מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לאפיין את הסביבה המכנית המקומית של פרנכימת ריאות בקנה מידה מרחבי הרלוונטי לתאים תושבים על ידי מדידה ישירה של התכונות האלסטיות המקומיות של רקמת ריאה טרייה באמצעות מיקרו הזחה של מיקרוסקופ כוח אטומי. זה מושג על ידי חיתוך רקמת הריאה המנופחת של העכבר עם סכין גילוח או אזמל להכנת רצועות פרנכימה ריאתיות באורך ורוחב של חמישה על חמישה מילימטרים, ובעובי של 400 מיקרומטר. רצועות רקמת הריאה הבאות שאינן קבועות הן כתם חיסוני, המזהה אזורי עניין להזחת מיקרו FM.

לאחר מכן מבוצעת כניסת מיקרו FM על רצועות רקמות ב- PBS בטמפרטורת החדר. על מנת למדוד ישירות את התכונות האלסטיות המקומיות של רקמת הריאה הטרייה, מתקבלות תוצאות. זה מראה הבדלים בולטים בטווח ובהתפלגות של נוקשות הרקמות בפרנכימת ריאות נורמלית ופיברוטית ושונות מרחבית גדולה בנוקשות, במיוחד בתוך דגימת הריאה הפיברוטית.

מבוסס על מפות קשיחות שחולצו מעקומות תזוזה מאולצת המתקבלות באמצעות כניסת מיקרו FM. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני אמצעי קיים כמו מתיחת רצועות רקמות הוא שהיא מציעה רזולוציה מרחבית חסרת תקדים המספקת פרספקטיבה ייחודית על שונות בקנה מידה מיקרו בנוקשות הרקמות. מדד זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח כגון כיצד הנוקשות משתנה מרחבית בתוך הרקמה ומהו ההיקף והסולם המרחבי של שינויי הנוקשות במחלה.

תהליכים המביאים לעיצוב מחדש של רקמות להכנת רצועות רקמת ריאה מתחילים בייצוב מבנה הריאה לחיתוך על ידי ניפוח ריאות עכבר מבודדות. תוך קנה הנשימה עם 50 מיליליטר לק"ג משקל גוף חם ונמוך של 2% ג'ל נקודתי מוכן ב-PBS קושרים את קנה הנשימה ומקררים את הריאות המנופחות באמבט PBS בארבע מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. הארוס יג'ל ויתקשה בחללי האוויר כדי לייצב בעדינות את מבנה הריאה במהלך מרווח זה, בעזרת סכין גילוח או אזמל, חותכים את רקמת הריאה של העכבר המיוצב לרצועות באורך ורוחב של כחמישה על חמישה מילימטרים, ובעובי של 400 מיקרומטר.

לאחר מכן שטפו את הרצועות ב-PBS ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי להסיר שאריות של ארוס כדי לא לכלול דרכי נשימה וכלים גדולים. רצועות חתוכות מאזורים תת-פלאורליים המרוחקים מסמפונות הגזע הראשיים אם יש לדמות דרכי נשימה בכלי דם גדולים רצועות חתוכות מרקמת הריאה פרוקסימלית יותר לסמפונות גזע ראשיים כדי לבודד אזורי עניין למיקרו כניסת FM. דמיין את הרקמה על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פנים או אימונוסטיין ודמיין על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

אנא עיין בחלק הכתוב של פרוטוקול זה עבור ההליך. מיד לפני אפיון FM, חבר את רצועות הרקמה להחלקות כיסוי 15 מילימטר מצופות פולי L ליזין על ידי הרמת החלקת הכיסוי מתחת לרקמה הצפה, וודא שרצועת הרקמה מתפשטת באופן שווה על משטח החלקת הכיסוי. במידת הצורך, סנדוויץ' את הרצועה עם החלקת כיסוי נקייה שנייה לא מצופה והפעל לחץ עדין כדי לסייע בהצמדת רקמות להחלקת הכיסוי המצופה פולי L ליזין.

