Name: מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: חקור את המכניקה של רקמת הריאה באמצעות מיקרו מכונות אפיון במיקרוסקופ כוח אטומי. שיטה זו מאפשרת למדוד את הקשיחות המקומית ברקמות ריאה נורמליות ופיברוטיות בעכברים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים תג&#39;ר א &#39;וב&#39; שיאה של שיתוף הפעולה המתמשך שלהם, לצורך מתן רקמת הריאה למטרות הדגמה כאן. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק HL-092961. עבודה זו בוצעה כחלק במרכז מערכות ננומטריות (CNS), חבר של רשת ננוטכנולוגיה התשתיות הלאומיות, אשר נתמך על ידי קרן המדע הלאומית תחת הפרס NSF ECS-0335765. CNS היא חלק מהפקולטה למדעים ואמנויות באוניברסיטת הרווארד.

1. רקמת הריאה ברצועת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת ריאות הוא תואם מאוד קשה לחתוך לרצועות לאפיון AFM. Transiently כדי לייצב את מבנה הריאות לחיתוך, לנפח את הריאות עכבר מבודד intratracheally עם משקל 50 מ"ל / ק"ג גוף נמוך של 2% ג'ל נקודת agarose (שהוכנו PBS) חימם עד 37 ° C. עניבה את קנה הנשימה מגניב לריאות מנופח באמבט של PBS על 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. Agarose יהיה ג'ל מתקשח airspaces בעדינות כדי לייצב את מבנה הריאות במהלך ההפסקה הזו 5. ריכוזים גבוהים יותר agarose, 3-4%, כלומר ניתן להשתמש כדי לשפר עוד יותר את ייצוב לחיתוך רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את agarose מיוצב רקמת הריאה עכבר עם סכין או להב סכין המנתחים לרצועות של 5 מ"מ 5 x באורך ורוחב של 400 מיקרומטר עובי, ולאחר מכן לשטוף את רצועות באמבטיה PBS מראש לחמם 37 ° C באמצעות 100 מ"ל כוס זכוכית על צלחת ספסל העליונה מחומם ומערבבים במשך 5 דקות להסיר agarose שיורית. כדי לא לכלול דרכי הנשימה וכלי גדול, חתוך לרצועות subpleural מאזורים רחוקים העיקרית גזע הסמפונות. אם דרכי הנשימה וכלי גדולים להיות צילמו, לחתוך רצועות של רקמת הריאה הפרוקסימלי יותר העיקרית גזע הסמפונות. </li></ol> 2. AFM Microindentation ו דימות פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד תחומי עניין microindentation AFM, רקמה ניתן דמיינו ידי מיקרוסקופ לעומת שלב, או immunostained ו דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עבור immunostaining, לחסום רצועות רקמה עם 5% נסיוב ממקור של הנוגדן משני הרצויה (PBS) עבור 2 שעות ללא קיבוע permeabilization או בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רצועת רקמת עם נוגדן ראשוני מתאים (למשל ארנב נגד קולגן אני לדמיין קולגן ביניים (1:250 דילול), ארנבת אנטי laminin (1:250 דילול) כדי להמחיש קרום במרתף) בבאר צלחת 12-באר על הנדנדה עם רעד עדין במשך שעה 1, לשטוף מדגם 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם PBS, ואחריו נוגדנים משני המתאים מצומדות לתייג ניאון (למשל אלקסה פלואוריד 546 נגד ארנב עז נוגדנים משני (דילול 1:250)) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רצועות רקמה נרחב עם PBS ולאחסן PBS ב -4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני אפיון AFM, לצרף את רצועת רקמות coverslip 15 מ"מ פולי-L-ליזין מצופה על ידי הרמת coverslip מלמטה הרקמה צף, מוודא את רצועת רקמת מתפשט באופן שווה על פני השטח coverslip, במידת הצורך, כריך את הרצועה עם נקי שנייה, ללא ציפוי coverslip ולהפעיל לחץ מתון כדי לסייע עם קובץ מצורף רקמות coverslip poly-L-ליזין מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול מערכת AFM הבאים ההוראה של ייצור מיד לפני כל סיבוב של ניסויים microindentation. קבע שני פרמטרים קריטיים: 1) האביב שלוחה קבוע בשיטה תרמית תנודות באוויר 6; ו, 2) את הרגישות סטיה שלוחה, המהווה פרמטר המשמש הסולם אות פלט photodiode אל המרחק בפועל שלוחה סטיה, Δd. כיול רגישות סטיה ידי השגת עקומת תקן כוח תזוזה ב PBS בשקופית זכוכית נקי ואז לחשב את השיפוע של עקומת כוח העקירה (Fig.1B). במדידה עקירה בכוח את העיקול, קצה AFM מורחב לקראת ואסף מפני השטח מדגם במיקום יחיד (ללא rastering בכיוונים XY), עם סטיה של שלוחה, Δd, פיקוח כפונקציה של עקירה קצה, Δz . </li></ol> אנו ממליצים להשתמש סיליקון ניטריד שלוחה משולש עם 5 מיקרומטר קוטר בורוסיליקט כדורי קצה (Novascan). באמצעות בדיקות AFM עם קפיץ קבוע של 0.06 N / m, יש לנו מאופיין מכנית חומרים רכים עם moduli גזירה פורש 100 עד 50,000 אבא. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את המשטח התחתון של coverslip המדגם בנייר טישו, להדק אותו להחליק כוס שמן רגיל עם ואקום, הר שקופיות הזכוכית על הבמה מדגם AFM, לכסות את הרקמה עם 500 μl PBS (טמפרטורת החדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המיקרוסקופ לצפייה עין חלקים ליישר את קצה AFM במרכז שדה הראייה באמצעות התאמת הבמה מדגם מיקרוסקופ. בחר שטח של הריבית על הרקמה ידי הזזת הבמה מדגם AFM, ולאחר מכן לעבור מצלמת CCD צופה לרשום בניגוד לשלב תמונה ו / או תמונות פלואורסצנציה של הרקמה, כרצונכם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו פעולה סטנדרטי AFM האירוסין ידי הזזת קצה AFM לאט כלפי מטה עד שהוא נמצא בקשר עם המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפיון מדויק AFM microindentation של דגימות רך דורש בעומק הזחה קטנים, כדי למנוע זנים מקומיים גדולים לפסול את המודל הרץ המשמשים לחישוב מודולוס אלסטיות. כדי למנוע זנים גדולים, לבצע הזחה במצב ההדק ידי קביעת מקסימום שלוחה סטיה (נקודת ההדק) עד 500 ננומטר. זה גבול הסטייה יהיה לרסן אתכוח הכניסה המקסימלי פחות מ -30 NN (F = אביב * שלוחה תזוזה מתמדת, או מקסימום F = 0.06 NN / ננומטר * 500 ננומטר = 30 NN). </li></ol> מהירות הכניסה יש לבחור להיות איטי מספיק כדי לחקור אלסטי ולא מאפיינים viscoelastic המדגם רכה 7. טווח מהירות 2-20 מיקרומטר לשניה מתאים רקמת הריאה. