Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק נשא (transporter) היציב מספיק עבור מחקרים מבניים, ולהשתמש בנשא משונה זה להפקת גבישים המעבירים דיפרקציה ברזולוציה גבוהה באמצעות קריסטלוגרפיית קרני X. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית, כגון כיצד לפתור את המבנה של חלבוני ממברנה המהווים יעדים תרופתיים חשובים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לבחור קונפורמציה קשורה לתרופה באמצעות בדיקה תפקודית (functional assay).

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מובילי מוליכים עצביים, ניתן להחיל אותה גם על רצפטורים, תעלות וחלבונים מסיחים, הקושרים מולקולות קטנות בעוצמה גבוהה. השביה היטב תאי HEK293S GnTI minus שעברו טיפול בטריפסין ב-DMEM מועשר ב-10% fetal bovine serum, עד לצפיפות של 0.5 מיליון תאים למיליליטר, בתוך מיכל פיפטה חד-פעמי. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 100 microliters של תאים לכל באר בלוח מצופה poly-D-lysine.

יש לסבב את התאים במכל הפיפטה לאחר מילוי כל פלטה כדי להבטיח התפלגות אחידה של התאים. דגרו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius עם 8%carbon dioxide. החליפו את מצע התאים שעה אחת לפני התראנסווקציה.

הכינו את קומפלקסי ריאגנט הטרנסווקציה של ה-DNA על ידי ערבוב של 450 nanograms של DNA עם 45 microliters של DMEM נטול סרום עבור כל קונסטרקט ברקע ה-cert TC שייבדק. לאחר מכן, הוסיפו 1.6 microliters של ריאגנט הטרנסווקציה ל-45 microliters של DMEM נטול סרום וערבבו. הוסיפו מיד את תמיסת ריאגנט הטרנסווקציה המדוללת לתמיסת ה-DNA וערבבו.

אין לערבב את התמיסות בסדר הפוך. המתן 10 עד 15 דקות לפני הוספת 20 µL מתערובת ה-DNA של ריאגנט הטרנסווקציה לארבעה מהבארים. דגרי את התאים עם 200 nM citalopram ו-25 µL של TBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

כדי להמיס את התאים, הוסף 25 µL של C12M בריכוז 8 mM, CHS בריכוז 1 mM, ותערובת מעכבי פרוטאז ב-TBS. הדגר את התאים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף לשלושה בארות עבור כל מבנה (construct) 50 µL של TBS המכיל citalopram טריטיומי בריכוז 20 nM, 0.1% bovine serum albumin ומיליגרמים למילליטר של חרוזי SPA (scintillation proximity assay) עם affinity ל-his tag.

עבור הבאר האחרונה, הוסף את אותו תמיסת TBS, אך הוסף לה 100 micromolar של sertraline כדי לקבוע קישור לא ספציפי. ודא שחרוזי ה-SPA בעלי זיקה ל-his tag מעורבבים היטב בעת הוספתם ללוח 96 הבארים. מדוד את הקישור של citalopram טריטיומי באמצעות מונה סינפילציה של 96 בארים בטמפרטורת החדר, עם זמן ספירה של דקה אחת לכל באר.

המשיכו בספירת הפלטות עד לספירה כוללת המגיעה לרמה קבועה (plateau) לאחר כ-36 שעות. לאחר המדידה, חממו את הפלטות למשך 15 דקות בבלוק חימום בעל מכסה מחומם בטמפרטורה של 33 °C. מדדו שוב את קישור ה-citalopram המסומן בטריטיום לאחר החימום.

חזור על שלבים אלו עם שינוי בשלב החימום. התאם את טמפרטורות החימום בהתאם לטמפרטורת ההמסה הנראית של חלבון המטרה וליציבות התרמית של המבנה היציב ביותר. המשך לחמם את הפלטות עד שכל המבנים יראו ספירה סגולית נמוכה.

גדלו תאי HEK293S GnTI minus בתליה בטמפרטורה של 37 °C עם 8% carbon dioxide ו-85% humidity על שייקר במהירות של 130 RPM ובמצע גידול 293 expression media בתוספת 2% fetal bovine serum. הדביקו 10 ליטרים של התאים עם נגיף P2 בריבוי הדבקה (MOI) של 2 ובצפיפות של שלושה מיליון תאים למיליליטר. 12 עד 16 שעות לאחר ההדבקה, הוסיפו sodium butyrate לריכוז של 10 millimolar מתוך תמיסת מקור בריכוז one molar.

48 עד 60 שעות לאחר ההדבקה, קצרו את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-4,000 ×g למשך 15 דקות. הסירו את הנוזל העליון. השעיקו מחדש את התאים ב-150 milliliters של TBS עם 2 micromolar escitalopram או מעכבי SERT אחרים.

את התאים מ-10 ליטרים של תרבית במים חמימים בטמפרטורה של כ-30 מעלות צלזיוס, ושחזר אותם על ידי העברה מהירה של התאים דרך פיפטה של 10 מיליליטר עד להומוגניות. העבר את כל התאים לכלי זכוכית (beaker) עם מוט ערבוב, והוסף את כל תמיסת הדטרגנט לתאים תוך כדי ערבוב. המס את התאים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת עם ערבוב.

סבבו את הליזט במהירות של 8,000 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C. העבירו את supernatant למבחנות אולטרה-צנטריפוגה נקיות והשליכו את המשקע (pellet). לאחר מכן, סבבו את ה-supernatant במהירות של 100,000 ×g למשך שעה אחת באולטרה-צנטריפוגה.

