Name: תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: למד שיטה לזיהוי תרכובות אנטי-מיקרוביאליות חודרות תאים איקריוטיים ללא רעילות לתאי מארח. השיטה מאפשרת זיהוי בזמן אמת של גדילה חיידקית ורעילות תאית בו-זמנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר דיווח בכתב היד הזה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר פרסי R01AI099122 כדי JEK התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי בְּרִיאוּת. ברצוננו להודות ג&#39;ניפר סמית, הדוד וורובל, סו צ&#39;יאנג, דאג מבול, שון ג&#39;ונסטון, ג&#39;ניפר רציונל, סטיוארט רודניצקי, פול יאן, ריצ&#39;רד סיו, ורחל וורדן ממתקן הקרנת ICCB-Longwood ו / או מעבדת ההקרנה הארצית המרכזים האזוריים של ניו אינגלנד מצוינת להגנה מפני טרור ביולוגי ומתפתחים מחלות זיהומיות (נתמכות על ידי U54AI057159) על עזרת פיתוח וביצוע מבחני תפוקה גבוהה הקרנה. כמו כן, אנו רוצים להודות קנת פ סמית על הערות מועילות על כתב היד.

1. צמיחה התאית Real Time ו Assay Cytotoxicity Cell איקריוטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מארח הכנה (תאי J774A.1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות J774A.1 תאי מקרופאג דמוי musculus Mus ההשעיה ב RPMI 1640 עם 9% נסיוב עגל-בתוספת ברזל. בתחילה מעבר צלוחיות בתרבית רקמה. לאחר התאים הפכו ומחוברות בבקבוק תרבות 75 ס&quot;מ 2 רקמות 15 מ&quot;ל של מדיום, לפצל על ידי גירוד ודילול ל -65 מ&quot;ל עם אותו סוג של מדיום, מתוכם 15 מ&quot;ל מוחזר אל הבקבוק בתרבית רקמה ו -50 מ&quot;ל מועבר בבקבוק שייקר 250 מיליליטר חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדרוג כלפי מעלה, תרבות ההשעיה ב 250 מ&quot;ל ו / או 1,000 צלוחיות חיידקי מ&quot;ל מלא עד נפח חמישית עם המדיום בתרבית רקמה. לאוורר ידי קביעת מהירות סיבוב של כ 120 סיבובים לדקה. עבור צמיחה עקבית, לדגור בדיוק 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים כאשר הם מגיעים צפיפות בטווח 2.5 x 10 6 תאים/ מ&quot;ל עד 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. ודא אחוז תאים המת (רוב assayed בקלות על ידי מכתים הכחול trypan) אינו עולה על 25%, כפי תאים מתים יגדלו רעשי רקע מבחני רעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט בלבן, תרבות שטופלו רקמות, 384 גם microplates ב 5 x 10 4 תאים J774A.1 במדיום בתרבית רקמה 30 μl לכל טוב. דגירה microplates לילה להשיג מפגש 90% ביום של הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלורסנט הכנה או pneumophila הלגיונלה פלורסנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר pneumophila L. (Lp02 :: flaA :: לוקס 8) חיידקים על המדיום המתאים, כלומר, תמצית שמרים פחם שנאגרו (BCYE) בינוני. אם אתה משתמש זן thymidine auxotrophic, להשלים בינוני עם 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​thymidine. כן כתמי חיידקים לניסויים על ידי הפצת אורגניזמים עבה בצלחת BCYE חדשה דוגר יום אחד (אם מתוך קטע צלחת קודם) או שניים עד שלושה ימים (אם ממלאים קפוא) להשיג ומחוברותצְמִיחָה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחות BCYE ידי המסת תמצית שמרים 10 גרם, 10 גרם N - (2-acetamido) חומצה -2-aminoethanesulfonic, 0.35 גרם K 2 4 HPO, ואשלגן monobasic 1 גרם α-ketoglutarate ב 950 מ&quot;ל מים deionized. התאם ל -6.9 pH עם הידרוקסיד אשלגן (≥2.5 מיליליטר של 11.9 פתרון טוחן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 אגר גרם ו פחם פעיל 2 גרם; ומביאים 1 L נפח סופי. הוספת בר ומערבבים מגנטי החיטוי. בינוני מצננים 55 ° C ולהוסיף פתרונות מעוקרות מסנן המכיל ציטראט 0.4 גרם L-ציסטאין 0.42 גרם אמוניום ברזל (III) מומס במים deionized. השתמשו בצלחת ומערבבים מגנט לערבב לפני שוטף צלחות פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקה של צמיחה pneumophila ל במדיום הגידול axenic, להכין מרק ACES-תמצית שמרים (AYE) על ידי שילוב כל ריאגנטים כימיים המשמשים BCYE למעט פחם אגר. סנן לעקר להשתמש מיד, או להקפיא לניסויים מאוחר יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אורגניזמים Resuspend ב saהמדיום שלי בתרבית רקמה המשמש תאים J774A.1 עם 100 מיקרוגרם / תוספי thymidine מ&quot;ל לפי העניין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום macrophage <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תרכובות בדיקה של עניין (תרכובות הקרנה, בקרות חיוביות ושליליות עבור עיכוב התפתחות חיידקי תמוגה תא אוקריוטים). רצוי, לפזר פתרונות המניה ב ≥500x DMSO (sulfoxide דימתיל) או בתמיסה מימית לאפשר דילול מספיק של הרכב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות פתרונות מניות ניתן לאחסן קפוא, להימנע להקפיא להפשיר מחזורים עבור תרכובות antimicrobials יציבות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל חיידקים זורח למקד של 2.5 x 10 6 CFU (יחידת המושבה להרכיב) / m וחיידקים הכתב שכותרתו ניאון כדי 1.0 x 10 7 CFU / ml במדיום בתרבית רקמה ולהוסיף רעיל, קרום impermeant המתאים דיאלקטרי גרעין מחייב לצבוע בריכוז assay 2.5x הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של תערובת לכל תרבות J774A.1 היטב, נפח assay הסופי50 μl, ריכוז חיידקי הסופי 1 x 10 6 CFU / ml (כתב אופרון לוקס) או 4 x 10 10 6 CFU / ml (כתב חלבון פלואורסצנטי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 ימים ב 5% CO 2 ב 100% לחות יחסית כדי למנוע תופעות קצה אוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> assay Readout <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא התפתחות חיידקים רעילות לתא איקריוטיים על microplate luminometer ו fluorimeter בהתאם לכתבים בשימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע תופעות קצה הקשורים בטמפרטורה, תרמית לאזן microplates לפני קריאת הארה בהנפקה בשכבה אחת על ספסל במעבדה עם מכסים פתוחים למשך כ 20 דקות (או בתוך ארון בטיחות ביולוגי עם מכסים לסירוגין במשך כ 10 דק &#39;). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור microplates חממה אם הודעה בזמן האמת בנקודות זמן מאוחר יותר היא רצויה. </li></ol></li></ol> ניתוח 2. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הנתונים כדי con החיובית והשליליתקבוצת ביקורת לחשב אחוזים או לקפל-עיכוב התפתחות חיידקים תאי cytotoxicity אחוזים עבור תאים איקריוטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך החוסן assay, לחשב הפרדה סטטיסטית בין בקרות חיוביות ושליליות הן עיכוב התפתחות חיידקים cytotoxicity באמצעות Z-factor (Z &#39;) ניתוח כאשר Z&#39; = 1 - 3 (σ p + σ n) / | מיקרון p + מיקרון n |. ב p המשוואה, σ זה σ n הם סטיות התקן עבור בארות שליטה חיוביות ושליליות, בהתאמה; μ p ו מיקרון n הם הערכים הממוצעים עבור בארות שליטה חיוביות ושליליות, בהתאמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מבחני תפוקה גבוהה הקרנה, לחשב z-ציוני תקן (או חלופה אחרת, מדידות סטטיסטיות כמוני) להערכת תופעות של תרכובות בדיקה של עניין. לחלופין, לחשב מתקפל הפחתה פשוטה או להתחבר פי הפחתה כמו פיזיולוגית פוטנציאל ליותר רלוונטי<html> מידה של גודל אפקט לחיידקים משכפלים גיאומטרי. </li></ol></li></ol> 3. יחיד ורב ממדית (כלומר, סינרגיה) מנה-תגובה פרשנות לבחינות נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מקרופאגים וחיידקים כמתואר בסעיף בפרוטוקול 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני הדבקה או דגירת axenic, להוסיף antimicrobials עניין ניסיוני הסדרה, הכפלת סדרת דילול, במטרה פורש על הקצה הגבוה ריכוז כי מבטל לחלוטין צמיחה (כלומר, ריכוז המעכבות המינימאלי או MIC) ועל נמוך בסופו של ריכוז כי לא מראה פעילות ברורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת טיפול נוזל אוטומטית כדי להקל מנת תגובה אחת והתקנת בדיקות סינרגיה קומבינטורית דרך בנוסף ישירים, אוטומטי של דילולים מיקרוביאלית על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקול שימוש דילולים הכפלת-משנה, למשל,841 / 54841eq1.jpg &quot;/&gt; - לקפל סדרת דילול, ו assay משכפל מנת לשפר את דיוק ואת שחזור של נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זיהום מקרופאג, לדלל חיידקים זורח למקד של 2.5 x 10 6 CFU (יחידת המושבה להרכיב) / מ&quot;ל במדיום בתרבית רקמה. הוסף 20 μl של תערובת לכל תרבות J774A.1 היטב, נפח assay הסופי 50 μl, ריכוז חיידקי הסופי 1 x 10 6 CFU / ml; לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ב -100% לחות יחסית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקת צמיחת axenic, לדלל חיידקים זורחים לריכוז סופי של 1 x 10 6 CFU / ml במדיום AYE, להוסיף 50 μl היטב בכל צלחת 384 גם לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ב -100% לחות יחסית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מדד ריכוזיות מעכב שבר עבור שילובים מיקרוביאלית מעכבות התפתחות חיידקים. עבור כל תרופה בשילוב (a, b,.. N) מביא מלא או&gt; 99% עיכוב של g חיידקיםrowth, לחשב את ריכוז מעכבות שבר הפרט (FIC a, b, n...) כדלקמן: FIC a = הריכוז מתחם &quot;a&quot; מחולק ריכוז המעכב המינימאלי של &quot;a&quot; בפני עצמו. . שימוש באותה נוסחה, לחשב ב FIC, וכו &#39;ואז לחשב את מדד FIC קומבינטורית או <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/54841/54841eq2.jpg" /> FIC = FIC a + b + FIC. . N .FIC לכל צירוף מעכב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מדד קומבינטורית שחורג קליעה מ -1.0 להעריך סינרגיה. שקול וניתוק ≤0.5 כאינדיקציה שמרנית של אפקט סינרגיסטי ≥4, השפעה אנטגוניסט. 12 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש isobolograms, isobolograms isocontour, ו / או isosurface isobolograms 6 ייצוגים גרפיים חלופי ליום תופעות קומבינטורית. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Garzoni, C., Kelley, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%3A+new+evidence+for+intracellular+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence.</a> Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).</li>
<li>Rosen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+an+intracellular+bacterial+community+pathway+in+Klebsiella+pneumoniae+urinary+tract+infection+and+the+effects+of+FimK+on+type+1+pilus+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression.</a> Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).</li>
<li>Blango, M. G., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+face+of+multiple+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).</li>
<li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+impermeant%2C+DNA-binding+dye+fluorescence+as+a+real-time+readout+of+eukaryotic+cell+toxicity+in+a+high+throughput+screening+format%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format.</a> Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).</li>
<li>Edelstein, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+chemotherapy+for+legionnaires%27+disease%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review.</a> Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).</li>
<li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Intracellular+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).</li>
<li>Pedro-Botet, L., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella%3A+macrolides+or+quinolones%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Legionella: macrolides or quinolones?</a> Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).</li>
<li>Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+Legionella+pneumophila+growth+in+macrophages+requires+the+concerted+action+of+cytokine+and+Naip5%2FIpaf+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways.</a> Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).</li>
<li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+intravital+imaging+of+cellular+differentiation+with+a+bright+red-excitable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein.</a> Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).</li>
<li>Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C. Ch. 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEliopoulos%2C+GM+%22Antimicrobial+combinations.+In%3A+Antibiotics+in+Laboratory+Medicin%22">Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin</a>. Lorian, V. , Williams and Wilkins. 330-396 (1996).</li>
<li>Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+direct+compound+dispensing+method+using+the+HP+D300+digital+dispenser%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser.</a> J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).</li>
<li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy%2C+antagonism%2C+and+what+the+chequerboard+puts+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+intracellular+targeting+properties+associated+with+mutations+in+the+Legionella+pneumophila+dotA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene.</a> Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).</li>
<li>Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+defects+in+intracellular+growth+complemented+by+a+single+genetic+locus+in+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).</li>
<li>Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of Legionella pneumophila.</a> Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).</li>
<li>Kirby, J. E., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease%3A+the+pore+macrophage+and+the+legion+of+terror+within%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within.</a> Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).</li>
<li>Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+pore-forming+ability+by+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).</li>
<li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279 (5352), 873-876 (1998).</li>
<li>Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+Effects+of+Tetracycline+Analogues+%28Doxycycline%2C+Minocycline+and+COL-3%29+in+Acute+Myeloid+Leukemia+HL-60+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells.</a> PLoS ONE. 9 (12), e114457(2014).</li>
<li>Isberg, R. R., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+genetic+locus+encoded+by+Yersinia+pseudotuberculosis+permits+invasion+of+cultured+animal+cells+by+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12.</a> Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).</li>
<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).</li>
<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Chem+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).</li>
<li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+trends+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel trends in high-throughput screening.</a> Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).</li>
<li>Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunlap%2C+P+%22Bioluminescence%3A+Fundamentals+and+Applications+in+Biotechnology+-+Volume+1%22">Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1</a>. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מתארים מבחנים בזמן אמת עבור זיהוי סימולטני של התפתחות חיידקים תאית cytotoxicity תא מארח. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, עבור ביצועים assay חזקים, חייבת להיעשות הפרדה ספקטרלי מספיק בין readouts חיידקים cytotoxicity. הפרדה כזו היא חלק מובנה עבור שילובים של כתבים אופרון בלוציפראז וצבעים-DNA מחייבת ניאון. עם זאת, על סמך הניסיון שלנו (לוח 1-3, איור 2), השימוש כפול, הודעת פלורסנט דורשת אותות ניאון שאינם חופפים (למשל, שימוש עיתונא...

