תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשתמש בשילוב יחיד של בדיקה בזמן אמת כדי לזהות מעכבי מולקולות קטנות ספציפיות של צמיחת חיידקים תוך תאיים שאינם רעילים לתאים מארחים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגילוי האנטי-מיקרוביאלי. באופן ספציפי, אילו סוגי תרכובות יכולות לחדור לתאים תוך-תאיים ולהרוג פתוגנים מבלי לפגוע בתא המארח?

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם גידול חיידקים, רעילות תאי יונקים מזוהה בו זמנית באמצעות בדיקות לא הרסניות בזמן אמת. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם המדרגיות שהיא מאפשרת. בדיקת יותר מעשרת אלפים תרכובות בפגישה דורשת סט חדש לגמרי של טכניקות וציוד.

בנוסף ללוציוס, מפגינים מחויבות קהילתית לגילוי אנטי-מיקרוביאלי אקדמי ומיקרוביולוגיה אבחנתית תרגומית הם עמיתי פוסט-דוקטורט, KP סמית', יון-סוק קאנג, ג'ניפר צאנג, תיאה ברנן-קרון וסטודנטית לתואר ראשון קאט טרולסון. להכנת תאים מארחים, תרבית J774A. מקרופאג אחד נמצא בתרחיף ב-RPMI 1640, עם תשעה אחוז סרום עגל בתוספת ברזל.

בתחילה תאי מעבר בצלוחיות תרבית רקמות. לאחר שהתאים התלכדו בבקבוק תרבית רקמה בגודל 75 סנטימטר רבוע ב-15 מיליליטר של מדיום, פצלו את התאים על ידי גירוד ודילול שלהם ל-65 מיליליטר עם אותו סוג של מדיום. מחזירים 15 מיליליטר לבקבוק תרבית הרקמות, ומעבירים 50 מיליליטר לבקבוק שייקר חיידקים של 250 מיליליטר.

אווררו על ידי הגדרת מהירות הסיבוב בכ-120 סיבובים לדקה. לצמיחה עקבית, דגרו בדיוק בחמישה אחוזי פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס. קצרו את התאים כשהם מגיעים לצפיפות בטווח של שניים וחמישה מיליון תאים למיליליטר, עד חמישה מיליון תאים למיליליטר.

ודא שאחוז התאים המתים לא יעלה על 25 אחוזים, שכן תאים מתים יגבירו את רעש הרקע במבחני ציטוטוקסיות. זה קריטי למנוע שקיעת תאים במאגרים כאשר אתה מחלק כמויות גדולות של מקרופאגים וחיידקים עם מטפלים בנוזלים. מערבב מאגרים כל כמה דקות תוך כדי חלוקה כדי למנוע אי אחידות ובארות צלחת בדיקה.

צלחת התאים בתרבית רקמה לבנה שטופלה, 384 מיקרו-צלחות באר ב-50,000 תאים ב-30 מיקרוליטר של מדיום תרבית רקמות לבאר. דגרו מיקרו-לוחות למשך הלילה כדי להשיג מפגש של תשעים אחוז ביום הניסוי. הכינו טלאים של חיידקים לניסויים, על ידי פיזור אורגניזמים בעובי על צלחת BCYE חדשה ודגירה יום אחד כדי להשיג צמיחה משולבת.

השעו מחדש את האורגניזמים באותו מדיום תרבית רקמה המשמש לתאי J774A. 1. כדי לבצע את זיהום המקרופאגים, הוסף תרכובות בדיקה מעניינות, כולל תרכובות סינון, ובקרות חיוביות ושליליות לעיכוב צמיחת חיידקים בליזיס תאים אוקריוטיים.

יש להמיס תמיסות מלאי בגדול או שווה פי 500 ב-DMSO או בתמיסה מימית, כדי לאפשר דילול מספיק של הרכב. לדלל חיידקים זוהרים ליעד של שניים וחמישה מיליון CFU למילילטר במדיום תרבית רקמות. לאחר מכן, הוסף צבע מתאים למציאת חומצות גרעין לא רעילות בשתי נקודות חמש x ריכוז הבדיקה הסופי.

