אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשתמש בצבעי מעקב אחר תאים כדי לכמת ישירות את היקף חלוקת התאים עבור תת-קבוצות שונות של תאים חיסוניים בתוך אוכלוסיות מורכבות. זה מושג על ידי תיוג ראשון של אוכלוסיית תאי האב בצבע פלואורסצנטי הידוע כנותן קישור יציב לחלבונים תאיים או לשילוב לא קוולנטי לתוך ממברנות תאיות למעקב אחר תאים מסומנים בצבע המגיבים למוני גירוי, צביעה בנוגדנים פלואורסצנטיים וניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית מאפשרת זיהוי תגובות דיפרנציאליות בין סוגי התאים החיסוניים המעניינים מעוררים, אך בקרות מעקב לא מוכתמות משמשות לקביעת עוצמת הקרינה הנמוכה ביותר של תאי הבת שניתן להבדיל מצבע מעקב אחר אוטופלואורסצנטי המסומן, אך לאחר מכן משתמשים בבקרות לא מגורה כדי לקבוע את עוצמת הקרינה שבה יתגלו התאים הלא מחולקים. גירוי מביא בדרך כלל לטווח רחב של עוצמות כאשר תאים המתרבים בתגובה נעשים עמומים יותר בהדרגה, אך אלה שאינם מגיבים אינם מגיבים.

בסופו של דבר, השימוש בתוכנת מידול שיא כדי להעריך את התדירות היחסית של התאים בדורות שונים יכול לאפשר השוואה כמותית של תגובות ההתפשטות על פני אוכלוסיות או גירויים שונים באמצעות מדדים כגון מדד התפשטות או תדירות מבשר. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו Tritiated, שילוב שלך או ביטוי KI 67, הוא שדילול DI מספק מדד ישיר לחלוקת תאים שניתן לשלב עם מדדים ציטומטריים אחרים של זרימת ME כמו אימונופנוטיפ וייצור ציטוקינים. הדגמה חזותית של שיטת צביעת צבע הממברנה מועילה מכיוון שקליטת הצבע על ידי התאים מהירה ביותר.

כתוצאה מכך, טכניקה טובה היא המפתח להשגת צביעה הומוגנית בהירה. לאחר בידוד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי למשך חמש דקות ב-300 פעמים G וטמפרטורת החדר כדי למזער את זיהום טסיות הדם. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-10 עד שבעה תאים למיליליטר ב-HBSS בתוספת 1% BSA, והניחו אותם על קרח.

הסר ושמור 500 מיקרוליטר Eloqua, ולאחר מכן העביר עוד 500 מיקרוליטר של תאים לתוך צינור פוליפרופילן חרוטי בגודל 12 על 75 מילימטר. הוסף 3.5 מיליליטר של HBSS וסובב את התאים למשך חמש דקות ב 400 פעמים G וטמפרטורת החדר במהלך הכביסה הוסף 0.5 מיליליטר של רכב תיוג C מדלל מערכת PKH 26 GL לצינור פוליפרופילן חרוטי נוסף בגודל 12 על 75 מיליליטר, שאב בזהירות את הסופר נטין והשאיר לא יותר מ -15 עד 25 מיקרוליטר של נוזל שיורי והקפיד לא להסיר תאים. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיליליטר של רכב תיוג C מדלל לגלולת התא ושאף והוציאו את התמיסה מספר פעמים כדי לקבל מתלה תא יחיד.

כעת הכינו את שני מלאי ה-XD על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של PKH 26 לצינור המכיל מדלל C.רק עכשיו פיפטה מיד את תרחיף התא לשני תמיסות צבע XPKH 26 שהוכנו טריים ובמקביל שאפו והוציאו את התערובת מספר פעמים כדי לפזר את התאים באופן אחיד בכל הצבע. לאחר דקה אחת, הוסף מיליליטר אחד של סרום מומת בחום כדי לעצור את ספיגת הצבע לקרומי התאים. לאחר סיבוב התאים שאבו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להסיר את הגלולה.