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדידה אחת מתוך שטח של עניין, הזיזו את החללית AFM למיקום עניין לבצע הזחה אחת לאסוף עקומת תקן כוח תזוזה (החללית נעה רק בכיוון-Z בלי סריקה XY). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיפוי אוטומטי של אזור של עניין, לעבור למצב כוח-Map, בחר את גודל סריקה נקודות דגימה בתוך האזור הנבחר. במצב כוח, מפה, rasters קצה AFM פני השטח מדגם בין תנועות הכניסה, וגובה הפרט בכוח עקירה עקומות בכל נקודה בתוך רשת מדגם מוגדר. נקודות דיגום עוד יספק רזולוציה מרחבית גבוהה אבל להאריך את משך הזמן הנדרש למיפוי. מצאנו את זה מעשי להשתמש 16 x 16 רשת מדגם למפות 80 x 80 מיקרומטר האזור במהירות הכניסה של 20 מיקרומטר לשניה, כך ניתן להשלים ~ 10 דקות. </li></ol> 3. AFM הפקת נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את מודול יאנג, להתאים את עקומת כוח תזוזה מודל הכניסה הרץ כדורית באמצעות הריבועים הפחותים שאינו ליניארי הולם מתעקל 8 (תמונה 1, ג): <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="משוואה 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="משוואה 1"> היכן F = k ג * Δ ד, הוא הכוח לכופף את שלוחה, k c הוא האביב שלוחה קבועה, R הוא קצה רדיוס כדור, δ = Δ z - Δ ד היא הכניסה ואת υ הוא פואסון של מדגם תפעוליות (υ = 0.4 על רקמת הריאה 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את איכות התאים, לחשב את הערך SSR, או סכום של ריבועים של ההבדל בין הנתונים לבין ערכים מתאימים, במהלך הולם שאינו ליניארי את העיקול. ביטול מדידות אמין או בלתי לפירוש על ידי השלכת נתונים מ עקומות "רע" עם ערכים SSR גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, להמיר אלסטי מודול (E) כדי גזירה מודולוס (G), באמצעות הקשר E = 2 x (1 + υ) x ג'כדי להמחיש דפוסי המרחבי של נוקשות שנאספו במצב כוח, מפה, העלילה נתונים מודול בתוך קונטור מפות (לדוגמא ברשת 16 x 16 מדגם המשתרע על 80 x 80 מיקרומטר שטח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעבד כמות גדולה של נתונים עקומת כוח, אלגוריתם מנהג עשוי להיות כתובה באופן אוטומטי להתאים בכוח עקירה עקומות, תמצית moduli, ו / או elastographs העלילה באמצעות אותם הליכים ופרמטרים כפי שמתואר 3.2 ו -3.3 (כגון Matlab). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1 (א) סכמטי של microindentation AFM מדגם רך על מצע קשיח באמצעות בדיקה כדורית (מחדש עם אישור Dimitriadis א, et al. 2002 Biophys J 8). (ב) נציג בכוח עקירה עקומת שנאספו זכוכית שקופית נקי PBS לקבוע סטיה רגישות שלוחה. (ג) כוח תזוזה עקומות נציג שנאספו (אדום) דגימות רך (כחול) ונוקשה מראה את הפרמטרים המתאימים של (A). 4. נציג תוצאות: איור 2 א מראה parenchyma הריאה מחוברת רצועה על coverslip poly-L-ליזין מצופה PBS עם בדיקה AFM במקום ישירות מעל אזור של אינטרס ומוכן מיפוי microindentation. איור 2B מראה כי ברקמות לחתוך כראוי מוכתם, ארכיטקטורה מכתשיים של הריאה parenchyma נשמר היטב, כפי שנצפה על ידי צביעת immunofluorescent עבור laminin קרום מרכיב במרתף ללא קיבוע או permeabilization. איור 2 CD להראות מכתים immunofluorescent עבור קולגן אני מבולבל בריאות טריים שנקטפו מן העכברים שטופלו בעבר עם PBS (איור 2 ג), או שטופלו bleomycin (איור 2 ד) כדי לגרום סיסטיק 10. איור 3A מראה כוח תזוזה מדגם מגרשים המתקבל microindentation AFM. עם הכוח ליישם אותו, AFM הטיפ יוצרת הזחה גדולה על אזור רך (קו כחול), וכתוצאה מכך יחסית עקומה "שטוח" עקירה בכוח לעומת חריץ קטן "תלול" עקירה בכוח עקומת עבור אזור נוקשה ( הקו האדום). על מנת לקבל את עקומות הכוח נקי, לאחר הכניסה לכל קצה AFM צריך להיות חזר בו לחלוטין מפני השטח מדגם ללא קשר לפני הכניסה הבאה. זו מדינה חופשית מגע מתאים באזור השטוח של העקומה ב איור 3A, שם בקצה מתרגמת ללא סטיה שלוחה. איור 3 ב מציג את עקומת שקר טיפוסי ללא באזור שטוח אשר מתרחשת כאשר קצה לא חזר בו לחלוטין מפני השטח מדגם (מדגם רך לדוגמאttaches אל קצה) כך שלא ניתן לקבוע את נקודת מגע. אם קצה לכוד לגמרי מדגם רך, העקום עשוי להיראות כפי שמוצג באיור 3C, ללא הטיה ברורה אבל רעש קטן. איור 4 מראה נתונים מודולוס גזירה מופק בכוח עקירה עקומות מוצג מרחבית כמו מפות נוקשות (elastographs), שם קשקשים בצבע עם מודולוס גזירה. Elastographs להדגים הבדלים ניכרים בטווח והפצה של מודולוס גזירה רקמה נורמלית (איור 4 א) ו fibrotic (איור 4B) ריאות parenchyma, ווריאציות מרחבית גדולה מודולוס גזירה, במיוחד בתוך המדגם ריאות fibrotic. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2.) A (לעומת שלב מיקרוסקופ מראה בדיקה AFM מעל רצועת ריאות עכבר parenchyma. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. (ב) Immunostaining של laminin ברקמת הריאה עכבר נורמלי מראה את ארכיטקטורה מכתשיים של parenchyma ריאות נורמליים. קופסה לבנה מציין מיפוי טיפוסי 80-by-80μm אזור אלסטיות. בר קנה מידה: 20 מיקרומטר. (C ו-D) Immunostaining של קולגן אני בתוך מלוחים (C) bleomycin (ד ') שטופלו ריאות עכבר parenchyma. סולם ברים, 100 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. (א) נציג לפירוש בכוח עקירה עקומות שנאספו מלוחים (כחול) bleomycin שטופלו (אדום) עכבר ריאות parenchyma, בהתאמה. הקווים השחורים הם בכושר הטוב ביותר הנובע המודל הרץ כדורי מסומנים עם המקביל שלהם מחושב של יאנג moduli. (B, C) נציג האו"ם לפירוש בכוח עקירה עקומות. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. Elastographs נציג שנאספו מלוחים (א) ו bleomycin שטופלו (ב) ריאות parenchyma העכבר. ברים צבע מצביעים מודולוס גזירה kilopascals. תוויות ציר עולה בקנה מידה מרחבי מיקרומטר. בר קנה מידה: 20 מיקרומטר

