. לאחר הזרקת מתוקסי X04, יש להוסיף מינון של 10 מיליגרם לק"ג משקל גוף ולהקריב את החיה בנקודת הזמן הרצויה על פי השיטות המאושרות, לשטוף את המוח הקבוע של פרה אורמלדהיד שלוש פעמים עם PBS צונן. לאחר מכן, בעזרת סכין גילוח חד, הסר את נורת הריח וחתך את המוח באופן עטרתי לשתיים עד שלוש חתיכות בגובה שווה בערך, שאת כולן ניתן לחתוך בו זמנית על מנת להאיץ את ההליך.

הדביקו את חתיכות רקמת המוח על צלחת הדגימה המאובטחת במגש. ודא שהמשטח החתוך החלק נדבק היטב לצלחת הדגימה. הוסיפו תמיסת PBS למגש עד שכל פני המוח שקועים לחלוטין.

הנח את המגש בוויברטום והתאם את הגדרות הוויברטום כך שיניב חלקים בעובי 50 מיקרון. התחל לחתוך, ואם הסינון העביר מיד את החלקים ל-PBS באמצעות מברשת עדינה. לחלופין, ניתן להניח חלקים בבקבוקוני זכוכית המכילים תמיסה מוגנת בהקפאה לאחסון בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.

בעזרת אטלס מוח של עכבר סטריאוטקסי, בחר קטעי מוח המכילים את אזור העניין ומקם כל חלק בחומר קריופרוטקטנט בבאר של צלחת תרבית של 24 בארות. לאחר מכן, השתמש בפיפטה חד פעמית כדי להוסיף טיפה של PBS על שקופית מיקרוסקופ ולאחר מכן הנח את החלק על הטיפה. בדוק את הקטע תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות אזורים המכילים מתוקסי X04 המסומנים בפלאק a-beta.

מבלי להזיז את שלב המיקרוסקופ, צלם תמונות של אזורי העניין בשדה בהיר כמו גם במצב פלואורסצנטי. כל תמונה חייבת להראות את אותו אזור בשני השדות כדי לתאם את הפלאק לאזור המבני של קטע הרקמה. שמור ותן שם לתמונות שצולמו בהתאם למספר החיה.

רשום גם את מספר הבאר בצלחת ואת שדה התמונות שצולמו. הנח את החלק בחזרה לבאר המיועדת לאחר השלמת ההדמיה. בדוק את החלק הבא ברצף באמצעות אותו הליך כדי למנוע ייבוש החלקים.

כדי ליישר את התמונות, פתח את תמונות השדה הבהיר ושדה ה-UV עבור אותו החזר ROI ב-ImageJ. לאחר מכן, השתמש בתוסף MosaicJ כדי ליישר את הקצוות של שתי התמונות. שמור את התמונה המיושרת והמשולבת לפי מספר הבאר בתיקיה עם מספר החיה המסוימת.

שלב את התמונות מחלקים שונים של אותה חיה כדי לזהות ולמקם את הלוחות באזור העניין. לאחר השלמת תהליך הסינון, אחסן את החלקים הנבדקים ב-20 מעלות צלזיוס היא צלחת תרבית בת 24 בארות המכילה קריופרוטקטנט עד לביצוע צביעה חיסונית או עיבוד נוסף. ראשית, הכינו תמיסת טטרוקסיד אוסמיום 1% במאגר פוספט בבקבוקון זכוכית.

מכיוון שטטרוקסיד אוסמיום רגיש לאור, יש לכסות את בקבוקון הזכוכית בנייר אלומיניום כדי להגן על התמיסה מפני אור. לאחר שטיפה במאגר פוספטים, הסר את המאגר מהחלקים ופזר אותם שטוחים בעזרת מברשת עדינה. הקפד לשטח את החלקים מיד לפני הוספת טטרוקסיד אוסמיום מכיוון שכל קפלים בחלקים יהפכו לקבועים וניסיון לשטח רקמות לאחר קיבוע אוסמיום רק ישבור את החלקים.

