אפיון תכונות מכאניות Multiscale של רקמת המוח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, שפעת זחה, ו Rheometry

המטרה הכוללת של טכניקות אפיון מכני אלו היא למדוד את התכונות הוויסקו-אלסטיות של רקמה ביולוגית בסבילי מימדים שונים ובקצבי העמסה שונים. ניתן להשתמש בשיטות אלו כדי לענות על שאלות מפתח בהנדסה ביולוגית. לדוגמה, כיצד המוח מעוות תחת קצבי העמסה גבוהים מאוד, או כיצד מחלות כמו טרשת נפוצה או אוטיזם משפיעות על התכונות המכניות של רקמת המוח.

היתרון המרכזי של טכניקות אלו הוא עבור חומרים בעלי קשיחות נמוכה מאוד ומידת הידרציה גבוהה מאוד, כגון רקמה ביולוגית; ניתן לבחון אותם תחת מגוון רחב של תנאי העמסה, וכן לבחון מגוון רחב של נפחי חומר, החל מרמה של תא בודד ועד לרמה של מוח שלם. המשמעויות של טכניקות אלו נשתרעות עד למידול התגובה של המוח במהלך פגיעה, דבר החשוב לתכנון אסטרטגיות הגנה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובבנות לגבי התכונות המכניות של המוח, ניתן להחילה אותה גם על רקמות ביולוגיות גמישות אחרות, כגון הלב והכבד.

במהלך האפיון המכני של רקמות גמישות, קביעת מגע הולם בין גשש המדידה לרקמה היא קריטית. טענו בזהירות למחזיק הגשש גשש AFM בעל קבוע קפיץ נומינלי של 0.03 newtons per meter וחרוז בורוסיליקט בקוטר 20 micrometer. הניחו פרוסת מוח המותקנת בצלחת פטרי על גבי מחמם המותקן על במה של AFM, אשר חומם מראש ל-37 degrees celsius.

לאחר מכן, הוסיפו כ-two milliliters של מדיום שחומם מראש. בשלב הבא, הוסיפו בזהירות טיפה של מדיום על גשושית ה-AFM כדי להגן עליה משבירה עקב מתח פשטי בעת הורדתה אל המדיום הסובב את פרוסת המוח. לאחר מכן, החזירו את ראש ה-AFM למקומו על הבמה, והתחילו להוריד את הראש עד שיהיה טבול במדיום.

באמצעות המיקרוסקופ האופטי, הזזו את השולחן כך שסביבת העניין תהיה מתחת לחוד ה-AFM המכויל, ולאחר מכן הורידו את חוד ה-AFM עד למגע עם פני הרקמה. על מנת לבצע את ניסויי הציות לזחילה (creep compliance), הגדירו פונקציית כוח מופעל בעורך הפונקציות של התוכנה. הפונקציה מורכבת מעלייה הדרגתית (ramp) של 0.1 שניות עד לנקודת יעד (set point) של 5 nanonewton, שנשמרת למשך 20 שניות, ולאחריה ירידה הדרגתית של שנייה אחת עד לאפס nanonewton.

התוכנה תתעד נתונים על חדירת גשושית ה-AFM אל תוך הרקמה במהלך פונקציית הכוח המופעל. לאחר הרצת ניסוי של פתיית זחילה (creep compliance), בצע ניסויי הרפיית כוח על ידי יצירת פונקציית חדירה מופעלת בתוכנה. הרץ פונקציה זו בעוד התוכנה אוספת נתונים על הכוח שחווה גשושית ה-AFM בעת חדירתה אל תוך הרקמה.

כדי להתחיל את בדיקות ההחתרה באימפקט (impact indentation tests), התאימו גשש כדורי על ידי החלקתו על המטוטלת באמצעות פינצטה. לאחר מכן, חברו את מוט דגימת הקוורץ המותך ללוח והבריגו את הלוח אל הבמה התרגלית (translational stage). כדי לאפשר ניסויי אימפקט דינמיים על רקמות מוח הידרטריות, בצעו תחילה את כיול תא הנוזל.