<ol><li>Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+flexibility+regulates+growth+and+apoptosis+of+normal+but+not+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 279, C1345-C1350 (2000).</li>
<li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Klein, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+control+by+physiological+matrix+elasticity+and+in+vivo+tissue+stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening.</a> Curr. Biol. 19, 1511-1518 (2009).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Bergner, A., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+contractility+and+smooth+muscle+Ca%282%2B%29+signaling+in+lung+slices+from+different+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Airway contractility and smooth muscle Ca(2+) signaling in lung slices from different mouse strains.</a> J Appl Physiol. 95, 1325-1332 (2003).</li>
<li>Thundat, T., Warmack, R. J., Chen, G. Y., Allison, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+and+ambient-induced+deflections+of+scanning+force+microscope+cantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Thermal and ambient-induced deflections of scanning force microscope cantilevers.</a> Appl Phys Lett. 64, 2894-2896 (1994).</li>
<li>Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Kas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+probe-based+frequency-dependent+microrheology+of+polymer+gels+and+biological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Scanning probe-based frequency-dependent microrheology of polymer gels and biological cells.</a> Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophys. J. 82, 2798-2810 (2002).</li>
<li>Butler, J. P., Nakamura, M., Sasaki, H., Sasaki, T., Takishima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poissons%27+ratio+of+lung+parenchyma+and+parenchymal+interaction+with+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Poissons' ratio of lung parenchyma and parenchymal interaction with bronchi.</a> Jap. J. Physiol. 36, 91-106 (1986).</li>
<li>Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+amplification+of+fibrosis+through+matrix+stiffening+and+COX-2+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression.</a> J Cell Biol. 190, 693-706 (2010).</li>
<li>Ebihara, T., Venkatesan, N., Tanaka, R., Ludwig, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+extracellular+matrix+and+tissue+viscoelasticity+in+bleomycin-induced+lung+fibrosis.+Temporal+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Changes in extracellular matrix and tissue viscoelasticity in bleomycin-induced lung fibrosis. Temporal aspects.</a> Am J Respir Crit Care Med. 162, 1569-1576 (2000).</li>
<li>Dolhnikoff, M., Mauad, T., Ludwig, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+oscillatory+mechanics+of+rat+lung+parenchyma+in+bleomycin-induced+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and oscillatory mechanics of rat lung parenchyma in bleomycin-induced fibrosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 160, 1750-1757 (1999).</li>
<li>Rehfeldt, F., Engler, A. J., Eckhardt, A., Ahmed, F., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+responses+to+the+mechanochemical+microenvironment--implications+for+regenerative+medicine+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell responses to the mechanochemical microenvironment--implications for regenerative medicine and drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59, 1329-1339 (2007).</li>
<li>Berry, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+injection+after+myocardial+infarction+improves+myocardial+compliance%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell injection after myocardial infarction improves myocardial compliance.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, 2196-2203 (2006).</li>
<li>Azeloglu, E. U., Bhattacharya, J., Costa, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscope+elastography+reveals+phenotypic+differences+in+alveolar+cell+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscope elastography reveals phenotypic differences in alveolar cell stiffness.</a> J Appl Physiol. 105, 652-661 (2008).</li>
<li>Wagh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+elasticity+measured+in+epithelial+cells+migrating+at+a+wound+edge+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 54-60 (2008).</li>
<li>Martinez, F. J., Flaherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+function+testing+in+idiopathic+interstitial+pneumonias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Pulmonary function testing in idiopathic interstitial pneumonias.</a> Proc Am Thorac Soc. 3, 315-321 (2006).</li>
<li>Cavalcante, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+interactions+between+collagen+and+proteoglycans%3A+implications+for+the+stability+of+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical interactions between collagen and proteoglycans: implications for the stability of lung tissue.</a> J Appl Physiol. 98, 672-679 (2005).</li>
<li>Hajji, M. A., Wilson, T. A., Lai-Fook, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+measurements+of+shear+modulus+and+pleural+membrane+tension+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved measurements of shear modulus and pleural membrane tension of the lung.</a> J Appl Physiol. 47, 175-181 (1979).</li>
<li>Lai-Fook, S. J., Wilson, T. A., Hyatt, R. E., Rodarte, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+constants+of+inflated+lobes+of+dog+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elastic constants of inflated lobes of dog lungs.</a> J Appl Physiol. 40, 508-513 (1976).</li>
<li>Azeloglu, E. U., Kaushik, G., Costa, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+hybrid+computational+model+of+AFM+indentation+for+analysis+of+mechanically+heterogeneous+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Developing a hybrid computational model of AFM indentation for analysis of mechanically heterogeneous samples.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 4273-4276 (2009).</li>
<li>A-Hassan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+microelastic+mapping+of+living+cells+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 74, 1564-1578 (1998).</li>
<li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft%2C+inhomogeneous+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> J. Biomech. Eng. 129, 430-440 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אפיון מכני של רקמת הריאה באמצעות AFM microindentation מציע ברזולוציה מרחבית חסרת תקדים (איור 4), המספק נקודת מבט ייחודית על וריאציות microscale ב קשיחות הרקמה. כדוגמה השירות שלה, הקודם מאקרו בקנה מידה מדידות רצועות רקמה נורמלית fibrotic ריאות הצביעו על עלייה משוער 2-3 של פי elastance עם סיסטיק 11,12. לעומת זאת, microindentation AFM מגלה כי התקשות רקמות הוא מקומי מאוד, עם אזורים מסוימים מציג עד ~ מגדיל פי 30 ב מודולוס גזירה מעל החציון שנצפתה רקמת הריאה נורמלי 10. כמו נוקשות מטריצה ​​כיום ידוע באופן ביקורתי להשפיע על תפקוד התאים, המדידות הללו המקומית לספק פרמטרים שלא יסולא בפז כדי לשפר את biofidelity המחקר התא התרבות של תאים הריאות. כמה עולות סוגיות מעשיות לשימוש רצועות דקות של רקמת הריאות. משטחים של רצועות אינם שטוח לחלוטין, כמו פרופיל רקמות בעקבות הארכיטקטורה של alveoli הבסיסית. מערכת AFM באופן אוטומטי את מיקום קצה בכיוון-Z במהלך הכניסה כאשר פני השטח מדגם וריאציה גובה קטן מ -15 מיקרומטר