אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

המטרה הכללית של שיטה זו היא להשתמש בצבעי מעקב אחר תאים כדי לכמת באופן ישיר את היקף חלוקת התאים עבור תתי-אוכלוסיות שונות של תאי מערכת החיסון בתוך אוכלוסיות מורכבות. מטרה זו מושגת תחילה על ידי סימון אוכלוסיית תאי האב בצבע פלואורסצנטי הידוע כבעל קישור יציב לחלבונים תאיים או ככזה המשתלב באופן לא קוולנטי בממברנות תאיות למעקב אחר תאים מסומנים בצבע המגיבים לגירוי. סימון בנוגדנים פלואורסצנטיים וניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית מאפשרים זיהוי של תגובות דיפרנציאליות בין סוגי תאי החיסון המגורים הרלוונטיים; עם זאת, נעשה שימוש בביקורות שאינן צבועות בצבע המעקב כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנציה הנמוכה ביותר של תאי בת שניתן להבחין בינה לבין אוטופלואורסצנציה. לאחר מכן, נעשה שימוש בביקורות שסומנו בצבע המעקב אך לא עברו גירוי, כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנציה שבה יזוהו התאים שאינם מחולקים. גירוי מוביל בדרך כלל לטווח רחב של עוצמות, שכן תאים השכפילים כמענה לגירוי הופכים לעמומים יותר ויותר, בעוד שתאים שאינם מגיבים אינם משתנים כך.

בסופו של דבר, שימוש בתוכנה למידול שיאים להערכת התדירות היחסית של התאים בדורות שונים מאפשר השוואה כמותית של התגובות הפרוליפרטיביות בין אוכלוסיות או גירויים שונים, תוך שימוש במדדים כגון אינדקס פרוליפרציה או תדירות תאי קדמון. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שילוב טריטיום בתיירוסין או ביטוי של KI 67, הוא שדילול ה-DI מספק מדד ישיר לחלוקת תאים, אותו ניתן לשלב עם מדידות ציטומטריות אחרות של זרימה, כגון אימונופנוטיפיזציה וייצור ציטוקינים. הדגמה חזותית של שיטת הצביעה בצבע ממברנה היא מועילה, שכן ספיגת הצבע על ידי התאים מהירה ביותר.

כתוצאה מכך, טכניקה נכונה היא המפתח להשגת צביעה בהירה והומוגנית. לאחר בידוד תאים חד גרעיים מדם פריפריאלי אנושי, סבב במצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-300 ×g ובטמפרטורת החדר כדי למזער זיהום של טסיות דם. לאחר מכן, השהה את המשקע בריכוז של 10⁷ תאים למיליליטר ב-HBSS בתוספת 1% BSA, והנח אותם על קרח.

הסיר ושמור מנה (aliquot) של 500 µL, ולאחר מכן העבר מנה נוספת של 500 µL של תאים לפרועת פוליפרופילן קונית בנפח 12x75 mm. הוסף 3.5 mL של HBSS וסבב את התאים במשך חמש דקות ב-400 ×g ובטמפרטורת החדר; במהלך השטיפה, הוסף 0.5 mL של diluent C labeling vehicle מהערכה PKH 26 GL לפרועת פוליפרופילן קונית נוספת בנפח 12x75 mm. שאב בזהירות את העל-נוזל (supernatant), כך שיישאר לא יותר מ-15 עד 25 µL של נוזל שיורי, תוך הקפדה לא להסיר תאים. לאחר מכן, הוסף 0.5 mL של diluent C labeling vehicle למשקע התאים, שאב והזרק את התמיסה מספר פעמים כדי לקבל סספנסיית תאים בודדים.

כעת הכינו את תמיסת המקור של XD בריכוז 2X על ידי הוספת 2 µL של PKH 26 למבחנה המכילה את מדלל C. רק כעת העבירו מיד בעזרת פיפטה את תרחיף התאים לתוך תמיסת הצבע PKH 26 בריכוז 2X שהוכנה זה עתה, ובמקביל שאבו והזרה את התערובת מספר פעמים כדי לפזר את התאים באופן אחיד בתוך הצבע. לאחר דקה אחת, הוסיפו 1 mL של סרום שעבר אינאקטיבציה תרמית כדי לעצור את ספיגת הצבע לממברנות התאים. לאחר סבוב התאים בצנטריפוגה, שאבו בזהירות את הנוזל העליון מבלי להסיר את המשקע.