השתמש בפיפטה העברה כדי להוסיף אוסמיום טטרוקסיד לחלקים טיפה אחת בכל פעם עד שהקטע טובל. מכסים את הבאר בנייר אלומיניום כדי להגן על החלקים מפני אור ודוגרים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה הזו הכינו שרף פלסטיק בכוס חד פעמית.

מערבבים את הרכיבים יחד לפי הסדר ומערבבים היטב בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר עד לקבלת צבע אחיד. מעבירים את התערובת המוכנה לכלי שקילה מאלומיניום. אלה יקבלו את חלקי הרקמה לאחר התייבשותם.

לאחר שחלף זמן הדגירה, ייבשו את החלקים בריכוזים הולכים וגדלים של אתנול למשך שתי דקות כל אחד. העבירו את החלקים המיובשים מצלחת התרבות בת 24 הבארות לבקבוקוני זכוכית של 20 מיליליטר. לאחר מכן טבלו את החלקים בתחמוצת פרופילן שלוש פעמים למשך שתי דקות בכל פעם כדי להסיר שאריות אתנול.

לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה מזכוכית כפופה או במברשת צבע עדינה כדי להעביר את החלקים מתמיסת תחמוצת הפרופילן לשרף הפלסטיק ולהשאיר למשך הלילה לחדירה בטמפרטורת החדר. לאחר החדירה, הכניסו את כלי השקילה מאלומיניום המכילים את הדגימות לתנור של 50 עד 60 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. כדי להטמיע קטעים על יריעות סרט פוליכלורוטריפלואורואתילן, השתמש תחילה במברשת צבע עדינה כדי לצבוע שכבה דקה של שרף על הקטע.

לאחר מכן, העבר קטע אחד של רקמה בכל פעם מצלחת שקילה מאלומיניום ליריעת הסרט PCTFE. הסר עודפי שרף מסביב לרקמה, היזהר לא להפריע לו. לאחר העברת כל החלקים מצלחת שקילה אחת ליריעת הסרט PCTFE, הניחו יריעת PCTFE שנייה מעל הראשונה וצרו כריך של רקמה ושרף בין שני הסדינים.

פילמרו את השרף בחממה למשך שלושה ימים בטמפרטורה של 55 עד 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הרקמה מוכנה לחתך אולטרה-דק ולבדיקה אולטרה-מבנית. התמונות הבאות מציגות הדמיה כפולה של קטע היפוקמפוס אחד באמצעות מצבי שדה בהיר ופלואורסצנטי.

האזורים ושכבות העניין מוצגים תחת שדה בהיר. בעוד שלוחות ה-a-beta ממוקמים בהצלחה באמצעות מסנן UV בטווח של 340 עד 380 ננומטר. תמונה זו מציגה קטע היפוקמפוס לפני הטמעה מוקדמת של צביעה חיסונית עבור IBA1.

לוחית גלויה מתוארת על ידי הקו המקווקו. תמונה זו מציגה את אותו קטע לאחר הטמעה מוקדמת של צביעה חיסונית עבור IBA1 ועיבוד למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. שימו לב שהפלאק המוקף בקו מקווקו עדיין נראה בעת עיבוד רקמות למיקרוסקופ אלקטרונים.

לאחר שליטה, ניתן להשלים פרוטוקול זה תוך שבוע אחד אם הוא מבוצע כראוי. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי כל צעד חייב להיעשות בקפדנות כדי להפחית את ההסתברות לזיהום ושחיקה מבנית אחרת שתשפיע על איכות הדגימות. אל תשכח שעבודה עם אוסמיום עלולה להיות מסוכנת ביותר ולכן עליך תמיד לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת מעיל מעבדה וכפפות בזמן ביצוע הליך זה.

הקפד להשליך לאחר השימוש בסוף הניסוי בהתאם להנחיות המתקן שלך.