כדי לסייע להתגבר על האתגר הזה. המדידות נעשות בטמפרטורת החדר, לא 37 ° C, ולכן סטיות של תכונות מכניות הנגרמת על ידי וריאציה זו בטמפרטורה לא ניתן להעריך, אם כי הם יהיו צפויים להיות קלים. השפעת הארכיטקטורה שבבסיס קיר מכתשיים על תכונות מכניות נצפתה קשה לקבוע עם ההגדרה הנוכחית במיקרוסקופ אור. למשל, רצוי לקבוע אם הקירות מכתשיים התערוכה אנאיזוטרופיה תכונות מכניות שונות כאשר מסוכסך בכיוונים מיושר עם או רוחבי למישור הקיר. עם זאת, דגימות הנוכחי עבים מערכת הדמיה אין יכולות 3D, ולכן לא ניתן לקבוע את הכיוון המקומית קיר מכתשיים בכל נקודת מגע. לבסוף, את השפעתם של מרכיבים הסלולר על תכונות מכניות נמדד עדיין לא הובהר באופן מלא. בכל השיטות המפורטות כאן, המאמצים לא נעשים במפורש להסיר מרכיבים הסלולר של הרקמה. עם זאת, התאים את ההווה על פני השטח זמין עבור הכניסה צפויים להיות בת קיימא לנוכח הזמן שחלף מאז הקציר רקמות הצורך חיתוך הרקמה כדי לקבל גישה alveoli. ניסויים ספציפיים כדי להסיר תאים או לאכלס מחדש מטריצות עם תאים קיימא, ולהעריך את השינויים וכתוצאה מכך קשיחות הרקמה יופיע מוצדקת. מכיוון רקמת מבולבל טרי דרוש מדידות אלה, הזמן שחלף מן הקציר רקמות מדידה צריך להיות ממוזער דגימות צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע שינויים תכונות מכניות. תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם בכל פעם רצועות ורקמות מועברים בין המכולות במהלך הכביסה או מכתים כך עיוות נזק מינימלי או מופק. עבור יישום AFM בנוזל, היא צעד חיוני כדי לחתוך את הרקמה כפי שטוחה ככל האפשר לשתק את המדגם על coverslip התומכת. אם זמין, מכונת חתך אוטומטי כגון vibratome או מבצעה רקמה ניתן להשתמש כדי לחתוך פרוסות בעובי אחיד מאוד. חשוב לצרף רצועות רקמה מיד לפני מדידות AFM ולמזער את הזמן שחלף עבור מדידות AFM כמו המדגם יהיה בסופו של דבר להתנתק coverslips. תצפית אחת שימושית כי רצועות גדול להופיע לצרף ביציבות יותר כדי לכסות את תלושי להישאר במקום משכי זמן של PBS מאשר רצועות קטנות יותר. Microindentation AFM ניתן לאפיין דגימות פורש מגוון רחב של אבא 100 עד kPa 50 (גזירה מודולוס) בעת שימוש 0.06 תקן N / שלוחה מ &#39;עם טיפ 5 מיקרומטר קוטר כדורית. טווח זה ניתן להרחיב באמצעות בדיקות עם קבועי קפיץ שונים; בדיקות AFM עם טיפים זכוכית כדורית החל 0.6-12 מיקרומטר קבועים בקוטר האביב החל 0.01-0.58 N / m זמינים מסחרית (לדוגמה Novascan) ו נפוץ 3. עם קצה כדורי 5 מיקרומטר, האזור קשר תיאורטי בין עצה לבין רקמות היא כ 5-9 מיקרומטר 2 עבור הכניסה 400-700 ננומטר (איור 1A). טיפים קטנים יותר או גדול יותר יכול לשמש כדי לספק סולמות קטן או גדול של רזולוציה מרחבית. טיפים פירמידה יש גם בשימוש microindentation AFM 13-16, מתן מגע באזורים קטנים יותר ובכך להגדיל רזולוציה מרחבית במיפוי, אם כי ראוי נתונים מורכב יותר עבור הגיאומטריה טיפ זה. מספר מגבלות לשיטה זו יש לציין. הריאות באופן מסורתי מאופיין מכנית הלא פולשני, למשל באמצעות הלחץ בנפח 17 או ניתוח פונץ הכניסה של הריאות כל 19,20. שיטות פולשנית כמו זה המתואר כאן לשנות את הארכיטקטורה ריאות במובנים חשובים דרך אובדן int אוויר הנוזלerface כי בדרך כלל קיימת הריאות אוויר מילאו את ואובדן להדגיש מראש כי האינפלציה שומרת ריאות חלקית על הרפיה של שרירי הנשימה. מגבלות אלה משותפת לכל המדידות שנעשו רקמת הריאות 18 רצועות. יש לציין, עם זאת, נוקשות החציוני הנמדד parenchyma של רקמת הריאה נורמלי (מודולוס גזירה ~ 0.5kPa) לא שונות באופן מהותי מן אומדנים המבוססים על הכניסה-אגרוף של הריאות שלם בעוצמות מנוחה 19,20. בעוד רקמת הריאה ידוע התערוכה שאינו ליניארי התקשות עם העיוות גדל, לא ניתן לבדוק באופן קפדני אם נכס זה נמשכת עד בקנה מידה מיקרו עם השיטות הננקטות כאן. המודל מניח הרץ ההומוגניות של המדגם. עם זאת, חומרים ביולוגיים ביותר, כולל ריאות parenchyma, הם הטרוגניים יותר ויותר ירידה קשקשים מרחבית. ההטרוגניות של המדגם יכול לגרום חפצים כמו וריאציה של מודול של יאנג, תלוי בעומק הכניסה, כלומר בהתאם השכבה או רכיב זה עיוות. ההטרוגניות במישור xy, יכול להיות מוגבל על ידי בחירה מדוקדקת בגודל המתאים קצה כדוריים בהתאם מיקרו של ביולוגי כפי שהוצע על ידי Dimitriadis EK et al. 8 זה הרבה יותר קשה לחזות או לתקן את השגיאה מודל הרץ בשל חומר ההטרוגניות בכיוון-z. Azeloglu et al. לאחרונה הציע מודל חישובי היברידית לאפיין את תכונות אלסטיות של המצע הטרוגנית עם תכלילים מוטבע בדידים 21. הטכניקה החדשה שלהם מספק פוטנציאל אמצעי כדי לחשב תכונות הכללתם של חומרים הטרוגניים להתגבר על המגבלות של ניתוח Hertzian. המודל מניח הרץ גם התנהגות אלסטית מוחלטת, בעוד חומרים ביולוגיים בדרך כלל להציג תלוי זמן התנהגויות viscoelastic. אפיון viscoelastic מלא של רקמה ניתן להשיג על ידי שינוי מהירויות הכניסה בשימוש. חשוב לציין, בדיקות קודמות מאקרו בקנה מידה מכנית של רקמת הריאה נורמלי fibrotic מדגים תלות תדר חלש של רקמת הריאה תכונות מכניות, ושמירה על ההבדלים בין מאפייני רקמת נורמלי fibrotic מכני על פני תדרים כל נבדק 11. ממצאים אלו ממליצים כי מדידת תכונות מכניות באמצעות מהירות הכניסה יחיד עם AFM לוכדת היבט חיוני של שינויים במאפייני הרקמה מכני שמלווים פיברוזיס. היחס של פואסון של 0.4 עבור רקמת הריאה המשמש עבודה זו היא מן מדידה מאקרוסקופי 9. למרבה הצער, יחס של פואסון על מיקרו בקנה מידה שינויים בתנאי המחלה אינם זמינים בספרות. כפי חלופות E, E / (1-υ 2) או (1-υ 2) / πE (סימלה את k קבוע אלסטי) 22 ניתן לחשב microindentation AFM ודיווח כאשר היחס של פואסון אינו ידוע. עבור רוב biomaterials היחס של פואסון הוא בטווח של 0.4-0.5 בגלל תכולת המים הגבוהה שלהם. בטווח 0.3-0.5, הגורם 1 / (1-υ 2) משתנה רק 1.10-1.33, כך וריאציות סביר ביחס של פואסון להפעיל רק תופעות צנוע על מודול דיווח. הגידול מודולוס גזירה שאנחנו הדוח היחסית רקמות fibrotic אל הרקמות הוא פי כמה גודל, רומז כי השגיאות המשויכות וריאציות של יחס פואסון הם קלים יחסית לשינויים שנצפו תכונות מכניות. האלגוריתם קוד בפועל שיכול לשמש לניתוח נתונים עקירה בכוח כפוף לתנאי היישום הספציפי ואת המאפיינים הבאים של אוכלוסיות מגוונות של עקירה בכוח עקומות. אם ניתוח מתוחכם יותר מעניין, אפשר להתייעץ העבודה של Lin et al. 23. החוקרים ערכו סדרה של אסטרטגיות סינרגיסטי לתוך אלגוריתם מתגבר רבים של סיבוכים אשר מנע בעבר מאמצים כדי להפוך את הרץ הולם של מודלים של נתונים הכניסה. בתחומים אחרים קיימות מספר לפיתוח ניצול נוסף של שיטה זו. במקרים שבהם אחד הוא מעוניין לדמיין את קירות מכתשיים ללא תיוג נוגדן, הן קולגן ואלסטין ו ניתן דמיינו מן האות autofluorescent שלהם בספקטרום הירוק. מצד שני, הדמיה טובה יותר, או באמצעות קטעי רקמה רזה, שיטות הדמיה 3D, או שניהם, יכול לשפר את היכולת לקשר בין הארכיטקטורה הבסיסית רקמות עם תכונות מכניות. בעוד השיטות הקיימות ולאפשר מכתים ויזואליזציה של מרכיבי תאי מטריקס כגון קולגן laminin, מאמצים נוסף יכול להיות מכוון מכתים פני התא סמנים לזיהוי אוכלוסיות תאים ספציפיים כדי לאפיין את microenvironments מכני בקרבת אוכלוסיות כאלה. Alternatively, רקמה ניתן לקצור מעכברים להביע fluorescently-tagged השושלת סמנים או חלבונים ספציפיים בתא להמשיך את אותה המטרה. לבסוף, השיטה המפורטת כאן מופיע גם מתאים לאפיון תכונות אנטומיות אחרות בריאה, כגון כלי אשר לשפץ ב יתר לחץ דם, ואת דרכי הנשימה אשר לשפץ באסתמה. בהתבסס על המצב הנוכחי של פיתוח פוטנציאל שיפור נוסף, microindentation AFM מופיע צפוי להניב תובנות רבות ערך את השינויים רקמות נוקשות שמלווים התקדמות המחלה בריאה, יהיה ללא ספק להיות בעל ערך באפיון שינויים במרחב ובזמן ב קשיחות של מגוון רחב של רקמות רכות אחרות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> AFM הטיפ </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 מיקרון בורוסיליקט חרוז, 0.06 N / m </td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין coverslips </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 מ&quot;מ זכוכית עגול מס &#39;1 </td></tr><tr><td> Agarose, טמפרטורה נמוכה gelling </td><td> סיגמא </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> הארנב נגד קולגן אני (RB PAB) נוגדן </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 546 נגד ארנב נוגדן עז </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> הארנב נגד Laminin </td><td> סיגמא </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