לאחר מכן, פזרו את המשקע בארבעה מיליליטרים של מצע מלא המכיל 10% סרום שעבר אינוקטיבציה תרמית, והעבירו את תרחיף התאים לפרופילן פוליפרופילן נקי. שטפו את התאים פעמיים ב-HBSS בתוספת 1% BSA; תאים שנצבעו כראוי יראו גוון ורוד מובחן במשקע. לאחר השהיה מחדש של משקע התאים במיליליטר אחד של HBSS בתוספת 1% BSA, ספרו את התאים ואז התאימו את הנפח כדי להגיע לריכוז סופי של 10⁷ תאים למיליליטר. לאחר צביעת התאים לפי פרוטוקול ציטומטריית הזרימה המפורט בטבלה, השתמשו בחמשת השפופרות הראשונות כדי להגדיר את פרמטרי ה-forward scatter וה-side scatter ואת האותים בכל ארבעת גלאי הפלואורסצנציה.

במיוחד עבור הגלאש המשמש לניטור הפלורסצנציה של PKH 26 במבחנה שתיים. ודאו שכל התאים הצבועים ב-PKH 26 מופיעים בסולם כפסגה סימטרית אחת בעשור השלישי עד הרביעי, עם מעט תאים או ללא תאים בערוץ האחרון. לאחר מכן, השתמשו בתוכנת פיצוי הצבע (color compensation) ובקבצי מצב הרשימה (list mode) שנאספו עבור מבחנות אחת עד חמש, כדי לבסס מטריצת חפיפת צבעים עבור כל פלואורו בגלאשים המשמשים לניטור שלושת הפלואורוכרומים האחרים.

לאחר מכן, החילו מטריצה זו על קובץ ה-list mode עבור דגימה שש. כדי לוודא שנוכחות של סימון PKH 26 אינה משנה את היכולת לזהות תאים חיוביים ל-seven A a D. כעת, החילו את מטריצת חפיפת הצבעים שהוקמה זה עתה על קובץ ה-list mode עבור מבחנה שבע.

זהו את האוכלוסיות CD3 חיוביות CD4 שליליות ואת האוכלוסיות CD3 חיוביות CD4 חיוביות בגרף של FE מול PC. אשר כי נוכחותם של anti-CD3, FE ו-anti-CD4 A PC אינה משנה את היכולת לזהות תאים חיוביים ל-7 A a D. לבסוף, החל את מטריצת חפיפת הצבעים עבור מבחנה 7 על קובץ מצב הרשימה (list mode file) עבור מבחנה 8.

כעת פתחו תוכנה הכוללת מודול לניתוח proliferatio. טענו את הקובץ של תאי ה-PKH 26 שעברו גרייה מתוך מערך הנתונים המיועד לניתוח. לאחר מכן, בחרו את הפרמטרים לניתוח במקרה זה: PKH 26 עם gating של לימפוציטים חיים, seven a a d negative ו-cd3 positive, וכן forward scatter מול side scatter לצורך הדרת שברים קטנים ואגרגטים גדולים.

בעת הגדרת אזורים אלו, הקפידו לכלול את אזור הפיזור הקדמי (forward scatter) הגבוה, שבו נמצאים בדרך כלל התאים העוברים בלאסטים. לאחר מכן, פתחו את אשף השכפול (proliferation wizard). לחצו על לשונית ההתחלה כדי לפתוח את קובץ הנתונים ולאחר מכן טענו את בקרת החיוביות של PKH 26 ללא גירוי.

הגדירו את מיקום שיא ההורה (parental peak) המתאים לתאים שאינם מחולקים. נתחו את הקובץ תוך רישום הערכים עבור מיקום ורוחב שיא ההורה. אם נדרש רוחב שיא קבוע, סמנו lock SD, טענו את בקרת השלילה של PKH 26 וכווןנו את מספר הדורות על ידי קביעת ערוץ השיא עבור דור הבת הדו-מימות (dimus) מעל התאים של בקרת השלילה של PKH 26.

שלב זה קובע את מספר דורות הבת. המודל יכול להתאים באופן מדויק עם השלמת התהליך. טען מחדש את הקובץ של תאי PKH 26 חיוביים שעברו גרייה.