פתוגנים גדלים או מתגוררים באופן זמני בתאים תאיים קשים למגר טיפולי. לחייב או יחסית לחייב פתוגנים תאיים כגון pneumophila הלגיונלה, burnetii Coxiella, spp Brucella. Francisella, tularensis, ו spp Mycobacterium. לעתים קרובות דורשים ממושך קורסים של טיפול אנטי-מיקרוביאלי לריפוי כי עשוי לנוע בין חודשים ואף שנים. יתר על כן, פתוגנים תאיים עשויים זמני לכבוש נישות תאיות בדרך זו לברוח אישור על ידי קורסים רגילים של טיפול אנטי-מיקרוביאלי, ואחר כך יוצא להתחיל סיבובים חדשים של זיהום ארסי. Staphylococcus aureus 1 וזיהומי uropathogenic 2,3 Enterobacteriaceae הם שתי דוגמאות להכרה גוברת. לכן, מטרת גילוי תרופות בסיסית היא לזהות antimicrobials רומן חודרים לתאים תאיים. טיפול אופטימלי במהירות לבעראורגניזמים תאיים ולמנוע התפתחות של עמידות באמצעות חשיפה מיקרוביאלית תת-מעכבות במיוחד רצוי. לשם כך, פתחנו טכנולוגית הקרנת תפוקה גבוהה לזהות antimicrobials תאי-penetrant מיקוד הצמיחה התאית של הפתוגן המודל, pneumophila הלגיונלה. 4 תצפיות קליניות קודמות עולות כי בדיקות רגישות מיקרוביאלית תקן לא לחזות במדויק יעילות טיפולית vivo נגד אורגניזם זה. באופן ספציפי 5, זה היה בגלל סוגים עיקריים של antimicrobials כמו β-lactams ו אמינוגליקוזידים, למרות יעיל מאוד נגד axenically גדלה הלגיונלה, אינם חודרים מספיק לתוך התאים התאיים שבו הלגיונלה מתגורר. 5,6 ראיות בהמשך הציעו טכני מורכבים יותר מבחני צמיחה תאית חזה יעילות קלינית ביעילות. 7 </sup&gt; למרבה הצער, אלה מבחנים היו מבחני נקודות קצה מייגעים, מחייב מקרופאגים נגועים, שטופלו antimicrobials, להיות lysed בנקודות בזמנים שונים עבור ספירת יחידת מושבה להרכיב. מבחנים כאלה הם מעשי לעשות בקנה מידה גדולה והם מתאימים לגילוי סמי תפוקה גבוהה. לכן, פתחנו טכנולוגיה לקביעה בזמן האמת של התפתחות חיידקים תאית. 6 הדבר זה הושג באמצעות שימוש זן חיידקים השונה באמצעות שילוב של אחת המעמד של חיידקים בלוציפראז אופרון 8 (assay הדור הראשון, שתואר לעיל) 4 או פלורסנט חלבון 9 עיתונאים (דור שני, assay המאונך, המתוארת כאן) לתוך כרומוזום החיידקים. בדרך זו, זורח או אות ניאון מספק פונדקאית, readout בזמן אמת של מספר חיידקים. עם זאת, תכונות אלה לא להתייחס מתערבים מרכזיים infectio התאימבחני n, השפעות חוץ-היעד בתא הפונדקאי. בפרט, מותו של תא המארח מגביל מטבעו צמיחה תאית וגורם זיהוי חיובי כוזב של אפקט מיקרוביאלית. כמו תרכובות רבות בספריות הקרנה הן תאים איקריוטיים, רעילות תוצאות חיוביות שגויות כאלה היו להציף antimicrobials נכון, דבר מחייב מספר גדול של מעקב, מבחני cytotoxicity קץ לשם קבלת החלטה. לכן, זה היה עניין רב כדי להיות מסוגל להעריך כדאיויות תא האיקריוטים וצמיחה תאית זמנית. יש לציין, מאפיין של תאים איקריוטיים הלא קיימא הוא הפגיעה בשלמות קרום התא. בדיקות הבודקים את החדירות של קרום התא עשוי אפוא לשמש כדי להעריך כדאיות התא. אנחנו שאפיינו את היכולת של סדרת-impermeant קרום התא putatively, ניאון, צבעים-DNA מחייבת לגשת להכתים DNA הגרעיני של תאים מתים. 4 ביום ה- DNA מחייב גרעינית, צבעים אלה מהווים גידול גדול quantuמ פלורסנט תשואה וכתוצאה מכך האות מוגברת על קרינת פתרון רקע. ככזה, צבעים אלה ספקו הודעה כמותי של מוות של תאים איקריוטיים. 4 יש לציין, מצאנו כי כמה היו רעילים עצמם במהלך שיתוף דגירה ממושכת עם מקרופאגים J774. כאשר נוספו במהלך הזיהום הראשוני, הם סיפקו בזמן אמת, ההודעה ניאון של מוות של תאים איקריוטיים שניתן למדוד על ידי fluorimeter microplate או שנצפה מיקרוסקופית. לכן, על ידי שילוב של השימוש עיתונאי חיידקים ולא רעיל, קרום impermeant, צבעי ה- DNA מחייב, הצלחנו לפתח assay פשוט, שאינו הרסני, בזמן אמת כדי למדוד הן עומס חיידקים ו cytotoxicity תא אוקריוטים זמנית. assay זו אפשרה לנו להקרין בפורמט צלחת 384 גם ~ 10,000 bioactives ידוע כולל ~ 250 antimicrobials ו&gt; 240,000 מולקולות קטנות עם פעילות uncharacterized מבחינה תפקודית עבור היכולת לעכב צמיחה תאית שלPneumophila הלגיונלה, בעוד באותו הזמן להפקת נתוני cytotoxicity התא אוקריוטים לכל מתחם. 6 הניתוח שלנו של antimicrobials הידוע מפני צמיחה תאית של הלגיונלה היה החקר המקיף ביותר מסוג זה עד כה. 6 בהתבסס על היעילות של פורמט assay שלנו, אנו ובהמשך גם בחנו את ההשפעות סינרגיסטי הפוטנציאלי של antimicrobials ידוע מתי להשתמש בשילוב. אחד המבחנים סינרגיה הנפוצים ביותר, assay שחמט שנקרא, מבוצע standardly ידי הערכת ההשפעות קומבינטורית של דילולים סדרתי כפולה של שניים או יותר antimicrobials. 10 מבחנים אלה, סינרגיה מוגדרת על ידי התצפית של השפעה גדולה יותר כאשר שתיים או יותר antimicrobials מוחלים יחד מסכום ההשפעות של כל מיושמות בנפרד. מן ראוי לציין כי, עד כה, התמקד רק ובדיקת סינרגיה סלקטיבית בוצעה נגד pneumophila הלגיונלה התאי </em&gt; בגלל מאמץ הרב טמון מבחני סיום מסורתיים מוכפלים פרמוטציות קומבינטורית הנדרשת. כדי לאפשר בדיקת סינרגיה, עשינו שימוש הצמיחה תאית בזמן האמת שלנו / assay cytotoxicity איקריוטיים בשילוב עם טכנולוגיה מחלק דיגיטלית אוטומטית 6. אוטומציה זה מותר לנו לוותר דילולי סדרה של תרכובות המומסות DMSO או בתמיסה מימית לבד או בשילוב בפורמט 384 גם. 11 יתר על כן, טכנולוגית טיפול נוזל חזקה כאלה מותר לנו לבצע ברזולוציה גבוהה יותר בקלות, שורש ריבועי-של-שני (ולא סטנדרטי, רזולוציה נמוכה יותר, הכפלה) שילובי דילול להשיג רמות גבוהות יותר של סגוליות בסינרגיה דו הממדים, שחמט שלנו אָנָלִיזָה. החלטה זו הייתה יקרה במיוחד מענה לחששות בתחום סינרגיה על שחזור בעת שימוש סדרת דילול הכפול 12. לבסוף, assay שלנו הוא כמותי וגם יסefore נמדד דרגות של עיכוב. כתוצאה מכך, assay כבש את מכלול המידע מעכב, שבא לידי ביטוי isobolograms isocontour שבו isocontours להתחבר ריכוזים קומבינטורית עם רמות דומות של עיכוב צמיחה. 6 זה אסטרטגיה והתוויית מותרת להדמיה של עקומות קומבינטורית מנה-תגובה. כדי להמחיש המתודולוגיה שלנו, אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לביצוע מבחנים אלה ולהציג תוצאות נציג.