עברו לתפריט כיול (Calibration) בתוכנה, בחרו בתא נוזלי (Liquid Cell) ועקבו אחר הנחיות התוכנה כדי ליצור מגע עם דגימת הקוורץ המותה. לאחר מכן, בחרו ב"SNormal" עבור סוג המזהה (Indenter Type), והשתמשו בערך ברירת המחדל של 0.05 millinewtons עבור עומס המזהה (Indenter Load). לאחר מכן לחצו על "המשך" (continue) כדי לבצע את הכיול עבור תצורת המזהה הנורמלית.

כעת העבירו את במת הדגימה לאחור בלפחות חמישה מילימטרים והרכיבו את זרוע המנוף. חזרו על כיול תא הנוזלים בתצורה החדשה על ידי בחירת Liquid Cell עבור סוג המדחף (indenter). לחצו על Continue כדי לקבל את מקדם כיול תא הנוזלים.

בשלב הבא, הגדילו את המרווח בין לוחות הקבל. הגדלת המרווח בין לוחות הקבל תגדיל את העומק המקסימלי שניתן למדוד, דבר הנחוץ בעת בדיקה של חומרים בעלי גמישות גבוהה. בעזרת מפתח ברגים, סובבו עם השעון במרווחים קטנים את שלושת האומים השולטים על המרווח בין לוחות הקבל.

לאחר כל סיבוב מלא עם כיוון השעון, בחרו ב-Bridge Box Adjustment תחת תפריט ה-Maintenance ובצעו בדיקת מטוטלת (pendulum test) תקינה. המשיכו לכוון את האומים באיטיות עד שערך ה-Approx. Depth Calibration יהיה 70,000 nanometers per volt או גבוה יותר.

לאחר מכן, מקמו מעצור גבול חדש בתחתית המטוטלת שניתן להפעיל ולכבות באמצעות ספק כוח. הסירו את מעצור הגבול המקורי השבוע מאחורי המטוטלת כדי להסיר חסימה פוטנציאלית של תנועת המטוטלת ולאפשר מהירויות פגיעה גבוהות יותר וכן עומקי חדירה גדולים יותר לדגימות גמישות. הפעילו את ספק הכוח עבור הסולנואיד וכוון אותו ל-10 volts.

לאחר מכן, עבור לתפריט Experiment ובחר ב-Impact and Adjust Impulse Displacement. פעל לפי הנחיות התוכנה כדי לכוון את מרחק התנודה של המטוטלת. כאשר הגדרת חרירי ההשפעה הושלמה במלואה, שאב את המדיום ויבש את פרוסת המוח.

לאחר מכן, השתמש בשכבה דקה של דבק ציאנואקרילט כדי לקבע את נתחי המוח לעמוד הדגימה מאלומיניום. לאחר מכן, החלק את תא הנוזלים מעל טבעת ה-O השנייה שעל עמוד הדגימה, ומלא את תא הנוזלים ב-five milliliters של מצע שאינו תלוי carbon-dioxide כדי להטביע את הרקמה באופן מלא. הזז את האמבט בכיוון X השלילי עד שקצה זרוע המנוף ימוקם כראוי מעל האמבט.

בשלב הבא, נעו בכיוון Z החיובי עד שהחוד יהיה טבול לחלוטין באמבט ויניח מול הדגימה. באמצעות חלון בקרת במה הדגימה (Sample Stage Control), צרו מגע בזהירות, ולאחר מכן הסיטו את הבמה מהרחקה של כ-30 micrometers מפני שטח הדגימה. בתפריט הניסוי (Experiment), לחצו על פגיעה (Impact) והגדירו ניסוי פגיעה.

בחרו עומס דחף ספציפי שיהיה קשור באופן ישיר למהירות הפגיעה הנובעת מכיול מרחק התנודה. לאחר מכן, הריצו את הניסוי המתוכנן. כאשר המטוטלת נעה חזרה ופני השטח של הדגימה ממשיכים לנוע לעבר מישור המדידה, כבו את מפסק הגבול התחתון.