לאחר מכן פזרו את הגלולה בארבעה מיליליטר של מדיום שלם המכיל סרום מושבת חום של 10%, והעבירו את תרחיף התא לצינור פוליפרופילן טרי. שטפו את התאים פעמיים ב-HBSS בתוספת 1% BSA תאים מוכתמים כראוי יציגו גוון ורוד מובהק בגלולה לאחר החייאת כדור התא במיליליטר אחד HBSS בתוספת 1% BSA, ספרו את התאים ולאחר מכן התאימו את הנפח כדי לתת ריכוז סופי של 10 לתאים השביעיים למיליליטר. לאחר צביעת התאים על פי פרוטוקול הזרימה הציטומטרי המתואר בטבלה, השתמש בחמשת הצינורות הראשונים כדי להגדיר את פרמטרי הפיזור קדימה ופיזור הצד ואת האותות בכל ארבעת גלאי הקרינה.

במיוחד עבור הגלאי המשמש לניטור הקרינה PKH 26 בצינור שתיים. ודא שכל התאים המוכתמים PKH 26 מופיעים על הסולם כשיא סימטרי יחיד בעשור השלישי עד הרביעי עם מעט תאים או ללא תאים בערוץ האחרון. לאחר מכן, השתמש בתוכנת פיצוי הצבע ובקבצי מצב הרשימה שנאספו עבור צינורות 1 עד 5 כדי ליצור מטריצת חפיפת צבעים עבור כל פלורו בגלאים המשמשים לניטור שלושת הפלואורוכרומים האחרים.

לאחר מכן החל מטריצה זו על קובץ מצב הרשימה עבור דוגמה שש. לוודא שנוכחות תיוג PKH 26 אינה משנה את היכולת לזהות שבעה תאים חיוביים A a D. כעת החל את מטריצת חפיפת הצבעים שזה עתה הוקמה על קובץ מצב הרשימה עבור צינור שבע.

זהה את ה-CD שלושה חיוביים, ארבעה שליליים ו-CD שלושה חיוביים, ארבע אוכלוסיות חיוביות ב-FE לעומת PC. ודא שנוכחותם של אנטי CD שלוש, FE ואנטי CD ארבע A PC אינה משנה את היכולת לזהות שבעה תאים חיוביים A a D. לבסוף, החל את מטריצת חפיפת הצבעים עבור צינור שבע למצב הרשימה קובץ עבור צינור שמונה.

כעת פתח תוכנית המכילה מודול ניתוח התפשטות. טען את הקובץ המוכתם PKH 26 המגורה ממערך הנתונים לניתוח. לאחר מכן, בחר את הפרמטרים לניתוח במקרה זה, PKH 26 מגודר על תקליטור שלילי של שבעה a a d בר-קיימא, שלושה לימפוציטים חיוביים ופיזור קדימה לעומת פיזור צדדי להוצאת פסולת קטנה ואגרגטים גדולים.

בהגדרת אזורים אלה, הקפד לכלול את אזור הפיזור הקדמי הגבוה שבו נמצאים בדרך כלל פיצוצים. לאחר מכן, פתח את אשף ההפצה. לחץ על לשונית ההתחלה כדי לפתוח את קובץ הנתונים ולאחר מכן טען את הפקד החיובי PKH 26 הלא מגורה.

הגדר את המיקום של שיא ההורים המתאים לתאים לא מחולקים. נתח את הקובץ תוך ציון הערכים עבור מיקום ורוחב שיא הורים. אם רצוי רוחב שיא קבוע, בדוק נעילת SD טען את הבקרה השלילית P KH 26 והתאם את מספר הדורות על ידי הגדרת ערוץ השיא עבור דור הבת של דימוס מעל התאים השליליים PKH 26.

זה קובע את מספר דורות הבנות. הדגם יכול להתאים במדויק לאחר השלמתו. טען מחדש את הקובץ החיובי PKH 26 המגורה.

אם ניכרים שיאים דוריים הניתנים להבחנה, בחרו בקביעה הצפה תחת אפשרות הדגם. אם עשורי היומן אינם בדיוק 4.0, התאם את המרווח בין הדורות כפי שנדון במאמר. כעת, נתח את המדגם המגורה ואשר כי האזור למיקום השיא ההורי נותר ללא שינוי.

