מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד את המודול האלסטי של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע מדידות ספקטרוסקופיה של כוח ב-FM במיקומים שונים על התא. כשלב שני, כל עקומת כוח-מרחק מנותחת כדי לקבוע את הנקודה שבה קצה ה-FM יוצר מגע ראשוני עם התא.

בשלב הבא, החל מנקודת המגע, נתוני ההחדרה של 200 עד 300 הננומטרים הראשונים מותאמים למודל ה-hertz. על מנת לחלץ את מודול האלסטיות, התוצאות מניבות מפה דו-ממדית של קשיחות התא המתקבלת באמצעות מצב מיפוי כוח (force mapping mode), שבו כל פיקסל מייצג עקומה בודדת של כוח מול מרחק. את הפרוצדורה תדגים גוئن תומס, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, נקו את מחזיק הקנטילבר ב-70% ethanol והמתינו לייבושו.

לאחר מכן, טען קנטילבר bru DNP 10 לתוך ה-AFM בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, כייל את רגישות המנוף האופטי ההפוך. פרמטר זה מתאר את עוצמת התגובה של הפוטודיודה בוולטים לכל ננומטר של סטיית הקנטילבר.

כדי לבצע זאת, טענו תחילה זכוכית נקייה על משטח הדגימה. התקינו ראש AFM וכווננו את קרן הלייזר והיישור בהתאם להוראות היצרן. לאחר היישור, הבאיאו את קצה ה-AFM למגע עם הזכוכית כאשר ה-P80 נסוג.

כוונן מחדש את המראה עד לקריאה של מינוס שני וולט בפוטודיודה. לאחר מכן, בצע מדידת ספקטרוסקופיית כוח עם תגובת פוטודיודה מקסימלית או נקודת טריגר של פלוס שני וולט. לאחר השלמת איסוף הנתונים, בצע זום לאזור המגע ההדוק של עקומת הכוח ובצע התאמה לינארית לאזור זה.

כדי למצוא את השיפוע בוולטים לננומטר, יש לאפס את יישור המראה כך שהסטיה החופשית תהיה אפס וולטים. לאחר מכן, יש לכייל את קבוע הקפיץ של הקנטילבר באמצעות שיטת הכוונון התרמי (thermal tune) כפי שתיארו levy ו-Malam. כדי להתחיל, הרם את הסורק הרחק מבמת הדגימה כך שלא תהיה אינטראקציה בין הקצה לדגימה.

לאחר מכן, לכדו את הנתונים התרמיים על ידי הקלטה של הרעידה התרמית של זרוע הקנטילבר. תוכנת ה-AFM מנתחת ספקטרום הספק של רעידה תרמית זו ומציגה אותו בחלון נתונים. לאחר מכן, בצעו התאמה (fit) למקטע הנתונים הממוקם במרכז התדר הנמוך ביותר, המכונה גם שיא התהודה היסודי, כדי לקבוע את קבוע הקפיץ.

על מנת להכין את ה-a FM עבור פלטות התרבית, התקינו אביזר חימום של צלחת על במה של ה-a FM והגדירו את הטמפרטורה ל-37 °C. המתינו 20 דקות עד שהמערכת תגיע לשיווי משקל תרמי יציב. לאחר החימום המקדים, הניחו צלחת תרבית על במה של ה-a FM ואבטחו אותה באמצעות התפסן המצורף למחמם הצלחת; עבור מדידות העולות על 30 דקות, יש להשתמש במצע שאינו תלוי בפחמן דו-חמצני במקום במצע התרבית הרגיל.

בשלב הבא, הנח טיפה קטנה של מצע גידול בטמפרטורה של 37 degrees Celsius על קצה הקנטילבר של ה-AFM והורד את ראש ה-AFM עד שהקצה שקוע במעט בנוזל. באמצעות מצלמת CCD במבט על, כוון מחדש את קרן הלייזר על הקנטילבר. הכיוון בנוזל יהיה שונה מאשר באוויר בשל השינוי במקדם השבירה של המצע.

לאחר היישור, הצמידו את קצה ה-A FM לאזור נטול תאים בצלחת התרבית ובצעו כיול של רגישות מנוף האור ההפוך (inverse optical lever sensitivity) בסביבה הנוזלית. כדי להתחיל במדידות של תכונות מכניות של תאים, מקמו את קצה הקנטילבר מעל אזור עינית הפנינה (perle eye) של תא בעזרת מיקרוסקופ אופטי. התאמות מדויקות של מיקום הקנטילבר מתבצעות על ידי החלת היסטים (offsets) לסורקי ה-X וה-Y.

לאחר מכן, העבר את ה-FM למצב ספקטרוסקופיה של ארבעה נקודות והגדר את קצב ההחדרה ל-5 µm/s, קצב נמוך מספיק כדי למנוע השפעות הידרודינמיות. לאחר מכן, הגדר את נקודת הטריגר של הסטייה ל-2 nN. כדי למנוע נזק לתאים, התאם ערך זה בהתאם לקשיחות הדגימה.

