ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

המטרה הכוללת של טכניקת ביטוי חלבון יונקים זו היא לייצר כמויות של מיליגרם של חלבונים מקופלים באופן טבעי המתאימים למחקרים מבניים, ביופיזיקליים ופונקציונליים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בפרוטוקול מהיר ופשוט להשגת חלבוני יונקים מופרשים וריכוז בטוהר הנדרש למחקרים מבניים. באופן כללי, אנו מוצאים כי רוב הבעיות בתפוקת החלבון נובעות מבריאות התאים והכדאיות.

על ידי ניטור מדוקדק של כדאיות התאים וגם ניטור רמות הסוכר במדיה, אתה משפר מאוד את תפוקת החלבון ומאריך את התועלת של התאים. חשוב מאוד גם לנטר את צפיפות התאים. אנו מוצאים שאם בכל עת לפני הטרנספקציה התאים עולים על 2 מיליון תאים למיליליטר, אז תפוקת החלבון מופחתת מאוד כדי לבצע תרבית בקנה מידה גדול של 2 93 F תאים משלימים ליטר אחד של 2 93 F מדיה עם 10 מיליליטר של 100 x גלוטמין וחמישה מיליליטר של 100 x עט סטרפטוק.

האנטיביוטיקה נמצאת בעוצמה מספקת בתנאים נטולי סרום וריכוז האנטיביוטיקה המופחת משפר את כדאיות התאים במהלך הטרנספקציה, מה שמשפר את תרבית תפוקת החלבון. 2 תאי 93 F ב-300 מיליליטר מדיה בליטר אחד, פוליקרבונט בלבלו צלוחיות ארלנמאייר עם כובעים מאווררים ב-37 מעלות צלזיוס עם 8% פחמן דו חמצני תוך כדי טלטול באינקובטור תרבית רקמה סטנדרטי יום אחד לפני הטרנספקציה מדללים את התאים ל-0.5 מיליון תאים לצפיפות מיליליטר ביום הטרנספקציה. השלם את מדיום התרבות על ידי הוספת 10% נפח של 2% משקל לכל נפח תא בוסט במדיה של 2 93 F.

הוסף קאפו במראה בשלב זה כדי לשלוט בגליקוזילציה של חלבון. הכן תמיסות ריאגנטים של DNA וטרנספקציה במדיה נטולת סרום למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף את מגיב הטרנספקציה לתמיסת ה-DNA בערבוב מרווחים של מיליליטר אחד.

דגירה בעדינות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר להיווצרות קומפלקסים של DNA מגיבים. לאחר מכן הוסף את התמיסה לתאים בצורה טיפתית, אפשר לתאים שעברו טרנספטציה לבטא חלבון במשך 72 עד 96 שעות כדי לטהר את הגליקופרוטאין. ראשית יש לשפוך את התרבית לצנטריפוגה של בקבוק צנטריפוגה למשך 20 דקות ב-1300 Gs.To לגלול את התאים, לאסוף את הסופרנט ובמידת הצורך לסובב פעם שנייה או להשתמש במסנן של 0.22 מיקרון כדי להבהיר את הסופרנטנט.

לאחר מכן, הוסף 10% נפח של 10 x עומס ניקל ניטרו, חומצה טרי אצטית או מאגר מחייב ניקל NTA. לאחר מכן הכן עמודת כבידה בארבע מעלות צלזיוס על ידי הוספת שני מיליליטר של תמיסת הניקל NTA לעמודה ושיווי משקל עם 10 נפחי עמודות של מאגר מחייב אחד x הפועל בארבע מעלות צלזיוס. הזרימו את הסופרנטנט על השרף וכדי לאסוף את הזרימה דרכו.

לאחר שפיכת ה-supernatant זרם דרך העמוד שטיפת עם 10 נפחי עמודים של מאגר כביסה. לאחר מכן יש להוציא את החלבון בחמישה נפחי עמודות של מאגר פליטה. אם נדרשת דה-גליקוזילציה לנפח סופי של 0.5 מיליליטר, יש לרכז EIT ל-0.43 מיליליטר באמצעות כדור רכז צנטריפוגה כל פסולת על ידי צנטריפוגה ב-16,000 GS וארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן מוסיפים 50 מיקרוליטר של 500 מילי-מולרי נתרן ציטראט, pH 5.5 ו-20 מיקרוליטר אנדו hf. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי להסיר את האנדו HF שטפו תחילה שרף עמילוז שלוש פעמים במי מלח חוצצים פוספט. דגרו את החלבון עם השרף השטוף למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, סובבו במשך חמש דקות ב-1000 גרם כדי לגלול את השרף ולאסוף את הסופרנטנט. רכז את החלבון באמצעות חיתוך משקל מולקולרי מתאים, מסנן צנטריפוגה והחלפת חיץ למאגר האחסון המוצג. להלן תוצאות מייצגות של דף SDS עבור חלבון מופרש המתבטא בתאים שטופלו בקולנוע בעקבות כרומטוגרפיה של זיקה לניקל.

הנתיב הראשון הוא החלבון לפני הדגליקוזילציה, והנתיב השני הוא החלבון לאחר דה-גליקוזילציה על ידי אנדו hf. החלבון המסוכרר עולה בכ-10 קילו-דלטון ואז קורס לרצועה אחת התואמת את המשקל המולקולרי החזוי לאחר דה-גליקוזילציה, לאחר שלב הטיהור היחיד. מסכי קריסטל הוקמו בשיטת הטיפה התלויה.

התמונה העליונה מציגה את פגיעת הגביש הראשונית והתמונה התחתונה מציגה תנאי התגבשות אופטימליים. זה מדגים כי הומוגניות ביוכימית של החלבון המעניין יכולה להיות גורם מכריע להצלחת ההתגבשות, ומערכת ביטוי אופטימלית של יונקים מייצרת חלבונים המתאימים להתגבשות זו. טיהור נוסף של חלבון מטוהר ניקל נעשה בקלות על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל.

זהו גם צעד שימושי לקראת הערכת ייצור החלבון ואופטימיזציה של התנאים להפקת חלבונים מקופלים כהלכה. החלבון המעניין צריך להיות המין העיקרי בפליטה הכרומטוגרפית, ונפח הפליטה צריך להתאים למשקל המולקולרי של החלבון. מוקדם יותר. זמני EEU עשויים להצביע על צבירה או קיפול שגוי של החלבון לאחר שליטה.

טכניקה זו יכולה להיעשות תוך ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשמור על תנאים סטריליים לתרבית תאים לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו גודל, כרומטוגרפיה של אי הכללה, פיזור אור רב-זוויתי וסריקה דיפרנציאלית, פלואורומטריה על מנת להעריך את מצב האוליזציה ואת היציבות התרמית של החלבון.