לבסוף, בחר נתח עבור כל קובץ ניסיוני במערך הנתונים להחלה. המודל רק יצר ורשם את מדדי הריבוי הרצויים הנובעים מההתאמה הטובה ביותר לכל קובץ ניסיוני במערך הנתונים. סדרת נתונים ראשונה זו ממחישה את השפעת טכניקת הערבוב על התפלגות הקרינה של PKH 26.

בתרבית, U 9 37 תאים מיאלואידים נצבעו בצבע מעקב אחר התאים בשיטה שתוארה זה עתה היסטוגרמה ראשונה זו מציגה את נתוני הבקרה הלא מוכתמים. הגדרות הציטומטר הותאמו כדי למקם את האוטופלואורסצנטיות מתאים אלה בעשור הראשון ללא תאים או מעט מאוד תאים שהצטברו בערוץ הראשון. היסטוגרמה שנייה זו ממחישה צביעה טובה של PKH 26.

ערבוב מהיר של שני תאי x עם שני צבעי x נתן התפלגות פלואורסצנטית בהירה, הומוגנית וסימטרית, אך לא היו לה תאים מחוץ לקנה המידה בהגדרות המכשיר ששימשו להיסטוגרמה הקודמת. כאשר נוספו שני תאי x לשני צבעי x ללא ערבוב מיידי, התקבלה התפלגות פלואורסצנטית הטרוגנית יותר. תת-אוכלוסייה קטנה זו של תאים המסומנים במעומעם תתפרש בטעות כתאי בת אם הם היו נוכחים בנקודת זמן מאוחרת יותר בהיסטוגרמה הסופית מניסוי זה, ערבוב לקוי התרחש גם כאשר שלושה מיקרוליטרים של מלאי צבע אתנול מרוכז נוספו בטעות ישירות ל-0.5 מיליליטר של שני תרחיפי תאי x שהניבו התפלגות עוצמת פלואורסצנטית עמומה מאוד ומוטה ימינה.

כאן תוצאות אופייניות מניסוי התפשטות שבו תאים חד-גרעיניים מוכתמים בדם היקפי PKH 20 תורבבו עם או בלי גירוי. מוצגים ריאגנטים נגד CD 3 ו-IL 2. לאחר 96 שעות של תרבית, התאים נאספו והוכתמו עם אנטי CD שלושה FE אנטי CD 19 A PC ושבעה A a d.

שתי אסטרטגיות שער שונות הושוו באסטרטגיית השער הראשונה, תרשים נקודות של CD שלוש לעומת שבע. A A D שימש לבחירת שבע a a d CD שלילי שלושה תאי T חיוביים. לאחר מכן נעשה שימוש באזור פיזור קדימה וצדדית כדי להוציא אגרגטים גדולים תוך הכללת לימפוציטים מתפוצצים.

האירועים הסגורים R אחד ועוד R עבור הבקרה הלא מוכתמת מיוצגים על ידי ההיסטוגרמה האפורה והתאים הצבועים PKH 26, אך לא מגורים הם בתו כחול, הצביעה ההומוגנית הסימטרית הבהירה עבור תאי T ברי קיימא אך לא מחולקים בבקרה הלא מגורה. נתונים אלה היו מגודרים באותו אופן כמו האיור הקודם, אך במקרה זה, התאים היו מגורים עם אנטי CD 3 ו-IL 2. ההיסטוגרמה PKH 26 עבור R אחד ועוד R שני אירועים מגודרים מכילה כעת בעיקר תאים מחולקים עם עוצמה מופחתת המיוצגת על ידי פסגות צבעוניות עבור כל דור בת.

למרות שכמה תאים בהירים לא מחולקים עדיין נשארים בפסגת ההורים הכחולה. שימו לב שעוצמת התאים המחולקים מאוד עדיין אינה חופפת לאזור בו נמדדים תאים לא מוכתמים, מה שיבלבל את הערכת המדדים המבוססת על מספר התאים בדורות הבת בעוצמה הנמוכה ביותר כאן. אותם נתונים נותחו כמו שתי קבוצות האיורים הקודמות, אך רק פיזור אור ו-CD 3 שימשו לבחירת תאי T ברי קיימא.