אם ניכרים שיאים דוריים שניתן להבדיל ביניהם, בחרו בהגדרת ה-floating תחת אפשרויות המודל. אם עשרונות הלוגריתם אינם בדיוק 4.0, התאימו את המרווח הדורי כפי שנדון במאמר. כעת, נתחו את הדגימה המעוררת ואשרו כי האזור של מיקום השיא ההורי נותר ללא שינוי.

לבסוף, בחרו באפשרות analyze עבור כל קובץ ניסויי בסט הנתונים כדי להחיל את המודל שנוצר כעת, והקליטו את מדדי השגשוג הרצויים שמתקבלים מההתאמה הטובה ביותר (best fit) עבור כל קובץ ניסויי בסט הנתונים. סדרה ראשונה זו של נתונים מדגימה את ההשפעה של טכניקת הערבוב על התפלגויות פלורסצנציית PKH 26.

בזמן תרבית, תאי מיאלואיד U 9 37 נצבעו בצבע למעקב אחר תאים בשיטה שתוארה זה עתה; היסטוגרמה ראשונה זו מציגה את נתוני הביקורת ללא צביעה. הגדרות הציטומטר הותאמו כך שהפלוורסצנציה העצמית של תאים אלו תמוקם בעשור הראשון, כאשר אין תאים או שיש מעט מאוד תאים המצטברים בערוץ הראשון. היסטוגרמה שנייה זו ממחישה צביעת PKH 26 טובה.

ערבוב מהיר של תאי 2x עם צבע 2x הניב התפלגות פלואורסצנציה בהירה, הומוגנית וסימטרית, אך ללא תאים שחרגו מהסולם בהגדרות המכשיר ששימשו להיסטוגרמה הקודמת. כאשר תאי 2x נוספו לצבע 2x ללא ערבוב מיידי, התקבלה התפלגות פלואורסצנציה הטרוגנית יותר. תת-אוכלוסייה קטנה זו של תאים המסומנים בעמימות הייתה מפורשת באופן שגוי כתאי בת אילו היו נוכחים בנקודת זמן מאוחרת יותר בהיסטוגרמה הסופית של ניסוי זה; ערבוב לקוי התרחש גם כאשר 3 µL של תמיסת סטוק מרוכזת של צבע אתנול נוספו בטעות ישירות ל-0.5 mL של ת сусפנזיה של תאי 2x, מה שהוביל להתפלגות עוצמת פלואורסצנציה עמומה ביותר ובעלת הטיות ימינה.

כאן מוצגים תוצאות טיפוסיות מניסוי פרוליפרציה, שבו תאי דם פריפריים מונונוקליאריים אנושיים שצבעו ב-PKH 20 תורגדו עם או בלי רכיבים מעוררים: Anti CD three ו-IL two. לאחר 96 שעות של תרבית, התאים נאספו ונצבעו בצביעה משלימה עם anti CD three FE, anti CD 19 A PC ו-seven A a d.

שתי אסטרטגיות שער (gating) שונות הושוו; באסטרטגיית השער הראשונה, נעשה שימוש בתרשים פיזור (dot plot) של CD3 לעומת 7-AAD כדי לבחור תאי T חיים, שליליים ל-7-AAD וחיוביים ל-CD3. לאחר מכן, נעשה שימוש באזור של פיזור קדמי (forward scatter) ופיזור צדי (side scatter) כדי להסיר אגרגטים גדולים, תוך השארת לימפוציטים בבליסטה (blasting lymphocytes).

האירועים שעברו סינון ב-R1+R2 עבור בקרת הביקורת ללא צבע מיוצגים על ידי ההיסטוגרמה האפורה, והתאים שנצבעו ב-PKH 26 אך לא עברו סטימולציה מיוצגים בכחול; שימו לב לצביעה הסימטרית, ההומוגנית והבהירה של תאי T חיים אך לא מחולקים בבקרת הביקורת ללא סטימולציה. נתונים אלו סוננו באופן דומה לדמות הקודמת, אך במקרה זה, התאים עברו סטימולציה באמצעות anti-CD3 ו-IL-2. היסטוגרמת ה-PKH 26 עבור אירועים שעברו סינון ב-R1+R2 מכילה כעת בעיקר תאים מחולקים בעלי עוצמה מופחתת, המיוצגים על ידי פסגות צבעוניות עבור כל דור של תאי בת.