<table><tbody><tr><td>תאי J774A.1</td><td>אוסף תרבית מסוג אמריקאי</td><td>TIB-67</td><td>תא מארח</td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758&nbsp;</td><td>להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית</td></tr><tr><td>תמצית שמרים, 210929 בקטון-דיקינסון/דיפקו אולטרה-מסוננים</td><td></td><td></td><td>להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומצית; דרגות נמוכות יותר עלולות לגרום לפגיעה בגדילה ו/או לשנות את הרגישות של לגיונלה למעכבי גדילה</td></tr><tr><td>חומצה אלפא-קטוגלוטרית, מלח מונופוטסיום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>K2000</td><td>להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומציים בינונית</td></tr><tr><td>סודיום פירובט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>להכנת תמצית שמרי פחם חומצית אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט, dibasic</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>להכנת תמצית שמרי פחם חומצית אגר ותמצית שמרים חומצה</td></tr><tr><td>בינונית L-ציסטאין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7755</td><td>להכנת תמצית שמרי פחם חומצית אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית</td></tr><tr><td>אמוניום ברזל (III) ציטראט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879</td><td>להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ומדיום תמצית שמרים חומציים; ניתן להשתמש בפירופוספט ברזל במקום זאת אך קשה יותר לשקול במדויק</td></tr><tr><td>תמיסת אשלגן הידרוקסיד, מרוכזת</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP236-500</td><td>להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית</td></tr><tr><td>מים נטולי שוניים</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>להכנת תמצית שמרי פחם חומציים אגר ותמצית שמרים חומצה בינונית</td></tr><tr><td>תימידין (דרגת תרבית רקמות)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>להשלמת RPMI 1640 ותמצית שמרים חוצצת אגר/בינוני &mdash; ניתן להשתמש בתימידין בדרגה נמוכה יותר עבור האחרון, אך עלול לגרום לפגיעה בצמיחת תאים ו/או למוות תאים ב-RPMI 1640</td></tr><tr><td>RPMI 1640, ניסוח סטנדרטי</td><td>Corning via Thermo Fisher Scientific</td><td>10-040-CV</td><td>לגידול תאי J774A.1 לפני הציפוי; כולל 2 מ"מ L-גלוטמין</td></tr><tr><td>RPMI 1640 חסר פנול אדום</td><td>קורנינג באמצעות Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-CV</td><td>לציפוי תאי J774A.1 ב-384 צלחות באר (לא מתאים לגידול לפני הציפוי); חסר גם L-גלוטמין ו-mdash; תוספת ל-2 מ"מ לפני השימוש</td></tr><tr><td>L-גלוטמין, 200 מ"מ ב-0.85% NaCl (דרגת תרבית רקמות)</td><td>HyClone באמצעות Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>להשלמת RPMI 1640 חסר L-גלוטמין, לריכוז סופי של 2 מ"מ</td></tr><tr><td>סרום עגל בתוספת ברזל</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-510</td><td>להשלמת RPMI 1640, לריכוז סופי של 9.1%</td></tr><tr><td>תמיסת טריפן כחול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>לצביעה לקביעת מוות תאים J774A.1 תוך ספירת צפיפות התאים</td></tr><tr><td>SYTOX Green, תמיסה של 5 מ"מ ב-DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>לצביעה לקביעת מוות תאים J774A.1 על ידי קריאת פלואורסצנציה או מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי (בשילוב עם חיידקים פלואורסצנטיים כתומים-אדומים או אדומים רחוקים). יש להשתמש בריכוז סופי של 125 ננומטר.</td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-255-26</td><td>לדגירה של תאי J774A.1 (לפני ואחרי הדבקה); יכול לשמש גם לדגירה של חיידקים, או שניתן להשתמש בחממת אטמוספירה סטנדרטית במקום)</td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-01010</td><td>לנער דגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה; מתאים לאינקובטור תרבית תאים; כולל בסיס שייקר 7744-01000 ומגש 7740-01010 (אלה זמינים גם בנפרד)</td></tr><tr><td>צלוחיות שייקר (250 מ"ל)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-04</td><td>לנערוע דגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה</td></tr><tr><td>מהדקי שייקר לצלוחיות (250 מ"ל)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16250</td><td>לטלטול דגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה</td></tr><tr><td>צלוחיות שייקר (1,000 מ"ל)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-07</td><td>לניעור דגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה</td></tr><tr><td>מהדקי שייקר לצלוחיות (1,000 מ"ל)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16100</td><td>לדגירה של תאי J774A.1 לפני הדבקה</td></tr><tr><td>מכסי קצף ספוג לצלוחיות (250 מ"ל-1,000 מ"ל)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-1490-038</td><td>לדגירה מטלטלת של תאי J774A.1 לפני ההדבקה; מפחית את הסיכון לזיהום ביחס למכסי מתכת סטנדרטיים</td></tr><tr><td>MultiDrop Combi משאבה פריסטלטית רב-ערוצית הניתנת לתכנות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td>להפצת תאי J774A.1, תרחיף בינוני וחיידקי המכיל פלואורופורים למספר רב של 384 כלי באר</td></tr><tr><td>סעפת קידוח סטנדרטית Combi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td>נפח ברירת מחדל של 20 &#956; l אינו מספיק כדי לפצות על התיישבות &mdash; עלייה ל-80 &#956; l</td></tr><tr><td>לבן 384 כלים שטופלו היטב לתרבית רקמות</td><td>קורנינג</td><td>3570</td><td>לקריאת זוהר ופלואורסצנטיות; קטלוג גריינר # 781080 נבדק גם בהצלחה</td></tr><tr><td>DMSO (דרגת תרבית רקמות, באמפולות אטומות)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>להמסת תרכובות בקרה ובדיקה חיוביות</td></tr><tr><td>Azithromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1088</td><td>אנטיביוטיקה בקרה חיובית</td></tr><tr><td>Saponin (מקליפת Quillaja)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4521</td><td>פיפטור</td></tr> <tr><td></td><td>חיובי לבקרת ציטוקסיות רב-ערוציThermo Fisher Scientific</td><td>Finnpipette</td><td>להעברת כמויות קבועות של תרכובות בקרה חיוביות; הפיפטור חייב להיות בעל חלוקה דיגיטלית עם עצירות כדי לאפשר חלוקה חוזרת של נפח קבוע</td></tr><tr><td>רובוט העברת פינים</td><td>של Epson Epson/ICCB-L</td> <td>(ציוד מותאם אישית)</td> <td>להעברת כמויות קבועות של תרכובות בדיקה ממערכי ספרייה</td></tr><tr><td>מערכת ניפוק דיגיטלית D300</td><td>Hewlett-Packard באמצעות Tecan</td><td>D300</td><td>להעברת כמויות משתנות של תרכובות בדיקה הנעות בין 11 פיקוליטר ל-10 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>מחסניות T8+ למערכת חלוקה דיגיטלית D300</td><td>Hewlett-Packard באמצעות Tecan</td><td>T8 +</td> <td>לחלוקת תרכובות בדיקה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מצלמה דיגיטלית המחוברת למחשב</td><td>Nikon</td><td>Ti</td><td>להדמיית תאים חיים; כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי יכול להחליף, בניגודיות פאזה או אופטיקה DIC, המסוגל לדמות ירוק (פלואורסצאין), כתום-אדום לאדום (טקסס אדום) ואדום רחוק (Cy5), עם שמן פי 100 מטרה לרזולוציה הגבוהה ביותר</td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמה עם תחתית זכוכית</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>להדמיית תאים חיים. צלחות כמו ה-MatTek מאפשרות הדמיה מיקרוסקופית בהגדלה של 600X או 1,000X באמצעות שימוש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי הפוך. כלים ספציפיים אלה הם בקוטר נומינלי של 3.5 ס"מ, קוטר פנימי של 3.3 ס"מ, עם החלקות כיסוי בעובי 20 מ"מ #1.5 המוכנסות לתחתית.</td></tr><tr><td>ניתן להשתמש בפוטושופ CS6</td>, <td>ב-Adobe</td><td></td><td>, בפוטושופ או בתוכנות דומות כדי למזג תמונות בהיר, מיקרוסקופיות ופלואורסצנטיות.</td></tr><tr><td>Mathematica 10</td><td>Wolfam</td><td></td><td>ליצירת איזובלוגרמות איזוקונטור דו-ממדיות ואיזובולוגרמות פני שטח תלת מימדיות.</td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים cytotoxicity cell איקריוטיים