אסטרטגיית שער זו אינה כוללת רבים, אך לא את כולם, התאים המתים כפי שמודגם על ידי האוכלוסייה השיורית הקטנה של שבעה תאים מתים חיוביים A a D שנותרו ב- CD שלוש לעומת שבע עלילות נקודות A A D. הבחירה בפלואורוכרומים המשמשים לאימונופנוטיפ עלולה ליצור בעיות פיצוי מאתגרות בעת שימוש במעקב אחר תאים מכיוון שעוצמת הצביעה של תאים לא מחולקים בהירה ביותר. בניסוי זה, תאים חד-גרעיניים בדם היקפי בני 24 שעות סומנו ב-PKH 26 ולאחר מכן כתם נגדי עם נוגדנים ל-CD 3 ו-CD 4 בתוספת צבע חי

בסדרת נתונים זו, התאים המסומנים בשני PKH 26 מיקרומולריים היו כתם נגדי עם אנטי CD שלושה FZ שבע A A D, ואנטי CD ארבעה A PC, ולאחר מכן נותחו באמצעות אותה אסטרטגיית שער R אחד ועוד R שני כמו קודם, מכיוון שיש מעט חפיפה של PKH 26 לערוץ A PC, CD 4 אירועים חיוביים ושליליים נפתרו בבירור בין אם הוחל פיצוי ובין אם לאו. נתונים אלה ממחישים כיצד ה-CD הבר-קיימא שלושה תאי CD חיוביים וארבעה תאי T חיוביים נשארו פתורים היטב גם כאשר ריכוז ה-PKH 26 הסופי הוגדל לארבע מיקרומולר. השימוש באנטי CD ארבע לכל CP בשילוב עם אנטי CD 3 FE שני מיקרו-מולרי PKH 26 והכדאיות ל-pro 3 נתן תוצאות גרועות בהרבה עקב חפיפה משמעותית של PKH 26 לערוץ לכל CP.

CD ארבעה תאים חיוביים ושליליים לא ניתן היה לפתור זה מזה בנתונים ללא פיצוי ונפתרו רק באופן שולי כאשר הוחל פיצוי. הגדלת הריכוז הסופי של PKH 26 לארבעה מיקרו-מולרים הביאה לאובדן מוחלט של היכולת לפתור CD 4 חיובי מ-CD 4 אירועים שליליים גם לאחר החלת הפיצוי. שימו לב כיצד הדגימות הכוללות או חסרות אנטי CD 4 לכל CP היו זהות במהותן.

כאשר פרופיל דילול צבע מנותח באמצעות תוכנת מידול שיא כדי להעריך את תדירות התאים בדורות בת עוקבים, מיקומים ו/או רוחבים של שיאי בת עוקבים יכולים להיות קבועים או צפים. ביחס לערכים לשיא ההורי. ערכים אלה מוערכים מהבקרה הלא מגורה.

לדוגמה, פרופיל עוצמת PKH 26 זה הוא מתרבית לא מגורה של 96 שעות ממגיב מתון ושימש כדי לספק לאשף התפשטות התאמת המוד את האומדן הראשון של מיקום ורוחב עבור השיא המייצג תאי הורים לא מחולקים. שימוש בהגדרה קבועה למיקום שיא דורש שהממוצע עבור כל שיא דורי יהיה בדיוק מחצית מעוצמת הקרינה של השיא הקודם. הגדרת ציפה למיקום שיא מאפשרת למיקומים הסופיים של פסגות הדורות להשתנות מהעוצמות הצפויות לפי הצורך כדי להשיג את ההתאמה הטובה ביותר.