למרות שחלק מהתאים הבהירים שטרם התחלקו עדיין נשארים בשיא ההורה הכחול. שימו לב כי העוצמה של התאים שעברו חלוקות רבות עדיין אינה חופפת לאזור שבו נמדדים תאים שאינם צבועים, דבר שעלול לשבש את הערכת המדדים המבוססת על מספר התאים בדורות הבתים בעלי העוצמה הנמוכה ביותר כאן. אותם נתונים נותחו כפי שנעשה בשתי מערכות האיורים הקודמות, אך נעשה שימוש רק בפיזור האור (light scatter) וב-CD3 כדי לבחור תאי T חיים.

אסטרטגיית בחירה (gating) זו מוציאה רבים, אך לא את כל התאים המתים, כפי שניתן לראות מהאוכלוסייה השארית הקטנה של תאים מתים חיוביים ל-7-AAD שנותרה בתרשימי הפיזור של CD3 לעומת 7-AAD. הבחירה בפלואורוכרומים המשמשים לאימונופנוטיפציה עלולה ליצור בעיות פיצוי (compensation) מאתגרות בעת שימוש בצבעי מעקב אחר תאים, מכיוון שעוצמת הצביעה של תאים שלא חולקו היא בהירה מאוד. בניסוי זה, תאים חד גרעיים של דם פריפריאלי (PBMC) בני 24 שעות סומנו ב-PKH26 ולאחר מכן נצבעו עם נוגדנים ל-CD3 ול-CD4 בתוספת צבע לבדיקת חיות.

בסדרת נתונים זו, התאים שסומנו עם 2 µM PKH 26 נצבעו בצביעה משלימה עם anti-CD3 FITC ו-anti-CD4 APC, ולאחר מכן נותחו באמצעות אותה אסטרטגיית gating של R1+R2 כפי שנעשה קודם לכן. מכיוון שישנה חפיפה מועטה של PKH 26 לערוץ ה-APC, אירועים חיוביים ושליליים ל-CD4 הופרדו בבירור, ללא קשר לשאלה האם הוחל פיצוי (compensation). נתונים אלה ממחישים כיצד תאי T חיוביים ל-CD3 וחיוביים ל-CD4 בריאים נותרו מופרדים היטב גם כאשר ריכוז ה-PKH 26 הסופי הועלה ל-4 µM. השימוש ב-anti-CD4 PerCP בשילוב עם anti-CD3 FITC, 2 µM PKH 26 וצבע הבריאות 7-AAD, נתן תוצאות גרועות בהרבה בשל חפיפה משמעותית של PKH 26 לערוץ ה-PerCP.

לא ניתן היה להבדיל בין תאים חיוביים לשליליים ל-CD4 בנתונים ללא פיצוי (uncompensated data), והם הובחנו באופן חלקי בלבד לאחר החלת פיצוי. הגדלת הריכוז הסופי של PKH 26 לארבעה micromolar הובילה לאובדן מוחלט של היכולת להבדיל בין אירועים חיוביים לשליליים ל-CD4, גם לאחר החלת פיצוי. שימו לב כי הדגימות שכללו או היו חסרות anti-CD4 לכל CP היו זהות במהותן.

בעת ניתוח פרופיל דילול של צבע באמצעות תוכנה למידול פסגות כדי להעריך את תדירות התאים בדורות בנות עוקבים, ניתן לקבוע את המיקומים ו/או הרוחבים של פסגות הבנות העוקבות כקבועים או כצפים, ביחס לערכים של פסגת ההורה. ערכים אלו מוערכים מתוך בקרת השלילה ללא גירוי.

לדוגמה, פרופיל עוצמה של PKH 26 זה לקוח מתרבית של 96 שעות ללא גירוי של מגיב בינוני, ושימש כדי לספק לאשף ההתאמה של השגשוג (mod fit proliferation wizard) את האומדן הראשוני של המיקום והרוחב עבור השיא המייצג תאים הוריים שלא התחלקו. שימוש בהגדרה קבועה (fixed setting) למיקום השיא מחייב שהממוצע עבור כל שיא דורי יהיה בדיוק מחצית מעוצמת הפלואורסצנציה של השיא הקודם. הגדרה צפה (float setting) למיקום השיא מאפשרת למיקומים הסופיים של השיאים הדוריים להשתנות מהעוצמות הצפויות ככל שנדרש כדי להגיע להתאמה מיטבית.

