Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי S -citalopram

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור טרנספורטר יציב מספיק למחקרים מבניים, ולהשתמש בטרנספורטר מותאם זה כדי לייצר גבישים הפורצים לרזולוציה גבוהה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית, כגון כיצד לפתור את המבנה של חלבוני ממברנה שהם מטרות תרופתיות חשובות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לבחור מתוך קונפורמציה הקשורה לתרופות באמצעות בדיקה פונקציונלית.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מובילי נוירוטרנסמיטורים, ניתן ליישם אותה גם על קולטנים, תעלות וחלבונים מסיסים, הקושרים מולקולות קטנות בעלות זיקה גבוהה. השעיה יסודית של תאי HEK293S GnTI מינוס טריפסוני ב-DMEM בתוספת סרום בקר עוברי של 10% לצפיפות של 0.5 מיליון תאים למיליליטר במאגר פיפטה חד פעמי. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר תאים לכל באר של צלחת מצופה פולי-D-ליזין.

השעו מחדש את התאים במאגר הפיפטה לאחר מילוי כל צלחת כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים. דגרו על התאים בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 8% פחמן דו חמצני. החלף את המדיה הסלולרית שעה לפני הטרנסבקציה.

הכן את קומפלקסי ריאגנטים של טרנסבקציה של DNA על ידי ערבוב של 450 ננוגרם של DNA עם 45 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום עבור כל מבנה ברקע TC האישור להקרנה. לאחר מכן הוסף 1.6 מיקרוליטר של מגיב הטרנסבקציה ל-45 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום וערבב. מוסיפים מיד את תמיסת ריאגנט הטרנסבקציה המדוללת לתמיסת ה-DNA ומערבבים.

אין לערבב פתרונות בסדר הפוך. המתן 10 עד 15 דקות לפני הוספת 20 מיקרוליטר מתערובת ה- DNA של מגיב הטרנסבקציה לארבע מהבארות. דגרו על התאים עם 200 ציטלופרם ננו-מולרי ו-25 מיקרוליטר TBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

כדי להמיס את התאים, הוסף 25 מיקרוליטר של שמונה מילי-מולרי C12M, CHS מילי-מולרי אחד וקוקטייל מעכב פרוטאז ב-TBS. דגירה על התאים למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של TBS עם 20 ציטלופרם משולש ננו-מולרי, אלבומין בסרום בקר 0.1% ומיליגרם למיליליטר של בדיקת הקרבה של זיקת התגים שלו או חרוזי SPA, לשלוש בארות עבור כל מבנה.

לבאר האחרונה יש להוסיף את אותה תמיסת TBS, אך להוסיף 100 סרטרלין מיקרו-מולרי כדי לקבוע קשירה לא ספציפית. ודא שחרוזי הספא של זיקת התגים שלו מעורבבים היטב בעת הוספתם לצלחת 96 הבאר. מדוד את קשירת הציטלופרם המשולש באמצעות מונה נצנוץ של 96 בארות בטמפרטורת החדר עם זמן ספירה של דקה אחת לבאר.

המשיכו לספור צלחות עד שהספירה הכוללת תעמוד על כ-36 שעות. לאחר המדידה, מחממים את הצלחות למשך 15 דקות בגוש חימום עם מכסה מחומם בחום של 33 מעלות צלזיוס. מדוד שוב את קשירת הציטלופרם המשולש לאחר החימום.

חזור על שלבים אלה עם שינוי שלב החימום. התאם את טמפרטורות החימום בהתאם לטמפרטורת ההיתוך לכאורה של חלבון המטרה וליציבות התרמית של המבנה היציב ביותר. המשך לחמם צלחות עד שלכל המבנים יש ספירות ספציפיות נמוכות.

גדל HEK293S GnTI מינוס תאים בתרחיף ב-37 מעלות צלזיוס עם 8% פחמן דו חמצני ו-85% לחות על שייקר ב-130 סל"ד ו-293 חומרי ביטוי בתוספת סרום בקר עוברי 2%. להדביק 10 ליטר מהתאים בנגיף P2 בריבוי זיהום של שניים וצפיפות של שלושה מיליון תאים למיליליטר. 12 עד 16 שעות לאחר ההדבקה, הוסף נתרן בוטיראט לריכוז של 10 מילי-מולר ממלאי טוחנת אחת.

48 עד 60 שעות לאחר ההדבקה, קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 4,000 פעמים G למשך 15 דקות. הסר את ה-supernatant. השעו מחדש תאים ב-150 מיליליטר TBS עם 2 אסציטלופרם מיקרו-מולרי או מעכבי SERT אחרים.

התאים מ -10 ליטר תרבית במים חמים כ -30 מעלות צלזיוס ומשעים אותם מחדש על ידי העברת התאים במהירות דרך פיפטה של 10 מיליליטר עד להומוגניות. מוסיפים את כל התאים לכוס עם מוט ערבוב ומוסיפים את כל תמיסת הניקוי לתאים תוך כדי ערבוב. ממיסים את התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה תוך ערבוב.

סובב את הליזאט בחום של 8,000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שפכו את הסופרנטנט לצינורות אולטרה צנטריפוגה נקיים והשליכו את הגלולה. לאחר מכן סובב את הסופרנטנט ב-100,000 פעמים G למשך שעה אחת באולטרה-צנטריפוגה.