מטריקס קשיחות מאוד משפיע, צמיחה בידול ותפקוד של תאים חסיד 1-3. בסולם המאקרו את הנוקשות של רקמות ואיברים בגוף האדם תוחלת צווים שונים של גודל 4. הרבה פחות ידוע על כמה קשיחות משתנה מרחבית בתוך רקמות, ומה היקף בקנה מידה נוקשות של שינויים מרחביים הם תהליכי מחלה כי התוצאה שיפוץ רקמות. כדי להבין טוב יותר כיצד שינויים נוקשות מטריקס לתרום הפיזיולוגיה הסלולר מחלה ובריאות, מדידות של רקמות נוקשות שהושגו בקנה מידה מרחבי רלוונטי תאים תושב נדרשים. זה נכון במיוחד עבור הריאות, רקמה תואם מאוד אלסטי בו שיפוץ מטריצה ​​היא תכונה בולטת במחלות כגון יתר לחץ דם אסטמה, אמפיזמה פיברוזיס. כדי לאפיין את הסביבה מכני מקומי של הריאות parenchyma בקנה מידה מרחבי רלוונטי תאים תושב, פיתחנו שיטות כדי למדוד ישירות את המאפיינים אלסטי מקומית של רקמת הריאה טרי Murine באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) microindentation. עם הבחירה המתאימה של AFM Indentor, שלוחה, ועומק הכניסה, שיטות אלה מאפשרים מדידות של מודולוס גזירה מקומית ברקמת במקביל בניגוד שלב ו דימות פלואורסצנטי האזור של עניין. דגימה שיטתית של רצועות ורקמות מספק מפות של מאפייני רקמת מכני החושפים שינויים מרחביים המקומית מודולוס גזירה. מתאמים בין תכונות מכניות תכונות אנטומיות ופתולוגיים הבסיסית להמחיש כיצד קשיחות משתנה עם מטריקס ב סיסטיק בתצהיר. שיטות אלה ניתן להרחיב את רקמות רכות אחרות תהליכי מחלה לחשוף כמה תכונות מכניות רקמות מקומיות שונות ברחבי החלל התקדמות המחלה.