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

מדדים מסורתיים של פעילות מיקרוביאלית תאיים cytotoxicity תא אוקריוטים להסתמך על מבחני הסיום. מבחני הסיום כאלה דורשים כמה צעדים ניסיוניים נוספים לפני readout, כגון תמוגה התא, נחישות יחידת המושבה להרכיב, או בנוסף מגיב. בעת ביצוע אלף מבחנים, למשל, במהלך הקרנת תפוקה גבוהה, המאמץ במורד הזרם הנדרש עבור סוגים אלה של מבחנים הוא ניכר. לכן, כדי להקל על גילוי מיקרוביאלית תפוקה גבוה, פתחנו assay בזמן אמת לזהות מעכבים הזמניים של התפתחות חיידקים תאית ולהעריך cytotoxicity תא האיקריוטים. באופן ספציפי, זיהוי התפתחות חיידקים תאית בזמן האמת היה מופעל על ידי סימון זני הקרנה חיידקי גם עם אופרון לוקס בקטריאלי (1 assay דור st) או כתבי חלבון פלואורסצנטי (2 דור nd, assay המאונך). לצבוע רעיל, קרום התא-impermeant, חומצות גרעין מחייבגם נוסף במהלך הדבקה ראשונית של מקרופאגים. צבעים אלה אינם נכללים תאי קיימא. עם זאת, תאי מארחים לא-ישימים לאבד שלמות קרום המתיר כניסה וסימון ניאון של DNA הגרעיני (חומצת deoxyribonucleic). יש לציין, DNA כריכה קשור לעלייה גדולה תשואת קוונטים פלורסנט המספקת הודעת פתרון המבוסס על מות תא מארח. השתמשנו assay המשולב הזה לבצע מסך תפוקה גבוהה בפורמט microplate, ועל מנת להעריך את הצמיחה ואת cytotoxicity תאיים על ידי מיקרוסקופ. יש לציין, antimicrobials עשוי להפגין סינרגיה שבו ההשפעה המשולבת של שתיים או יותר antimicrobials כאשר מיושמים יחד עולה כאשר מיושמים בנפרד. בדיקת לסינרגיה במבחנה נגד פתוגנים תאיים היא בדרך כלל משימה אדירה כמו פרמוטציות קומבינטורית של אנטיביוטיקה בריכוזים שונים צריך להיבדק. עם זאת, מצאנו כי assay בזמן האמת שלנו בשילוב עם אוטומטיות, דיגיטלי מחלק הטכנולוגיה permitted בדיקות סינרגיה קליל. באמצעות גישות אלו, הצלחנו לסקור פעולה שיטתית של מספר רב של antimicrobials לבד או ביחד נגד הפתוגן התאי, pneumophila הלגיונלה.

assay צמיחה התאי microplate איור 1 דיאגרמות הצעדים assay. השלבים האוטומטיים לראות יכולים להתבצע באופן ידני. עם זאת, התפוקה היא הקל מאוד באמצעות מערכות טיפול נוזליות. איור 2 מציג תוצאות נציג מתוך microplate 384 גם,-...

בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להשתמש במערך בדיקה משולב בזמן אמת כדי לזהות מעכבים ספציפיים של מולקולות קטנות לצמיחה חיידקית תוך-תאית שאינם רעילים לתאי המאכסן. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הגילוי של חומרים אנטימיקרוביאליים. באופן ספציפי, אילו סוגי תרכובות יכולים לחדור למדורים תוך-תאיים ולהרוג פתוגנים מבלי לפגוע בתאי המאכסן?היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם הגילוי הסימולטני של צמיחת חיידקים ורעילות לתאי יונקים באמצעות בדיקות בזמן אמת שאינן הרסניות. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקלו בקשיי התמודדות עם יכולת ההרחבה (scalability) שהיא מאפשרת. בדיקה של יותר מעשרת אלף תרכובים במפגש אחד דורשת סט חדש לחלוטין של טכניקות וציוד.בנוסף ללוצ'יוס, עמיתי פוסט-דוקטורט KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn, והסטודנטית לתואר ראשון Kat Truelson, מדגימים מחויבות קהילתית לגילוי אנטימיקרוביאלי אקדמי ו למיקרוביולוגיה אבחנתית תרגומית. להכנת תאי מאכסן, תרבית J774A.1 macrophage בתליה ב-RPMI 1640, עם תשעה אחוזים של סרום עגל מועשר בברזל.בתחילה, בצעו מעברים לתאי התרבית בבקבוקי תרבית רקמה. לאחר שהתאים הגיעו למצב של התלכדות (confluent) בבקבוק תרבית רקמה של 75 סמ"ר ב-15 milliliters של מצע, פצלו את התאים על ידי גירוד ודילולם ל-65 milliliters עם אותו סוג של מצע. החזירו 15 milliliters לבקבוק תרבית הרקמה, והעבירו 50 milliliters לבקבוק ניעור חיידקי של 250 milliliters.בצעו אוורור על ידי הגדרת מהירות סיבוב של כ-120 revolutions per minute. לצמיחה עקבית, דגרו בדיוק ב-5% carbon dioxide וב-37 °C. קצרו את התאים כאשר הם מגיעים לצפיפות בטווח שבין 2.5 million cells per milliliter ל-5 million cells per milliliter.יש לוודא ששיעור התאים המתים אינו עולה על 25%, שכן תאים מתים יעלו את רעש הרקע במבחני ציטוטוקסיות. קריטי למנוע שקיעת תאים במאגרים בעת חלוקה של נפחים גדולים של מקרופאגים וחיידקים באמצעות מערכות לטיפול בנוזלים (liquid handlers). יש לנער את המאגרים בתנועות סיבוביות מדי כמה דקות במהלך החלוקה כדי למנוע חוסר אחידות בבארות של פלטת המבחן.זריעה של התאים במיקרו-פלטות לבנות בעלות 384 בארות שעברו טיפול לתרביות רקמה, בריכוז של 50,000 תאים ב-30 microliters של מצע לתרביות רקמה לכל באר. יש להדגיר את המיקרו-פלטות למשך לילה כדי להגיע ל-90% התמזגות (confluence) ביום הניסוי. הכנת פסי בקטריות לניסויים תתבצע על ידי מריחה דחוסה של האורגניזמים על פלטת BCYE חדשה והדגרה למשך יום אחד לקבלת צמיחה התמזגית.יש להחזיר את האורגניזמים למצב של סספנסיה באותו מצע לתרבית רקמות ששימש עבור תאי J774A.1. כדי לבצע את הדבקת המקרופאגים, יש להוסיף את תרכובות הבדיקה הרלוונטיות, כולל תרכובות לסריקה, וביקורות חיוביות ושליליות לעיכוב צמיחה בקטריאלית בליזיס של תאים אוקריוטיים.יש להמיס תמיסות מלאי בריכוז של 500x או יותר ב-DMSO או בתמיסה מימית, כדי לאפשר דילול מספיק של הנשא. יש לדלל חיידקים לומנסנטיים ליעד של 2.5 מיליון CFU למיליליטר במצע תרבית רקמה. לאחר מכן, יש להוסיף צבע זיהוי לחומצות גרעין שאינו רעיל ואינו חודר לממברנה בריכוז סופי של 2.5x עבור הבדיקה.הוסיפו 20 µL מתערובת זו לכל באר תרבית. הנפח הסופי של הבדיקה הוא 50 µL והריכוז הבקטריאלי הסופי צריך להיות מיליון CFU למל עבור ה-lux epron reporter, או ארבעה מיליון CFU למל עבור ה-fluorescent protein reporter. דגרו בטמפרטורה של 37 °C, למשך יום אחד עד שלושה ימים ב-5% CO2 ובלחות יחסית של 100% כדי למנוע השפעות התאדות בשולי הבארות.