לאחר אולטרה-צנטריפוגה, סנן את הסופרנטנט דרך מסנן 0.2 מיקרון והשליך את הגלולה. לאחר מכן, העבירו את הליזאט מעל 10 מיליליטר של שרף זיקה לסטרפטוקוקוס לתוך עמודה באמצעות משאבה פריסלטית מאוזנת במאגר כביסה. לאחר מכן חבר עמוד זיקה של סטרפטוקוקוס למערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבונית מהירה ושטוף את העמודה בשני מיליליטר לדקה עם 66 מיליליטר של מאגר כביסה.

יש לסלק את החלבון המטוהר באותו מאגר כביסה בתוספת חמישה מילי-מולרי דסטיוביוטין ב-0.5 מיליליטר לדקה באמצעות 33 מיליליטר של מאגר. אוספים שברים של מיליליטר אחד. שברי השיא יהיו כ -10 מיליליטר.

כדי ליצור את קומפלקס הנוגדנים לטרנספורטר, עכל תחילה את החלבון המטוהר למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם תרומבין להסרת תגים ואנדו H לדה-גליקוזילציה. רכז את החלבון לריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר ונפח של 250 עד 300 מיקרוליטר באמצעות רכז חלבון צנטריפוגה במשקל מולקולרי של 100 קילודלטון. מערבבים את חלבון ה-SERT המרוכז עם 8B6 Fab במנה מולרית של 1 עד 1.2 בנפח של פחות מ-500 מיקרוליטר.

צנטריפוגה את התערובת בחום של 100, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הצנטריפוגה, אספו את הסופרנטנט המכיל את קומפלקס SERT Fab והשליכו את הגלולה. הפרד את הקומפלקס באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבון בעמודת אי הכללת גודל.

אזנו אותו עם TBS בתוספת של 0.5 מיליליטר לדקה. לפני ההתגבשות, רכזו את שברי השיא מהפרדת הקומפלקס לשני מיליגרם למיליליטר באמצעות רכז חלבון צנטריפוגה במשקל מולקולרי של 100 קילודלטון. ספיגה של שני AU ב-280 ננומטר שווה למיליגרם אחד למיליליטר.

הוסף Fab נוסף ביחס של קומפלקס אחד ל-0.05 ל-Fab בחינם. הוסף גם 10 ציטלופרם S ללא מיקרומולרי. לאחר צנטריפוגה של הדגימה, אסוף את הסופרנטנט המכיל את קומפלקס SERT Fab והשליך את הגלולה.

הגדר מסך טיפה תלויה 24 באר בארבע מעלות צלזיוס לפי טבלה אחת בפרוטוקול הטקסט. פיפטה 500 מיקרוליטר מכל תמיסת מאגר בצלחת 24 בארות בפרופיל נמוך עם חומר איטום המונח על כל באר. פיפטה 1.5, 1.75 ושני מיקרוליטר של קומפלקס SERT Fab על גבי כיסוי זכוכית סיליקון 18 מילימטר.

לאחר מכן פיפטה מיקרוליטר אחד של תמיסת מאגר על גבי דגימת החלבון. גבישים בודדים יופיעו תוך כשלושה ימים ויגדלו ל-100 עד 175 מיקרומטר לאחר 14 יום. מוצגות כאן תוצאות מייצגות לבדיקת יציבות תרמית בנוכחות ציטלופרם טריטי.

ערכי טמפרטורת ההיתוך המשורטטים כנגד קשירה מקסימלית מראים מוטציות עם יציבות תרמית וביטוי גבוהים. כאן מוצגות עקומות היציבות התרמית עבור SERT TC מסוג פרא ושלושת המוטציות המובילות, Y110A, I291A ו-T439S. תמונת מיקרוסקופיה זו מציגה HEK293S GnTI מינוס תאים המבטאים SERT CC עם פלואורסצנטיות ירוקה הקיימת על קרום התא.

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל זיהוי פלואורסצנטי של SERT CC מראה שיא משמעותי ב-15 מיליליטר. ניתוח של SDS-PAGE מציג זן חלבון יחיד נקי ברובו ממזהמים. מוצגת הפרדה מייצגת של קומפלקסים של נוגדנים טרנספורטרים על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל.

השיא העיקרי שחמק ב-11.5 מיליליטר הכיל גם SERT וגם Fab כפי שמוצג בג'ל SDS-PAGE. מיקרוסקופ אור של קומפלקס הנוגדנים SERT הקשור ל-S citalopram לאחר שבועיים של גידול מראה גבישים בצורת פריזמה של כ-100 עד 175 מיקרון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות מוטציות המייצבות חלבון ממברנה באישור הקשור לליגנד, וכיצד להקים מסכי התגבשות עם קומפלקסים של נוגדנים חלבונים.

כאשר מנסים לבצע הליך זה חשוב לזכור שליגנדים נחוצים לייצוב SERT TC והם חיוניים להתגבשות של SERT CC. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במצבים פסיכיאטריים מכיוון ש-SERT הוא המטרה המולקולרית של תרופות נוגדות דיכאון רבות. בעקבות הליך זה, ניתן לאפיין את תפקודו של SERT מטוהר בשיטות ביוכימיות וביופיזיקליות.