הנוקשות של מטריקס תאיים משפיעה התנהגויות רבות של תאים חסיד. קשיחות מטריקס משתנה מרחבית ברחבי רקמה, ועוברת שינוי בתנאי מחלה שונים. כאן אנו לפתח שיטות כדי לאפיין שינויים מרחביים קשיחות ברקמה נורמלית fibrotic ריאות עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי microindentation.

קשיחות המטריצה משפיעה רבות על הגדילה, הדיפרנציאציה והתפקוד של תאים נצמדים1-3. במקנה המקרו, קשיחותן של רקמות ואיברים...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לאפיין את הסביבה המכנית המקומית של פרנכימה של הריאה בקנה מידה מרחבי הרלוונטי לתאים השוכנים בה, וזאת באמצעות מדידה ישירה של התכונות האלסטיות המקומיות של רקמת ריאה רעננה באמצעות מיקרו-החדרה (micro indentation) במיקרוסקופיה של כוח אטומי (atomic force microscopy). מטרה זו מושגת על ידי חיתוך של רקמת ריאה של עכבר המנופחת באגר עם תער או להב סקלפל, כדי להכין רצועות של פרנכימה של הריאה באורך וברוחב של חמישה על חמישה מילימטרים, ובבעו 400 micrometers. לאחר מכן, רצועות רקמת ריאה שאינן מקובעות ושאינן חדירות עוברות לצביעה אימונוהיסטוכימית, המזהה אזורי עניין עבור מיקרו-החדרה ב-AFM.לאחר מכן, מבוצעת מיקרו-החדרה (micro indentation) בשיטת FM על רצועות רקמה ב-PBS בטמפרטורת החדר. תוצאות אלו מתקבלות במטרה למדוד באופן ישיר את התכונות האלסטיות המקומיות של רקמת ריאה טרייה. הן מראות הבדלים בולטים בטווח ובפיזור של קשיחות הרקמה בפארנכימה של ריאות תקינות ופיברוטיות, וכן וריאציות מרחביות גדולות בקשיחות, במיוחד בתוך דגימת הריאה הפיברוטית.על בסיס מפות קשיחות שהופקו מעקומי העתקה כפויה שהתקבלו באמצעות מיקרו-ההטבעה של FM. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני מדדים קיימים, כגון מתיחה של רצועות רקמה, הוא שהיא מציעה רזולוציה מרחבית חסרת תקדים המספקת נקודת מבט ייחודית על שונות בקנה מידה מיקרוסקופי בקשיחות הרקמה. מדד זה יכול לסייע במתן מענה לשאלות מפתח, כגון כיצד הקשיחות משתנה מרחבית בתוך הרקמה, ומהם ההיקף והקנה המידה המרחבי של שינויי הקשיחות במחלה.תהליכים הגורמים לעיצוב מחדש של רקמה. כדי להכין רצועות של רקמת ריאה, התחילו בייצוב מבנה הריאה לצורך חיתוך על ידי ניפוח ריאות עכבר מבודדות. הניפו תוך כדי הזרקה תוך-קשקתית (intratracheally) עם 50 milliliters per kilogram ממשקל הגוף של aros בריכוז 2% עם נקודת ג'ל נמוכה שהוכנה ב-PBS; קשרו את הקשקשת וקררו את הריאות המנופחות באמבט PBS בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius למשך 60 דקות. ה-aros יהפוך לג'ל ויתקשה בחללי האוויר כדי לייצב בעדינות את מבנה הריאה. במהלך פרק זמן זה, בעזרת תער או סקלפל, חתכו את רקמת ריאת העכבר המיוצבת ב-aros לרצועות באורך וברוחב של כחמישה על חמישה millimeters, ובעובי של 400 micrometers.לאחר מכן, שטפו את הרצועות ב-PBS בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות כדי להסיר שאריות aros ולשלול דרכי נשימה וכלי דם גדולים. גזרו רצועות מאזורים סוב-פלאורליים המרוחקים מהסממולי של קשרי הנשימה הראשיים; אם ברצונכם לצלם דרכי נשימה או כלי דם גדולים, גזרו רצועות מרקמת ריאה קרובה יותר לסממולי של קשרי הנשימה הראשיים כדי לבודד אזורים של עניין עבור FM micro indentation. הדמיאו את הרקמה באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה או ביצועי צביעה אימונוהיסטוכימית והדמיאו באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.אנא עיינו בחלק הכתוב של פרוטוקול זה כדי להכיר את ההליך. מיד לפני אפיון FM, הצמידו את רצועות הרקמה לכיסויות זכוכית (cover slips) של 15 מילימטר מצופות poly L lysine, על ידי הרמת הכיסוי מתחת לרקמה הצפה, תוך הבטחה שרצועת הרקמה נפרסת באופן אחיד על פני הכיסוי. במידת הצורך, הניחו את הרצועה בין שתי כיסויות זכוכית, כאשר השנייה נקייה ולא מצופה, והפעילו לחץ קל כדי לסייע להצמדת הרקמה לכיסוי המצופה ב-poly L lysine.יש לכייל את מערכת ה-A FM לפי הוראות היצרן מיד לפני כל סבב של ניסויי מיקרו-השחקה (micro indentation). לשם כך, קבע שני פרמטרים קריטיים: את קבוע הקפיץ של הקנטילבר (cantilever spring constant) באמצעות שיטת התנודות התרמיות באוויר, ואת רגישות סטיית הקנטילבר (cantilever deflection sensitivity), המהווה פרמטר המשמש להמרה של אות הפלט מהפוטודיודה למרחק הסטייה בפועל של הקנטילבר.יש לכייל את רגישות ההסטה על ידי השגת עקומה סטנדרטית של דחיסה כפויה (forced displacement curve) ב-PBS על גבי תגית זכוכית נקייה. לאחר מכן, חשב את השיפוע של עקומת הדחיסה הכפויה במדידת עקומת הדחיסה הכפויה. קצה ה-AFM נמתח לעבר פני הדגימה ונסוג מהם במיקום בודד, כאשר הסטת הקניטלב (cantilever) $\Delta D$ מנוטרת כפונקציה של תזוזת הקצה $\Delta Z$. מומלץ להשתמש בקניטלב משולש מסיליקון ניטריד עם קצה כדורי של סיליקט בורון בקוטר $5\ \mu\text{m}$ באמצעות גששי FM בעלי קבוע קפיץ של $0.06\ \text{N/m}$.