לאחר סבב אולטרה-צנטריפוגה, סננו את הנוזל העליון דרך פילטר של 0.2 מיקרון והשליכו את המשקע. לאחר מכן, העבירו את הליזאט דרך 10 מיליליטר של שרף זיקה לסטרפ (strep affinity resin) הארוז בעמודה באמצעות משאבה פריסטלטית שהושרתה בבופר שטיפה. לאחר מכן, חברו עמודת זיקה לסטרפ למערכת כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבונים (fast protein liquid chromatography) ושטפו את העמודה בקצב של שני מיליליטר לדקה עם 66 מיליליטר של בופר שטיפה.

בצעו אלוציה של החלבון המופרד באותו בופר שטיפה, בתוספת חמישה millimolar של desthiobiotin, בקצב של 0.5 milliliters לדקה תוך שימוש ב-33 milliliters של בופר. אספו פראקציות של one milliliter. פראקציות השיא יהיו בערך 10 milliliters.

כדי להוות את קומפלקסי הנושא-נוגדן, ראשית גדלו את החלבון המופרש במהלך הלילה בטמפרטורת החדר עם thrombin להסרת התגיות ו-Endo H לצורך דגליקוזילציה. רכזו את החלבון לריכוז של 10 mg/mL ונפח של 250 עד 300 µL באמצעות מרכז חלבונים בצנטריפוגה עם סף חיתוך של 100 kDa. ערבבו את חלבון ה-SERT המרוכז עם 8B6 Fab ביחס מולרי של 1 ל-1.2 בנפח הקטן מ-500 µL.

סבב את התערובת בצנטריפוגה ב-100,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות. לאחר הסבב, אסוף את העילוי המכיל את קומפלקס ה-SERT Fab, והשלך את המשקע. הפר את הקומפלקס באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבונים (FPLC) בעמודת הפרדה לפי גודל (size exclusion column).

השג את שיווי המשקל באמצעות TBS מועשר בקצב של 0.5 milliliters לדקה. לפני הקריסטליזציה, רכז את פראקציוני השיא מהפרדת הקומפלקס לריכוז של שני milligrams למילליטר באמצעות מרכז חלבונים בצנטריפוגה עם סף חיתוך של 100 kilodalton. ספיגה של שני AU ב-280 nanometers שקולה ל-one milligram למילליטר.

הוסיפו Fab נוסף ביחס של 1 ל-0.05 של קומפלקס ל-Fab חופשי. הוסיפו גם 10 micromolar של S citalopram חופשי. לאחר סבוב של הדגימה בצנטריפוגה, אספו את העל-מצוף המכיל את קומפלקס ה-SERT Fab והשליכו את המשקע.

הכינו סקר טיפה תלויה (hanging drop) ב-24 בארות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, בהתאם לטבלה 1 בפרוטוקול הטקסט. טפטפו 500 microliters מכל תמיסת מאגר לתוך פלטת 24 בארות בעלת פרופיל נמוך, כאשר לכל בארה הוחל חומר איטום. טפטפו 1.5, 1.75 ו-2 microliters של קומפלקס SERT Fab על עליית זכוכית סיליקונית של 18 millimeter.

לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפט מיקרוליטר אחד של תמיסת המאגר (reservoir solution) על גבי דגימת החלבון. גבישים בודדים יופיעו תוך כ שלושה ימים ויגדלו ל-100 עד 175 מיקרומטרים לאחר 14 ימים. מוצגות כאן תוצאות מייצגות של סריקת יציבות תרמית בנוכחות citalopram מתורית.

ערכי טמפרטורת ההמסה ששורטטו מול קישוריות מרבית מראים מוטציות בעלות יציבות תרמית וביטוי גבוהים. מוצגות כאן עקומות היציבות התרמית עבור SERT TC מסוג פראי ושלוש המוטציות המובילות, Y110A, I291A ו-T439S. תמונת מיקרוסקופיה זו מראה תאי HEK293S GnTI minus המבטאים SERT CC, כאשר פלואורסצנציה ירוקה מופיעה על ממבראת התא.

כרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography) עם גילוי פלואורסצנציה של SERT CC מראה שיא מרכזי ב-15 milliliters. ניתוח באמצעות SDS-PAGE מציג סוג חלבון יחיד, נקי במידה רבה מזיהומים. מוצגת הפרדה מייצגת של קומפלקסים של נושא-נוגדן באמצעות כרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל.

השיא המרכזי שנשטף בנפח של 11.5 milliliters הכיל הן את SERT והן את Fab, כפי שמוצג בג'ל SDS-PAGE. מיקרוסקופיה של אור של קומפלקס הנוגדן של SERT הקשור ל-S citalopram לאחר שבועיים של גידול מראה גבישים בצורת פריזמה בגודל של כ-100 עד 175 microns. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות מוטציות המייצבות חלבון ממברנה בקונפורמציה קשורה לליגנד, וכיצד להקים סריקות גבישה עם קומפלקסים של חלבון ונוגדן.

בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לזכור כי ליגנדים נחוצים לייצוב של SERT TC וחיוניים לגביש של SERT CC. להשלכות של טכניקה זו יש השערה לטיפול במצבים פסיכיאטריים, כיוון ש-SERT הוא המטרה המולקולרית של תרופות נוגדות דיכאון רבות. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לאפיין את התפקוד של SERT מנוקה באמצעות שיטות ביוכימיות וביופיזיקליות.