באופן דומה, הגדרה קבועה לרוחב שיא דורשת שהרוחב של כל שיא דורי יהיה זהה לזה של שיא הבקרה ההורי או הלא מגורה. הגדרת ציפה לרוחב שיא מאפשרת לשנות את הרוחב הסופי באופן עצמאי לפי הצורך כדי להשיג את ההתאמה הטובה ביותר בטבלה זו. תוצאות הניתוח של הנתונים הקודמים עבור שני תורמים שונים מוצגות עבור תורמים אלה שבהם ניכרים שיאים דוריים מובחנים.

ערכי הצ'י הריבועיים המופחתים הטובים ביותר הושגו כאשר גם מיקום השיא וגם הרוחב הורשו לצוף עבור פרופילי התפשטות שבהם לא ניכרים שיאי דורות ניתנים להבחנה, מומלצת הגדרה קבועה למיקום שיא. נתונים אלה ממחישים את השימוש בשני צבעי מעקב כדי לנטר בנפרד את היסטוריית ההתפשטות של סוגי תאים חיסוניים שונים בבדיקת דיכוי חיסוני ציטומטרי זרימה. תאי אפקטור T המוצגים בירוק סומנו עם CFSE ותאי רגולציה T המוצגים בכחול סומנו בתצוגת תא.

אוכלוסיות תאים עם תווית קלארט עורבבו ביחסים משתנים ותרבו בנוכחות תאי אנטי CD 3, אנטי CD 28 ותאי עזר מוקרנים במשך 96 שעות. לאחר מכן, התאים נאספו ונצבעו באנטי CD 4, PE בגודל 7 וסגול מת חי. הנה. נתונים מייצגים עבור יחס אפקטור treg ל-T של 0.25 ל-1 מוצגים לאחר הוצאת תאים חיוביים סגולים מתים חיים.

הוחל שער פיזור אור שכלל לימפוציטים ופיצוץ, אך לא כולל אגרגטים ופסולת, ואחריו שער שכלל אירועים חיוביים ל-CD. צביעת קלארט בתצוגת תא אפשרה להבחין בקלות בין תאי טרג ברי קיימא לבין תאי אפקטור T ברי קיימא שהיו מרובים מאוד ולכן פרופילי התפשטות CFSE DIM עבור תאי אפקטור T חיוביים של CFSE ותאי Treg חיוביים לתצוגת תאים נותחו באמצעות תוכנת מידול שיא של mod fit. נותחו כ-25,000 אירועים.

מתוכם 48% היו אפקטורים ברי קיימא של T 6% היו רגטורי T ברי קיימא והשאר היו תאים מתים, תאים נלווים ופסולת. מדד ההתפשטות המחושב, המשקף את הגידול במספר התאים במהלך תקופת הבדיקה היה 3.85 עבור אפקטורים מסוג T ו-1.83 עבור Tregs. כאן, מוצגת ההשפעה של ריכוז תאי ה-tregs על מדד ההתפשטות של תאי אפקטור T המחושבים מפרופיל דילול הצבע של CFSE.

התוצאות היו זהות, בין אם תאי ה-treg סומנו עם קלרט תצוגה תאית או הושארו ללא צביעה, מה שמצביע על כך שתפקוד ה-treg לא השתנה על ידי צביעה. עם מעקב כצפוי, היקף התפשטות הטקטור גדל ככל שריכוז תאי הטרג ירד. מדדי התפשטות תאי Treg חושבו גם מפרופילי דילול צבע קלארט view ביחסי אפקטור שונים של treg ל-T.

כצפוי, ה-Tregs עברו התפשטות מינימלית בהיעדר תאי אפקטור T ככל שריכוז תאי אפקטור T גדל. עם זאת, היקף התפשטות תאי הטרג גדל גם הוא. לאחר צפייה בסרטון, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בהצלחה בצבעי מעקב אחר תאים כדי לנטר את התפשטות התאים, כיצד לבחור פלואורוכרומים מתאימים ובקרות פיצוי צבע, וכיצד לבחור מודל מתאים לכימות חלוקת תאים על סמך דילול צבע.

יחד עם הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כדי לענות על שאלות ניסיוניות כגון צביעת תאי T ספציפיים לאנטיגן או מיון זרימה לשחזור תאים דמויי גזע שקטים או מתחלקים לאט. תודה רבה על הצפייה.