התוכנה תתעד את תזוזת הגשוש כפונקציה של הזמן. הדביקו נייר זכוכית לגשוש המדידה בקוטר 25 מילימטר. לאחר מכן, חברו את המערכת התרמית והתקינו את הגשוש.

לבסוף, הדבק פיסת נייר זכוכית נוספת לפלטה התחתונה, כך שתהיה מיושרת עם הפלטה העליונה. כייל את הרהאומטר לפי הוראות היצרן. ראשית, אפס את הכוח על הגשושית.

שנית, צרו מגע בין הגשושית ללוח התחתון. לאחר מכן, מדדו את האינרציה של הגשושית. לבסוף, בצעו כיול של המנוע.

לאחר מכן, הורד lang="he" באיטיות את לוח המדידה. כאשר הלוח נמצא במרחק של מילימטר מהרקמה, הורד אותו במרווחים של 0.1 מילימטר עד שהלוח יהיה במגע מלא עם פני השטח העליונים של הרקמה והכוח הנורמלי הנמדד יהיה בערך הרצוי. טפטף כמות קטנה של מדיום לשולי הדגימה כדי לשמור על הידרציה במהלך ההליך.

הורד את מכסה הבידוד התרמי. לאחר מכן, לחץ על File, New, ובלשונית Gel בחר ב-Frequency Sweep. לאחר מכן, לחץ על window measurement one frequency sweep ולחץ פעמיים על תיבת האוסילציה (oscillation box).

הזינו את טווח התדרים, הזן, ומספר הנקודות. לבסוף, בחרו ב-OK ולחצו על Start כדי להתחיל את סריקת התדרים. להלן תגובות מייצגות של שקיעה וכוח כפונקציה של זמן עבור ניסויי צמיגות זחילה והרפיית כוח.

באמצעות נתונים אלו וגאומטריית המערכת, ניתן לחשב את תאיות הזחילה (creep compliance) ואת מודולי הרפיית הכוח עבור אזורים שונים במוח. הזחה באימפקט (Impact indentation) מודדת את התכונות המכניות של הרקמה בקצבים גבוהים של עומס מרוכז מרחבית וזמנית. ניתן לכמת את פרמטרי תגובת האימפקט הנובעים מכך במהירויות אימפקט שונות, מה שמהווה אמצעי לבחינת התכונות התלויות-קצב של הרקמה.

ריאולוגיה מודדת את התכונות הוויסקו-אלסטיות התלויות בתדר של רקמה במסה, במונחים של מודולי האגירה והאיבדוד. מודול האגירה גדול כמעט בסדר גודל אחד ממודול האיבדוד בתדרים נמוכים, מה שמעיד על כך שתכונות אלסטיות הן הדומיננטיות בהתנהגות של רקמת מוח. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על הרקמה הידרטציה נאותה או להטביעה בנוזל המסייע לרקמה לשמור על מבנהה התקין.

פיתוחן של טכניקות מוכחות אלו סלל את הדרך לחוקרי חומרים לתכנן ולבצע אופטימיזציה של ג'לים סינתטיים שיכולים לחקות את התגובה המכנית של המוח. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו בדיקת שקיעה (indentation) באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, בדיקת שקיעה עקב אימפקט וריאולוגיה משמשים לאפיון התכונות המכניות הוויסקו-אלסטיות של רקמה. בעת פרשנות הנתונים שנאספו, זכרו את ההנחה הבסיסית לפיה הנפח המעוות של הרקמה הוא הומוגני מבחינה מבנית ואיזוטרופי מבחינה אלסטית.

דבר זה אינו נכון בהכרח עבור כל הרקמות הביולוגיות. ככל שהשאלות שלכם בנוגע למכניקה של רקמות ביולוגיות יגבשו הגדרה מדויקת יותר, תוכלו לבחור באחד או יותר מהניסויים המכניים הללו כדי לענות על השאלה בקנה המידה המרחבי או בלוח הזמנים הרלוונטיים.