בנוסף, בחרו באפשרות ההפעלה היחסית (relative triggering), אשר תתקן כל סחף באות ההסטה. לאחר מכן, הגדירו את מרחק הכוח לחמישה µm כדי להבטיח שהחוד יהיה מנותק לחלוטין מהתא בין מדידות הכוח. אספו שלושה עקומות כוח במיקומים שונים באזור הגרעין של לפחות 30 תאים עבור כל תנאי.

למרות שמומלץ להפיק מספר עקומות מכל תא, לצורך קבלת נתונים סטטיסטיים מהימנים, איסוף רב מדי של עקומות עלול להוביל לשינויים בנוקשות התא כתוצאה מעקה הנגרם על ידי גשושית ה-AFM. ניתן לאפיין באופן מעמיק יותר את התפלגות התכונות המכניות לאורך תא בודד באמצעות מצב מיפוי כוחות (force map mode).

במצב מיפוי כוחות, הגדירו את גודל הסריקה ל-30 micrometers ואת הרזולוציה ל-32 על 32; פרמטרי ההחדרה הם אותם פרמטרים שנבחרו עבור עקומות כוח בודדות. ה-A FM יבצע לאחר מכן מדידות של עקומות כוח בודדות בכל פיקסל באזור הדגימה ויספק מפת קשיחות של האזור כולו. לאחר מכן, נתחו את עקומות הכוח שהוקלטו באמצעות MATLAB כדי לחשב את קשיחות התא.

התחילו באימוץ אלגוריתם שפורסם לראשונה על ידי Lynette Al, המחשב התאמה ליניארית והתאמת הרץ (hertz fit) מכל נקודה באמצעות matlab. חשבו את שגיאת ה-RMS היחסית של שתי ההתאמות וסכמו ערכים אלו בכל נקודה. הנקודה שבה מושגת שגיאת ההתאמה הכוללת המינימלית תיבחר כנקודת המגע הראשונית; איתור נקודה זו הוא קריטי למדידה מדויקת של מודול יאנג (young's modulus) של התאים.

בשלב הבא, חשבו את דלתת דפורמציית הדגימה. השתמשו במשוואות הבאות, כאשר הדפורמציה שווה לאפס לפני המגע עם התא (כאשר Z קטן מ-Z zero), והיא שווה להפרש בין סטיית הקנטילבר D לבין המרחק הכולל Z מעבר לנקודת המגע. לאחר מכן, חשבו את כוח ההחדרה F באמצעות המשוואות הבאות, כאשר הכוח שווה לאפס לפני המגע עם התא (כאשר Z קטן מ-Z zero), והוא שווה למכפלת קבוע הקפיץ K של הקנטילבר בסטיית הקנטילבר מעבר לנקודת המגע.

התאמה לפי ריבוע אליס (Elise square) מיושמת לאחר מכן על נתוני דפורמציית הדגימה מול כוח ההחדרה באזור שלאחר המגע של מודל ה-hertz, וזאת כדי להוציא את מודול יאנג של התא בהתבסס על צורת הקצה שנעשה בו שימוש כפי שמוצג. להלן עקומות כוח מייצגות שנלקחו משלושה תאי פיברובלסט מסוג T3 שגודלו על שלושה משטחים שונים. כפי שניתן לראות כאן, משטחים שונים עשויים להשפיע רבות על קשיחות שלד התא.

העיוות הממוצע של תאים שגודלו על משטח פלסטיק קשיח מוצג באדום. תאים שגודלו על ג'ל פולי-אקרילאמיד קשיח מוצגים בסגול, ואלו שגודלו על ג'ל פולי-אקרילאמיד אלסטי מוצגים בכחול. לאחר זיהוי מדויק של נקודות המגע בעקומות, ניתן להציג באופן מדויק את כוחות ההחדרה כפונקציה של עיוות התא.

בנוסף, ניתן לחשב במדויק את מודול יאנג (Young's modulus) שלהם מתוך 300 הננומטרים הראשונים של ההחדרה לאחר המגע. מוצג כאן פיברובלסט שעבר טרנספקציה של menton המסומן בחלבון פלואורסצנטי ירוק, סוג של פילמנט ביניים. ככל שהתמונה בהירה יותר, כך כמות ה-menton באותו אזור גדולה יותר.

דבר זה עשוי להיות קשור לנוקשות של שלד התא. באמצעות טכניקת מיפוי הכוחות של ה-AFM המוצגת כאן, ניתן להראות מפת נוקשות דומה של פיברובלסט ברזולוציה של 32 על 32 פיקסלים, כאשר כל פיקסל מייצג שטח פנים של התא בגודל 2.5 על 2.5 מיקרון. לאחר צפייה בסרטון זה, יהיה לכם מושג טוב כיצד להשתמש במיקרוסקופיית כוח אטומי כדי למדוד את הגמישות של תאי רקמה חיים.