כייל את מערכת A FM בהתאם להוראות היצרן מיד לפני כל סבב של ניסויי מיקרו הזחה. לשם כך, קבע שני פרמטרים קריטיים. קבוע קפיץ השלוחה בשיטת התנודות התרמית באוויר ורגישות הסטייה של השלוחה, שהוא פרמטר המשמש לקנה מידה של אות הפלט של דיודת הצילום למרחק הסטייה בפועל

כייל את רגישות הסטייה על ידי השגת עקומת תזוזה מאולצת סטנדרטית ב-PBS על מגלשת זכוכית נקייה. לאחר מכן חשב את השיפוע של עקומת התזוזה הכפויה במדידת עקומת התזוזה הכפויה. קצה ה-A FM מורחב לכיוון משטח הדגימה ונסוג ממנו במיקום יחיד עם הסטייה של דלתא השלוחה D המנוטרת כפונקציה של דלתא תזוזה של קצה Z.It מומלץ להשתמש בשלוחה משולש סיליקון ניטריד עם קצה כדורי בו סיליקט בקוטר חמישה מיקרומטר באמצעות בדיקות FM עם קבוע קפיץ של 0.06 ניוטון למטר.

אפיינו מכנית חומרים רכים עם אפנון שקוף המשתרע על פני 100 עד 50,000 פסקל. נגב את המשטח התחתון של פתק מכסה הדגימה בנייר טישו, ולאחר מכן הדק אותו לשקופית זכוכית רגילה עם שומן ואקום. הרכיבו את שקופית הזכוכית על דגימת A FM stage וכסו את הרקמה ב-500 מיקרוליטר PBS בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הנח את ראש סריקת ה-FM מעל הדגימה. כוונן את דגימת המיקרוסקופ stage כדי להגדיר את המיקרוסקופ לצפייה בעינית כדי ליישר את קצה ה-FM במרכז שדה הראייה. העבר את שלב דגימת A FM כדי לבחור אזור עניין על הרקמה.

לאחר מכן עבור לצפייה במצלמת CCD כדי להקליט תמונת ניגודיות פאזה ו/או תמונות פלואורסצנטיות של הרקמה כרצונך. הזז את קצה ה-A FM לאט כלפי מטה עד שהוא במגע עם הדגימה המדויקת. אפיון מיקרו הזחה FM של דגימות רכות דורש עומק כניסה קטן כדי למנוע זנים מקומיים גדולים, אשר מבטלים את מודל הרץ המשמש לחישוב מודול אלסטי כדי למנוע מתחים גדולים, לבצע כניסה במצב טריגר על ידי הגדרת הסטייה המקסימלית של השלוחה ל-500 ננומטר.

מגבלת סטייה זו תרסן את כוח הכניסה המרבי לפחות מ-30 ננו ניוטון. יש לבחור את מהירות הכניסה כך שתהיה איטית מספיק כדי לחקור תכונות אלסטיות ולא ויסקו-אלסטיות של הדגימה הרכה. בחר טווח מהירות של שניים עד 20 מיקרומטר לשנייה עבור רקמת ריאה למדידה בודדת מאזור עניין.

העבר את בדיקת A FM למיקום המעניין ובצע כניסה בודדת כדי לאסוף עקומת תזוזה סטנדרטית של כוח. הגשושית תנוע רק בכיוון Z. למיפוי אוטומטי של אזור עניין, עבור למצב מפת כוח, בחר את גודל הסריקה ונקודות הדגימה באזור שנבחר.

קצה ה-A FM RAs על פני משטח הדגימה בין תנועות הזחה ואוסף עקומות תזוזה מאולצת בודדות בכל נקודה בתוך רשת דגימה מוגדרת inde. מצאנו שזה מעשי להשתמש ברשת דגימה של 16 על 16 כדי למפות שטח של 80 מיקרומטר על 80 מיקרומטר במהירות כניסה של 20 מיקרומטר לשנייה, שניתן להשלים תוך כ-10 דקות. כדי לחשב את מודול יאנג, התאם את עקומת תזוזה הכוח למודל הכניסה הכדורית של הרץ באמצעות התאמת העקומה הלא ליניארית של ריבוע לי כפי שמוצג כאן, כאשר F שווה ל-K תת-C כפול דלתא, D הוא הכוח לכופף את השלוחה.