אפיינו באופן מכני חומרים רכים עם מודול גזירה הנע בין 100 ל-50,000 pascals. נגבו את המשטח התחתון של כיסוי הדגימה (cover slip) בעזרת נייר סופג, ולאחר מכן הצמידו אותו לשקף זכוכית סטנדרטי באמצעות גריס ואקום. הניחו את שקף הזכוכית על במה של AFM וכסו את הדגימה ב-500 microliters של PBS בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, מקם ראש סריקה של A FM מעל הדגימה. כוונן את שולחן הדגימות של המיקרוסקופ כדי להגדיר את המיקרוסקופ לצפייה דרך העדשות, במטרה למקם את קצה ה-A FM במרכז שדה הראייה. הזז את שולחן דגימות ה-A FM כדי לבחור אזור עניין ברקמה.לאחר מכן, עברו לצפייה באמצעות מצלמת CCD כדי להקליט תמונת ניגודיות פאזה (phase contrast) ו/או תמונות פלואורסצנציה של הרקמה לפי הצורך. הזיזו את קצה ה-AFM לאטה כלפי מטה עד להגעה למגע מדויק עם הדגימה. אפיון באמצעות מיקרו-הזהרה (micro indentation) של דגימות רכות ב-AFM דורש עומקי הזהרה קטנים כדי למנוע מאמצים מקומיים גדולים, אשר מבטלים את מודל הרץ המשמש לחישוב המודול האלסטי; כדי למנוע מאמצים גדולים, בצעו את ההזהרה במצב טריגר (trigger mode) על ידי הגדרת סטייה מקסימלית של הקנטילבר ל-500 nanometers.מגבלת סטייה זו תגביל את כוח ההחדרה המקסימלי לפחות מ-30 nano newtons. יש לבחור מהירות חדירה איטית מספיק כדי לבחון תכונות אלסטיות ולא תכונות ויסקו-אלסטיות של הדגימה הרכה. עבור רקמת ריאה, בחר טווח מהירויות של 2 עד 20 micrometers per second עבור מדידה בודדת מאזור עניין.העבירו את גשושית ה-AFM למיקום הרלוונטי ובצעו דחיסה בודדת כדי לאסוף עקומת כוח-העתקה סטנדרטית. הגשושית תנוע רק בציר Z. עבור מיפוי אוטומטי של אזור עניין, עברו למצב מפת כוחות (force map), ובחרו את גודל הסריקה ואת נקודות הדגימה בתוך האזור שנבחר.קצה ה-AFM סורק את פני הדגימה בין תנועות הדחיסה ואוסף עקומות דחיקה-כוח בודדות בכל נקודה בתוך רשת דגימה מוגדרת. מצאנו כי מעשי הוא להשתמש ברשת דגימה של 16 על 16 כדי למפות שטח של 80 µm על 80 µm במהירות דחיסה של 20 µm לשנייה, פעולה שניתן להשלים בכ-10 דקות. כדי לחשב את מודול יאנג, התאימו את עקומת הדחיקה-כוח למודל דחיסה כדורי של הרץ באמצעות התאמת עקומות לא-לינארית בשיטת ריבועים פחותים כפי שמוצג כאן, כאשר F equals K sub C times delta D הוא הכוח להטיית הקנטילבר.K sub C הוא קבוע הקפיץ של הקניטלבר. R הוא רדיוס קצה הכדור, delta השווה ל-delta Z פחות delta D היא העומק של ההחדרה, ו-new הוא יחס פואסון של הדגימות, השווה ל-0.4 עבור רקמת ריאה. כדי להעריך את איכות ההתאמה, חשב את ערך ה-SSR, או את סכום הריבועים של ההפרש בין הנתונים לערכי ההתאמה במהלך התאמת העקומה הבלתי-ליניארית.יש להסיר מדידות שאינן אמינות או שאינן ניתנות לפירוש על ידי השמטת נתונים מעקומות שגויות עם ערכי SSR גבוהים. במידת הצורך, המיר את המודול האלסטי או את E למודול הגזירה G, באמצעות הקשר E שווה לפעמיים סכום של 1 פלוס ν כפול G. כדי להציג תבניות מרחביות של קשיות שנאספו במצב מפת כוח (force map mode), שרטט את נתוני המודול ומפות קווי גובה, למשל, ברשת של 16 על 16 המכסה שטח של 80 µm על 80 µm.כדי לעבד כמות גדולה של נתוני עקומות כוח, ניתן לכתוב אלגוריתם מותאם אישית להתאמה אוטומטית של עקומות כוח-העתקה, לחילוץ מודולים או לשרטוט מפות קונטור או גרף ELA. באמצעות אותם הליכים ופרמטרים שתוארו לעיל, דמות זו מראה כי הרקמה נחתכה ונצבעה כראוי. המבנה המזערי של פרנכימת הריאה נשמר היטב, כפי שנצפה בצביעה אימונופלורסצנטית לרכיב ממבנה הבסיס, laminin, ללא קיבוע או חדירה (permeation).לוחות אלו מראים צביעה אימונופלואורסצנטית לקולגן, אחת בריאות טריות שאינן מקובעות שנלקחו מעכברים שטופלו קודם לכן ב-PBS או טופלו ב-bleomycin כדי להשראת פיברוזיס. מוצגים כאן גרפים של דחיפה-כוח שהתקבלו באמצעות מיקרו-אינדנטציה ב-AFM תחת הפעלת אותו כוח. ראש ה-AFM יוצר שקיעה גדולה באזור רך, מה שמוביל לעקומת דחיפה-כוח שטוחה יחסית המוצגת בכחול, לעומת שקיעה קטנה ועקומת דחיפה-כוח תלולה עבור אזור קשיח יותר המוצגת באדום.כדי להשיג עקומות כוח נקיות לאחר כל חדירה, יש לסגת את קצה ה-A FM לחלוטין מפני פני הדגם ולוודא שאין מגע לפני החדירה הבאה. מצב זה, שבו אין מגע, תואם לאזור השטוח של העקומה, שבו קצה הפרובה נע ללא סטייה של הקניבאל. איור זה מציג עקומה שגויה טיפוסית ללא אזור שטוח, דבר המתרחש כאשר הקצה אינו נסוג לחלוטין מפני פני הדגם, למשל כאשר דגם רך נדבק לקצה, מה שהופך את קביעת נקודת המגע לבלתי אפשרית אם הקצה לכוד לחלוטין בתוך הדגם הרך.העקומה עשויה להיראות כך ללא סטייה ברורה, אלא עם רעש קטן. איור זה מציג קשיחות. נתונים שהופקו מעקומות הסטה כפויה והוצגו מרחבית כמפות קשיחות המכונות השתעם של ELAs, שבהן הצבע משתנה בהתאם לקשיחות; השתעמי ה-ELAs מדגימים הבדלים בולטים בטווח ובפיזור של קשיחות הרקמה בפרנכימה של ריאות נורמליות ופיברוטיות, וכן שינויים מרחביים משמעותיים בקשיחות, במיוחד בדגימה של הריאה הפיברוטית.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לאפיין את הסביבה המכנית המקומית של פרנכימה של הריאה, באמצעות מדידה ישירה של התכונות האלסטיות המקומיות של רקמת ריאה טרייה בעזרת מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM).