באופן דומה, הגדרה קבועה (fixed) לרוחב השיא דורשת שרוחבם של כל שיאי הדורות יהיה זהה לרוחב השיא של ההורה או של ביקרת הבקרה ללא גירוי. הגדרה צפה (float) לרוחב השיא מאפשרת לרוחבים הסופיים להשתנות באופן עצמאי לפי הצורך כדי להשיג את ההתאמה הטובה ביותר בטבלה זו. תוצאות הניתוחים של הדמויות הקודמות עבור שני תורמים שונים מוצגות עבור תורמים אלו, שבהם נצפו שיאי דורות ניתנים להבחנה.

ערכי הצ'י-ריבוע המופחתים הטובים ביותר התקבלו כאשר הן מיקום השיא והן הרוחב הושארו חופשיים; עבור פרופילי שגשוג שבהם שיאי דורות מובחנים אינם ניכרים, מומלץ להשתמש בהגדרה קבועה עבור מיקום השיא. נתונים אלו ממחישים את השימוש בשני צבעי מעקב לניטור נפרד של היסטוריית השגשוג של סוגים שונים של תאי מערכת החיסון בבדיקת דיכוי חיסוני באמצעות ציטומטריית זרימה. תאי T effector המוצגים בירוק סומנו ב-CFSE ותאי T regulatory המוצגים בכחול סומנו ב-cell view.

אוכלוסיות תאים המסומנות ב-Claret עורבבו ביחסים משתנים ותורבדו בנוכחות anti CD 3, anti CD 28 ותאי עזר שהוקרנו למשך 96 שעות. לאחר מכן, התאים נאספו ונצבעו ב-anti CD 4, PE size 7 ו-live dead violet. כאן מוצגים נתונים מייצגים עבור יחס של 0.25 ל-1 בין treg ל-T effector, לאחר סינון (gating) של תאים חיוביים ל-live dead violet.

הוחל שער של פיזור אור (light scatter gate) שכלל לימפוציטים ובלסטים, אך הוציא אגרגטים ושאריות, ולאחריו שער שכלל אירועים חיוביים ל-CD4. צביעה ב-Cell View Claret אפשרה להבחין בקלות בין תאי treg חיים לבין תאי T אפקטוריים חיים שהיו בשלב של פרוליפרציה גבוהה, ולכן נותחו פרופילי פרוליפרציה של CFSE DIM עבור תאי T אפקטוריים חיוביים ל-CFSE ותאי treg חיוביים ל-Cell View Claret באמצעות תוכנת מידול ModFit Peak. נותחו כ-25,000 אירועים.

מתוך אלו, 48% היו תאי T אפקטורים חיוניים, 6% היו תאי T רגולטוריים (T regs) חיוניים, והשאר היו תאים מתים, תאי עזר ושאריות תאים. מדד הפרוליפרציה שחושב, המשקף את פי ההגדלה במספר התאים במהלך תקופת הבדיקה, היה 3.85 עבור תאי T אפקטורים ו-1.83 עבור תאי Tregs. כאן מוצגת ההשפעה של ריכוז תאי ה-tregs על מדד הפרוליפרציה של תאי T אפקטורים, כפי שחושב מפרופיל דילול צבע ה-CFSE.

התוצאות היו זהות, בין אם תאי ה-treg סומנו ב-cell view claret ובין אם הותירו ללא צביעה, מה שמעיד על כך שפונקציית ה-treg לא הושפעה מהצביעה. כפי שניתן היה לצפות מהמעקב, מידת התרבויות של תאי ה-tector עלתה ככל שריכוז תאי ה-treg פחת. מדדי התרבויות של תאי treg חושבו גם הם מפרופילי דילול של צבע cell view claret ביחסים שונים של treg לתאי T effector.

כצפוי, תאי ה-Tregs עברו פרוליפרציה מינימלית בהיעדר תאי T effector ככל שריכוז תאי ה-T effector עלה. עם זאת, גם מידת הפרוליפרציה של תאי ה-treg עלתה. לאחר צפייה בסרטון, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בהצלחה בצבעי מעקב אחר תאים כדי לנטר פרוליפרציה של תאים, כיצד לבחור פלואורוכרומים ובקרות פיצוי צבע מתאימות, וכיצד לבחור מודל מתאים לכימות חלוקת תאים על בסיס דילול הצבע.

בנוסף להליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כדי לענות על שאלות ניסיוניות, כגון צביעה של תאי T ספציפיים לאנטיגן או מיון בזרימה (flow sorting) לשחזור של תאים דמויי גזע שנמצאים במצב של רדימה או מתחלקים באיטיות. תודה רבה על הצפייה.