כדי למנוע השפעות שוליים הקשורות לטמפרטורה בעת קריאת תוצאות הבדיקה, יש להביא את הפלטות המיקרו (microplates) לשיווי משקל תרמי לפני קריאת הלומנסנסה (luminescence) על ידי הנחתן בשכבה אחת על שולחן מעבדה עם מכסים פתוחים למחצה למשך כ-20 דקות. קרא את הצמיחה הבקטריאלית והרעילות לתאי איקריוטים במכשיר לומנימטר ופלואורומטר לפלטות מיקרו, בהתאם למדווחים (reporters) שבשימוש. החזר את הפלטות המיקרו לאינקובטור אם נדרשת קריאה בזמן אמת בנקודות זמן מאוחרות יותר.נתחו את הנתונים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. עבור ניסויי תגובה למינון ובדיקת סינרגיה, הכינו מקרופאגים עם חיידקים כפי שבוצע קודם לכן. רגע לפני הדבקת המקרופאגים, או אינקובציה אקסנית (axenic), השתמשו במערכת אוטומטית לטיפול בנוזלים כדי להקל על תגובה למינון בודד במערך של בדיקת סינרגיה קומבינטורית, באמצעות הוספה אוטומטית ישירה של דילולות אנטימיקרוביאליות בהתאם לפרוטוקול היצרן.הוסיפו חומרים אנטימיקרוביאליים בעלי עניין ניסויי בסדרת מיהולים כפולים סדרתיים. המטרה היא להקיף, בקצה העליון, ריכוז המבטל לחלוטין את הצמיחה, ובקצה התחתון, ריכוז שאינו מראה פעילות ניכרת. מוצגות כאן תוצאות מייצגות לאורך זמן עבור לומניסצנציה חיידקית ופלואורסצנציה הקשורה לציטוטוКСיות.שימו לב להשפעות המנוגדות של טיפול אנטימיקרוביאלי ושל דטרגנט ציטוטוקסי לתאי איקריוטים. קביעה כפולה של תגובת מינון עבור IC50 ו-CC50 באותן בארות סריקה שימשה כדי לקבוע את הסלקטיביות עבור האנטיביוטיקה Doxycycline. שכפול חיידקים נבלם על ידי ריכוזים בינוניים של האנטיביוטיקה.עם זאת, נצפתה ציטוטוקסיות בריכוזים גבוהים, התואמת סלקטיביות של כ-100. אותו פורמט בדיקה שימש לבחינת תגובה ממיסנית דו-ממדית עבור שילובים של Minocycline ו-Azithromycin. קווי איזו-קוטור (Isocontours) מחברים נקודות של עיכוב צמיחה תוך-תאי שווה.כאן, קווי איזוקונטור (isocontours) קעורים הצביעו על השפעות סינרגטיות חזקות עבור שתי התרופות. רובוטיקה של מינון דיגיטלי להקמת הבדיקה, קריאה בזמן אמת ופורמט בעלת תפוקה גבוהה אפשרו בדיקת סינרגיה משולבת קומבינטורית. כאן, תצפית על משטח קעור בבירור מרמזת על דרגה גבוהה של אפקט סינרגטי עבור שילובים של Minocycline, Azithromycin ו-Rifampin נגד צמיחה תוך-תאית של *Legionella pneumophila*.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי השילוב של קריאת בדיקה פלואורסצנטית או לומינסצנטית עם בדיקת ציטוטוקסיות בזמן אמת בפורמט של בדיקה בסריקה גבוהה (high-throughput). בעקבות פרוצדורה זו, ניתן ליישם שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופ קונפוקאלי, כדי לענות על שאלות הנוגעות לאירועים ביולוגיים בתא שלם, אשר קשורים גם לפעילות האנטי-מיקרובית שלהם או לציטוטוקסיות של התא השלם. למרות שבחנו את ההשפעות על שכפול של legionella, ניתן ליישם את אותן טכניקות גם עבור פתוגנים תוך-תאיים אחרים, כגון Brucella ומיקרובקטריות.תכננו תחילה את הפרוטוקול הזה כאשר ניסינו למצוא בדיקה פשוטה ואמינה מספיק לשימוש בפורמט של סריקה בסביבה עם תפוקה גבוהה מאוד (high-throughput). אין לשכוח כי עבודה עם פתוגנים חיידקיים, תרביות תאים וציוד רובוטי כרוכה בסיכונים מובנים ויש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים, כגון שימוש בציוד מגן אישי מתאים בעת ביצוע הליך זה.