micro-mechanical-characterization-lung-tissue-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Canovic, E. P., et al. אפיון תכונות מכניות רב-ממדיות של רקמת המוח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, הזחת פגיעה וריאומטריה. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) למדידת התכונות הויסקו-אלסטיות של רקמת המוח, כאשר שלוחה עם בדיקה כדורית מקיימת אינטראקציה עם הרקמה ומתכופפת תחת כוחות מופעלים. קרן לייזר המוסטת על גבי גלאי עוקבת אחר השלוחה כדי למדוד את עומק השקע והרפיית הכוח, מה שמאפשר לאפיין את התכונות המכניות של הרקמה.

אפיון התכונות המכניות של רקמת מוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

שיטה לחקירת המבנה של קולטן אור חלבון באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מתוארת במאמר זה. מיפוי מאפיינים ננו-מכניים כמותי של PeakForce (PF-QNM) חושף דימרים חלבונים שלמים על משטח נציץ.

מיקרוסקופית כוח האטומי של אורות אדומים קולטני אור שימוש במיפוי PeakForce כמותי nanomechanical נכס

אזור פני השטח הפנימי של הריאות (ISA) הוא קריטריון קריטי להערכת מורפולוגיה ריאות ופיזיולוגיה במחלות ריאה ו-התחדשות שנגרם על ידי פציעה. אנו מתארים כאן שיטה סטנדרטית שיכולה למזער את הטיה המדידה עבור השב"כ הן ריאות pneumonectomy ריאות מודלים השתלת עכבר פרוטה.

שיטה מתוקננת למדידת שטח הפנים של הריאות הפנימיות באמצעות דלקת ריאות של עכבר והשתלת תותב

כאן, אנחנו מפרטים את הטכניקות ניסיוני המשמשים להערכת כוחות בליטה podosomes להחיל על סרט תואם, משלב הכנת הסרט לניתוח אוטומטי של תמונות הטופוגרפי.

בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

כאן, אנו מציגים מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), מופעל ככלי ננו ומיקרו לכניסה על תאים ורקמות. המכשיר מאפשר רכישת סימולטני של טופוגרפיה של פני השטח 3D של המדגם ואת התכונות המכאניות שלה, כולל קיר התא מודולוס של יאנג, כמו גם לחץ טורגור.

שימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי למדידת תכונות מכניות ולחץ טורגור של תאים צמחיים ורקמות צמחים

להלן הפרוטוקול של טכניקת קונפוקל, המשלבת מיקרוסקופיה של כוח קונפוקלי ואטומי לפלטפורמת מכשיר יחיד. Conpokal מספק תא זהה, אותו אזור, ליד הדמיה קונפוקאלית בו זמנית אפיון מכני של דגימות ביולוגיות חיות.

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

כימות שטח המגע והכוח המופעל על ידי קצה גשושית כוח אטומי (AFM) על משטח הדגימה מאפשר קביעת תכונות מכניות ננומטריות. נדונות שיטות עבודה מומלצות ליישום ננו-הזחה מבוססת AFM באוויר או בנוזל על דגימות רכות וקשות למדידת מודולוס אלסטי או תכונות ננו-מכניות אחרות.

מיקרוסקופ כוח אטומי ננו-הזחה מבוססת Cantilever: מדידות תכונות מכניות בקנה מידה ננומטרי באוויר ובנוזל

פיתחנו טכניקת עיבוד רקמות המשתמשת ברקמת ריאה משובצת ויברטומה ואגרוז ליצירת קטעי ריאה, ובכך אפשרנו רכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורת ריאות. השתמשנו בצביעת אימונופלואורסנציה כדי לצפות בביטוי חלבונים מרחבי באמצעות סמנים מבניים ספציפיים של הריאה.

חתך ויברטומי אוטומטי של רקמת ריאה משובצת אגרוז להדמיית פלואורסצנטיות מרובת משתתפים

פרוטוקול זה מדמיין כיצד להכין חתכים קריוגרפיים של רקמת ריאה של עכברים, לבצע ניסויים במפת כוח במיקרוסקופ כוח אטומי ולנתח את הנתונים כדי לקבוע את המודול של יאנג של קרום הבסיס הריאתי המקומי של העכבר.

חילוץ מודול הצעירים של ממברנות הבסיס הריאתיות של עכברים מקומיים ממפות כוח הנגזרות ממיקרוסקופ כוח אטומי

חקור את המכניקה של רקמת הריאה באמצעות מיקרו מכונות אפיון במיקרוסקופ כוח אטומי. שיטה זו מאפשרת למדוד את הקשיחות המקומית ברקמות ריאה נורמליות ופיברוטיות בעכברים.

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

גלה סרטונים נוספים