ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

המטרה הכללית של טכניקה זו לביטוי חלבונים בינקים היא להפיק כמויות של מיליגרמים של חלבונים במקופלים בצורה טבעית, המתאימים למחקרים מבניים, ביופיזיקליים ופונקציונליים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמדובר בפרוטוקול מהיר ופשוט להשגת חלבונים מופרשים מינקים בריכוז ובדרגת טוהר הנדרשים למחקרים מבניים. באופן כללי, מצאנו כי מרבית הבעיות בניבוי החלבון נובעות מבריאות התאים ומחיוניותם.

על ידי ניטור קפדני של חיוניות התאים וכן ניטור רמות הסוכר במצע, ניתן לשפר משמעותית הן את תנובת החלבון והן את אורך חיי התאים. חשוב מאוד גם לנטר את צפיפות התאים. מצאנו כי אם בכל שלב לפני הטרנספקציה צפיפות התאים עולה על 2 מיליון תאים למילליליטר, תנובת החלבון פוחתת באופן משמעותי. לביצוע תרבית בקנה מידה גדול של תאי 2 93 F, יש להוסיף לליטר אחד של מצע 2 93 F כ-10 מיליליטר של 100 x glutamine וחמישה מיליליטר של 100 x pen strep.

האנטיביוטיקה נמצאת בריכוז מספק בתנאים ללא סרום, והריכוז המופחת של האנטיביוטיקה משפר את חיוניות התאים במהלך הטרנספקציה, דבר המשפר את תנובת החלבונים בתרבית. תאי 2 93 F ב-300 מיליליטר של מצע בתוך בקבוקי ארלנמאייר מポリקרבונט עם מחיצות (baffled) ונפחים של ליטר אחד, בעלי פקקים מאווררים, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 8% פחמן דו-חמצני (carbon dioxide) תוךما ניעור באינקובטור סטנדרטי לתרביות רקמה יום אחד לפני הטרנספקציה. ביום הטרנספקציה, דללו את התאים לצפיפות של 0.5 מיליון תאים למיליליטר. העשירו את מצע התרבית על ידי הוספת 10% נפח של 2% משקל לנפח של cell boost במצע 2 93 F.

הוסיפו kafu כפי שמוצג בשלב זה כדי לשלוט בגליקוזילציה של חלבונים. הכינו תמיסות DNA ומסייע טרנספקציה במצע ללא סרום והדגירו למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו את מסייע הטרנספקציה לתמיסת ה-DNA בתוספות של מיליליטר אחד תוך כדי ערבוב.

דגרו בעדינות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות של קומפלקסים של ריאגנט ו-DNA. לאחר מכן, הוסיפו את התמיסה על התאים בטפטוף. אפשרו לתאים שעברו טרנספקציה לבטא את החלבון למשך 72 עד 96 שעות כדי לטהר את הגליקופרוטאין. ראשית, שפכו את התרבית לבקבוק צנטריפוגה וסובבו במשך 20 דקות ב-1300 Gs. כדי לשקע את התאים, אספו את העילאי (supernatant), ובמידת הצורך, סובבו פעם שנייה ו/או השתמשו במסנן של 0.22 מיקרון כדי להבהיר את העילאי.

בשלב הבא, הוסיפו 10% נפח של 10 x nickel nitro load, tri acetic acid או nickel NTA binding buffer. לאחר מכן, הכינו עמודת כבידה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס על ידי הוספת שני מיליליטר של nickel NTA slurry לעמודה והשגת שיווי משקל עם 10 נפחי עמודה של one x binding buffer בעבודה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסומסום מעל לשרף כדי לאסוף את הנוזל שעבר (flow through).

לאחר מזיגת תמיסת העילאי (supernatant) שזרמה דרך העמודה, יש לשטוף את העמודה עם 10 נפח-עמודות של בופר שטיפה. לאחר מכן, יש לאלוט את החלבון בחמישה נפח-עמודות של בופר אלוציה. אם נדרשת דגליקוזילציה לנפח סופי של 0.5 milliliters, יש לרכז את ה-EIT ל-0.43 milliliters באמצעות מרכז צנטריפוגי, ולהפריד שאריות שקיים על ידי צנטריפוגציה ב-16,000 GS ובטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius.

לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של sodium citrate בריכוז 500 mM, pH 5.5 ו-20 µL של endo hf. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי להסיר את ה-endo HF. שטפו את שרף האמילוז (amylose resin) שלוש פעמים ב-phosphate buffered saline. דגרו את החלבון עם השרף השטוף למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C.

לאחר הדגירה, סובבו במשך חמש דקות ב-1000 Gs כדי לשקע את שרף הסינון ואספו את הנוזל העליון (supernatant). רכזו את החלבון באמצעות מסנן סנטריפיגציה בעל סף משקל מולקולרי מתאים, ובצעו החלפת בופר לבופר האחסון המוצג. להלן תוצאות SDS page מייצגות עבור חלבון מופרש שבוטאו בתאים שעברו טיפול ב-cine לאחר כרומטוגרפיית זיקה לניקל.

הנתיב הראשון הוא החלבון לפני דגליקוזילציה, והנתיב השני הוא החלבון לאחר דגליקוזילציה באמצעות endo hf. החלבון הגליקוזילated רץ כ-10 kilodaltons גבוה יותר ואז קורס לפס אחד התואם למשקל המולקולרי החזוי לאחר הדגליקוזילציה, בעקבות שלב טהרה יחיד. סריקות גבישים הוכנו בשיטת הטיפה התלויה (hanging drop method).

התמונה העליונה מראה את פגיעת הגביש הראשונית והתמונה התחתונה מראה תנאי התגבשות שעברו אופטימיזציה. הדבר מדגים כי הומוגניות ביוכימית של החלבון הנחקר יכולה להוות גורם מכריע להצלחת ההתגבשות, ומערכת ביטוי אופטימלית של יונקים מייצרת חלבונים המתאימים להתגבשות זו. טיהור נוסף של חלבון שטוהה באמצעות ניקל מבוצע בקלות באמצעות כרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography).

זהו גם שלב מועיל להערכת ייצור החלבון ואופטימיזציה של התנאים להשגת חלבונים מקופלים כהלכה. החלבון המדובר צריך להיות המין העיקרי באלוציית הכרומטוגרפיה, ונפח האלוציה צריך להתאים למשקל המולקולרי של החלבון. זמני אלואוציה מוקדמים עשויים להעיד על אגרגציה או קיפול שגוי של החלבון לאחר השליטה בשיטה.

ניתן להשלים טכניקה זו בארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשמור על תנאי סטריליות עבור תרבית התאים בעקביות לאורך הפרוטוקול. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון כרומטוגרפיה של הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography), פיזור אור רב-זוויתי (multi-angle light scattering) ופלואורומטריית סריקה דיפרנציאלית (differential scanning fluorometry), על מנת להעריך את מצב האוליגומריזציה ואת היציבות התרמית של החלבון.