מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד את המודול האלסטי של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. זה מושג על ידי ביצוע תחילה של מדידות ספקטרוסקופיה של כוח FM במקומות שונים בתא. כשלב שני, כל עקומת מרחק מאולץ מנותחת כדי לקבוע את הנקודה שבה קצה ה- FM יוצר קשר ראשוני עם התא.

לאחר מכן, החל מנקודת המגע, 200 עד 300 הננומטר הראשונים של נתוני הכניסה מותאמים למודל הרץ. על מנת לחלץ את המודול האלסטי, התוצאות מניבות מפה דו-ממדית של נוקשות התא המתקבלת על ידי שימוש במצב מיפוי הכוח שבו כל פיקסל מייצג עקומת מרחק מאולץ אחת מדגים את ההליך גואן תומאס, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, נקה את מחזיק השלוחה עם אתנול 70% ואפשר לו להתייבש.

לאחר מכן טען שלוחה bru DNP 10 לתוך ה-A FM בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, כייל את רגישות הידית האופטית ההפוכה. פרמטר זה מתאר את כמות תגובת הפוטו-דיודה בוולט לננומטר של סטיית שלוחה.

כדי להשיג זאת, טען תחילה שקופית זכוכית נקייה על המדגםtagה. התקן את ראש ה-FM והתאם את קרן הלייזר והיישור בהתאם להוראות היצרן. לאחר היישור, הפעל את קצה ה-A FM על מגלשת הזכוכית כשה-P שמונה O נסוג.

יישר מחדש את המראה לקריאת דיודת צילום של שני וולט שלילי. לאחר מכן בצע מדידת ספקטרוסקופיה של כוח עם תגובת דיודת צילום מקסימלית או נקודת טריגר של שני וולט חיוביים. לאחר השלמת רכישת הנתונים, התקרב לאזור המגע המוצק של עקומת הכוח ובצע התאמה ליניארית לאזור זה.

כדי למצוא את השיפוע בוולט לננומטר, אפס את יישור המראה לסטייה חופשית של אפס וולט. לאחר מכן, כייל את קבוע קפיץ השלוחה בשיטת הכיוון התרמי המתוארת על ידי לוי ומלם. כדי להתחיל, הרם את הסורק הרחק מהדגימהtagה כך שלא יהיו אינטראקציות בין הקצה לדגימה.

לאחר מכן לכוד את הנתונים התרמיים על ידי הקלטת הרטט התרמי של קרן השלוחה. תוכנת A FM מנתחת ספקטרום הספק של רטט תרמי כזה ומתווה אותו בחלון נתונים. לאחר מכן, בצע התאמה לפלח הנתונים הממורכז בתדר הנמוך ביותר, המכונה גם שיא התהודה הבסיסי כדי לקבוע את קבוע הקפיץ.

על מנת להכין את ה- FM לצלחות התרבות, התקן אביזר לחימום כלים על במת FM והגדר את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. המתן 20 דקות עד שהמערכת תגיע לשיווי משקל תרמי יציב. לאחר חימום מראש, הניחו צלחת תרבות על במת FM ואבטחו אותה באמצעות המהדק המסופק עם מחמם הכלים למדידות ארוכות מ -30 דקות, יש להשתמש במדיום עצמאי של פחמן דו חמצני כדי להחליף את מדיום התרבות הרגיל.

לאחר מכן, מרחו טיפה קטנה של מדיום תרבית של 37 מעלות צלזיוס על קצה שלוחת ה-A FM והורידו את ראש ה-FM עד שהקצה פשוט שקוע בנוזל. באמצעות למעלה view מצלמת CCD יישר מחדש את קרן הלייזר על השלוחה. היישור בנוזל יהיה שונה מאוויר בגלל השינוי במקדם השבירה של המדיום.

לאחר היישור, הפעל את קצה ה-A FM על אזור נטול תאים בצלחת התרבות ובצע כיול של רגישות המנוף האופטי ההפוך בסביבה הנוזלית. כדי להתחיל במדידות תכונות מכניות של תאים, מקם את קצה השלוחה מעל אזור עין פרל של תא בעזרת מיקרוסקופ אופטי. התאמות מדויקות של מיקום השלוחים מתבצעות על ידי החלת היסטים על סורקי X ו-Y.

לאחר מכן העבר את ה-FM למצב ספקטרוסקופיה ארבע והגדר את קצב הכניסה לחמישה מיקרומטר לשנייה, שהוא נמוך מספיק כדי למנוע השפעות הידרודינמיות. לאחר מכן, הגדר את נקודת ההדק של הסטייה לשני ננו ניוטון. על מנת להימנע מפגיעה בתאים, התאם ערך זה בהתאם לקשיחות המדגם.