high-throughput-real-time-dual-readout-testing-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים assay תא בודד תפוקה גבוהה למדוד cytotoxicity של תאי T כאשר דגר עם תאי המטרה סרטניים. שיטה זו מעסיקה, מערך אלסטומרי צפוף של תת nanoliter בארות (~ 100.000 / מערך בארות) מרחבית להגביל את תאי T ותאי מטרה ביחסים מוגדרים ומצמידה למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח נטייה-היעד פעיל ואפופטוזיס שלאחר מכן.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

תאי יונקים המבטאים את קלטת גן פליטת אור...

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

כאן אנו מתארים cytotoxicity הסלולרי ומבחני infectivity סיבוב בודדים המאפשרים סינון המהיר ומדויק של תרכובות כדי לקבוע cytotoxicity הסלולרי (CC 50) וIC 50 ערכים נגד WT וסמים עמידים HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

מבחני נוירוטוקסיות משופרים במבחנה יסייעו בזיהוי תרכובות נוירו-פרוטקטיביות חדשות. התועלת של מנתח תאים מבוסס עכבה בזמן אמת לקביעת ציטוטוקסיות והגנה ציטולוגית בקווי תאים עצביים ולתיחום המעורבות של מסלולי שליח שני, ובכך להשיג תובנה במנגנון ההגנה העצבית.

Analyzer הנייד מבוססת עכבה בזמן אמת ככלי להתוות מסלולים מולקולריים מעורבים ברעילות העצבית וneuroprotection בקו תאים עצבי

Assay כל cytotoxicity הדם (אש"ל) הוא assay cytotoxicity שפותח על ידי שילוב טכנולוגיית מיקום תא תפוקה גבוהה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ועיבוד תמונה אוטומטי. כאן, אנו מתארים כיצד ניתן לנתח תאי הלימפומה שטופלו בנוגדן anti-CD20 בזמן אמת בכל דם אדם כדי לספק ניתוח cytotoxicity סלולארי כמותי.

בזמן אמת Cytotoxicity מבחני בדם כל אדם

פתחנו מערכת הקרנה מודולרית תפוקה גבוהה לגילוי תרכובות רומן נגד שחפת Mycobacterium, מיקוד תאי ב-המרק גובר חיידקים כמו גם רעילה לתאים נגד התא המארח היונק.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

מודלים ומבחנים חדשים שישפרו את תהליך פיתוח התרופות המוקדם לתרופות נגד שחפת מהדור הבא הם רצויים מאוד. כאן, אנו מתארים בדיקה מהירה, זולה ותואמת BSL-2 להערכת יעילות התרופה נגד Mycobacterium tuberculosis שניתן להתאים בקלות לבדיקה בתפוקה גבוהה.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

לעתים קרובות יש צורך להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של מערכת תרכובות על תאים מתורבתים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה למסך מהימן עבור תרכובות רעילות בפורמט 96-היטב.

אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית

הפרוטוקול מתאר תפוקה מהירה, גבוהה, אמינה, זולה, ובלתי משוחדת, לקביעת יעילות של הכדאיות הסלולרית. תסה זו שימושית במיוחד כאשר המיטוכונדריה של התאים נפגעה, מה שמפריע לאסות אחרות. ההסתה משתמשת בספירה אוטומטית של תאים המוכתמים בשני צבעים גרעיניים – Hoechst 33342 ו-propidium iodide.

תסיסה אוטומטית של כתמים גרעיניים דיפרנציאליים לקביעה מדויקת של ציטוקוקסיות מיטוקאן

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת טיפות תחליב כפולות המכילות תא T אחד ותא מטרה סרטני כדי לבחון הרג תאים ברמת התא הבודד. שיטה זו מאפשרת כימות כפול הן של מולקולות ציטוטוקסיות והן של אפופטוזיס של תאי מטרה בתוך אוכלוסייה גדולה של תאי T.

בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מועמדים פוטנציאליים לתרופות נגד שחפת באמצעות סקר פנוטיפי, הכולל סינתזה כימית של תרכובת 4-אמינוקווינולין, קביעת ריכוז המעכב המינימלי שלה נגד מיקובקטריום טוברקולוזיס, והערכת הציטוטוקסיות שלה בקווי תאים יונקים.

זיהוי מועמדים פוטנציאליים לאנטי-שחפת: מדריך שלב אחר שלב לסינתזה, קביעת MIC והערכת ציטוטוקסיות בתאי יונקים

למד שיטה לזיהוי תרכובות אנטי-מיקרוביאליות חודרות תאים איקריוטיים ללא רעילות לתאי מארח. השיטה מאפשרת זיהוי בזמן אמת של גדילה חיידקית ורעילות תאית בו-זמנית.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

גלה סרטונים נוספים