K sub C הוא קבוע קפיץ השלוחה. R הוא רדיוס קצה הכדור דלתא שווה לדלתא Z פחות דלתא D הוא הזחה, וחדש הוא יחס פואסון הדגימות, השווה ל-0.4 עבור רקמת הריאה. כדי להעריך את איכות ההתאמה, חשב את ערך ה-SSR או את סכום הריבועים של ההפרש בין הנתונים לערכי ההתאמה במהלך התאמת העקומה הלא ליניארית.

בטל מדידות לא אמינות או בלתי ניתנות לפירוש על-ידי השלכת נתונים מעקומות גרועות עם ערכי SSR גדולים. אם תרצה, המר מודול אלסטי או E למודול שקוף. ז. שימוש בקשר E שווה פי שניים מהסכום של פעם אחת פלוס פעמים חדשות G.To לדמיין דפוסים מרחביים של קשיחות שנאספו במצב מפת כוח, לשרטט נתוני מודול ומפות קווי מתאר, למשל, ברשת של 16 על 16 המכסה שטח של 80 מיקרומטר על 80 מיקרומטר.

כדי לעבד כמות גדולה של נתוני עקומת כוח, ניתן לכתוב אלגוריתם מותאם אישית שיתאים אוטומטית לעקומות תזוזה של כוח, לחלץ מפות מתאר מודולריות ו/או עלילה או שתל ELA. באמצעות אותם נהלים ופרמטרים שתוארו זה עתה, איור זה מראה כי אני חותך ומכתים רקמות כראוי. המיקרו המכתשית של פרנכימת הריאה נשמרת היטב כפי שנצפה על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית לרכיב קרום הבסיס, למינין ללא קיבוע או חלחול.

לוחות אלה מראים צביעה אימונו-פלואורסצנטית לקולגן, אחד בריאות טריות לא מקובעות שנקטפו מעכברים שטופלו בעבר ב-PBS או טופלו בבליו מיצין כדי לגרום לפיברוזיס. עלילות תזוזה של כוח מדגם המתקבלות מכניסת מיקרו FM מוצגות כאן באותו כוח מופעל. קצה ה-A FM מייצר כניסה גדולה באזור רך וכתוצאה מכך עקומת תזוזה שטוחה יחסית המוצגת בכחול לעומת כניסה קטנה ועקומת תזוזה תלולה עבור אזור נוקשה יותר המוצג באדום.

על מנת להשיג עקומות כוח נקיות לאחר כל כניסה, יש לסגת לחלוטין מקצה ה- FM ממשטח הדגימה וללא מגע לפני הכניסה הבאה. מצב נטול מגע זה מתאים לאזור השטוח של העקומה שבו הקצה מתורגם ללא סטייה שלוחה. איור זה מציג עקומת שווא טיפוסית ללא אזור שטוח, המתרחשת כאשר הקצה אינו נסוג לחלוטין ממשטח הדגימה, כגון כאשר דגימה רכה מתחברת לקצה, מה שהופך את זה לבלתי אפשרי לקבוע את נקודת המגע אם הקצה לכוד לחלוטין בדגימה רכה.

העקומה עשויה להיראות כך ללא סטייה ברורה, אלא רעש קטן. נתון זה מראה נוקשות. נתונים שחולצו מעקומות תזוזה כפויה הוצגו מרחבית כמפות נוקשות המכונות שתל ELAs כאשר סולמות צבע עם שתל ELAs נוקשות מדגימים הבדלים בולטים בטווח ובהתפלגות של נוקשות הרקמות בפרנכימת ריאות רגילה ופיברוטית ושינויים מרחביים גדולים בנוקשות, במיוחד בתוך דגימת הריאה הפיברוטית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאפיין את הסביבה המכנית המקומית של פרנכימת ריאות על ידי מדידה ישירה של התכונות האלסטיות המקומיות של רקמת ריאה טרייה באמצעות עותק מיקרוסקופי של Atomic Force.