בנוסף, בחר באפשרות ההפעלה היחסית, שתתקן כל סחיפה באות ההסטה. לאחר מכן הגדר את מרחק הכוח לחמישה מיקרומטר כדי להבטיח שהקצה ינותק לחלוטין מהתא בין מדידות הכוח. אסוף שלוש עקומות כוח במיקומים שונים באזור הגרעינים של לפחות 30 תאים עבור כל מצב.

למרות שזה מועיל לקחת עקומות מרובות על כל תא. עבור נתונים סטטיסטיים אמינים, נטילת יותר מדי עלולה להוביל לשינויים בנוקשות התאים למצוקה מבדיקת A FM. לאפיין עוד יותר את התפלגות התכונות המכניות על פני תא בודד באמצעות מצב מפת כוח.

במצב מפת כוח, הגדר את גודל הסריקה ל-30 מיקרומטר את הרזולוציה ל-32 על 32, ופרמטרי הכניסה זהים לאלה שנבחרו עבור עקומות כוח בודדות. לאחר מכן, ה-A FM ייקח עקומות כוח בודדות בכל פיקסל באזור הדגימה ויספק מפת קשיחות של האזור כולו. לאחר מכן, נתח את עקומות הכוח המוקלטות באמצעות MATLAB כדי לחשב את קשיחות התא.

התחל באימוץ אלגוריתם שפורסם לראשונה על ידי לינט אל, שמחשב גם התאמה ליניארית וגם התאמה של הרץ מכל נקודה באמצעות matlab. חשב את שגיאת ה-RMS היחסית של שתי ההתאמות וסכם את הערכים הללו בכל נקודה. הנקודה שמשיג את שגיאת ההתאמה הכוללת המינימלית נבחרת כנקודת המגע הראשונית המאתרת נקודה זו חיונית למדידה מדויקת של מודול התאים הצעירים.

לאחר מכן, חשב את דלתא העיוות של הדגימה. שימוש במשוואות הבאות עם העיוות שווה לאפס לפני מגע התא כאשר Z קטן מ- Z אפס ושווה להפרש בין סטיית השלוחה D למרחק הכולל Z מעבר לנקודת המגע. לאחר מכן חשב את כוח הכניסה F באמצעות המשוואות הבאות שבהן הכוח שווה לאפס לפני מגע התא כאשר Z קטן מ-Z אפס ושווה לקבוע הקפיץ K של השלוחה כפול סטיית השלוחה מעבר לנקודת המגע.

לאחר מכן, ההתאמה של אליס ריבוע מוחלת על עיוות הדגימה לעומת נתוני כוח הזחה באזור שלאחר המגע של מודל הרץ על מנת לחלץ את מודול יאנג של התא על סמך צורת הקצה המשמש המוצג. להלן עקומות כוח מייצגות שנלקחו משלושה תאי T, שלושה פיברבלסטים שגודלו על שלושה משטחים שונים. כפי שניתן לראות כאן, משטחים שונים יכולים להשפיע מאוד על נוקשות שלד התא.

העיוות הממוצע של תאים שגודלו על משטח פלסטיק קשיח מוצג באדום. אלה הגדלים על ג'ל פולי אקרילאמיד נוקשה מוצגים בסגול, ואלה הגדלים על ג'ל פולי אקרילאמיד אלסטי מוצגים בכחול. לאחר זיהוי קפדני של נקודות המגע בעקומות, ניתן להציג במדויק את כוחות הכניסה כפונקציה של עיוות תאים.

בנוסף, המודולרי של יאנג שלהם, ניתן לחשב במדויק מ-300 הננומטר הראשונים של הכניסה לאחר מגע. מוצג כאן פיברובלסטים שהועברו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק המתויג מנטון, סוג של חוט ביניים. ככל שהתמונה בהירה יותר, כך יש יותר מנטון באזור זה.

זה יכול להיות קשור לנוקשות של שלד התא. באמצעות טכניקת מיפוי כוח FM המוצגת כאן, ניתן להציג מפת קשיחות דומה של פיברבלסט ברזולוציה של 32 על 32 פיקסלים כאשר כל פיקסל מייצג 2.5 על 2.5 מיקרון משטח התא. לאחר צפייה בסרטון זה, יהיה לו רעיון טוב כיצד להשתמש במיקרוסקופ הכוח האטומי כדי למדוד את האלסטיות של תאי רקמה חיים.