הוסף 20 מיקרוליטר מתערובת זו לכל תרבית היטב. נפח הבדיקה הסופי הוא 50 מיקרוליטר וריכוז החיידקים הסופי צריך להיות מיליון CFU למיליליטר עבור מדווח lux epron, או ארבעה מיליון CFU למיליליטר עבור מדווח החלבון הפלואורסצנטי. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, למשך יום עד שלושה ימים בחמישה אחוזי פחמן דו חמצני ב-100 אחוז לחות יחסית כדי למנוע השפעות קצה אידוי.

כדי למנוע השפעות קצה הקשורות לטמפרטורה בעת קריאת תוצאות הבדיקה, אזנו תרמית את המיקרו-לוחות לפני קריאת הזוהר על ידי הצבה בשכבה אחת על ספסל מעבדה עם מכסים פתוחים למשך כ-20 דקות. קרא צמיחת חיידקים ורעילות תאים אוקריוטיים על לומינומטר מיקרופלייט ומד פלואורו בהתאם לכתבים המשמשים. החזר מיקרו-צלחות לחממה אם יש צורך בקריאה בזמן אמת בנקודות זמן מאוחרות יותר.

נתח את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לניסויי תגובת מינון ובדיקת סינרגיה, הכינו מקרופאגים בחיידקים כמו קודם. רגע לפני זיהום מקרופאגים, או דגירה אקסנית, השתמש במערכת אוטומטית לטיפול בנוזלים כדי להקל על תגובת מנה בודדת בבדיקת סינרגיה קומבינטורית שהוגדרה באמצעות הוספה אוטומטית ישירה של דילולים אנטי-מיקרוביאליים על פי פרוטוקול היצרנים.

הוסף אנטי-מיקרוביאלים בעלי עניין ניסיוני בסדרת דילול הכפלה סדרתית. המטרה היא לפרוש, בקצה הגבוה, ריכוז שמבטל לחלוטין את הצמיחה, ובקצה הנמוך, ריכוז שאינו מראה פעילות ברורה. מוצגות כאן, תוצאות מייצגות לאורך זמן עבור זוהר חיידקי ופלואורסצנטיות הקשורה לציטוטוקסיות.

שימו לב להשפעות המנוגדות של טיפול אנטי-מיקרוביאלי וחומר ניקוי ציטוטוקסי של תאים אוקריוטיים. קביעת תגובת מינון כפולה של IC50 ו-CC50 באותן בארות סינון שימשה לקביעת סלקטיביות לאנטיביוטיקה דוקסיציקלין. שכפול החיידקים עוכב על ידי ריכוזי ביניים של אנטיביוטיקה.

עם זאת, ציטוטוקסיות נצפתה בריכוזים גבוהים התואמים את הסלקטיביות של כ-100. אותו פורמט בדיקה שימש לבדיקת תגובת מינון דו-ממדית לשילובים של מינוציקלין ואזיתרומיצין. איזוקונטורים מחברים נקודות של עיכוב גדילה תוך תאי שווה.

כאן, איזוקונטורים קעורים הציעו השפעות סינרגטיות חזקות לשתי התרופות. רובוטיקה דיגיטלית להגדרת בדיקה, קריאה בזמן אמת ופורמט תפוקה גבוה אפשרו בדיקות סינרגיה משולשת קומבינטורית. כאן, תצפית על משטח קעור מובהק מצביעה על רמה גבוהה של השפעה סינרגטית לשילובים של מינוציקלין, אזיתרומיצין וריפמפין כנגד צמיחה תוך-תאית של לגיונלה פומופיליה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלב קריאת בדיקה פלואורסצנטית או זוהרת עם בדיקת ציטוטוקסיות בזמן אמת בפורמט בדיקה בתפוקה גבוהה. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות כמו מיקרוסקופ קונפוקלי לענות על שאלות לגבי אירוע ביולוגי בתא כולו, אשר ממוקמות גם עם הפעילות האנטי-מיקרובית שלהם או ציטוטוקסיות של התא השלם. למרות שחקרנו את ההשפעות על שכפול הלגיונלה, ניתן ליישם את אותן טכניקות גם על פתוגנים תוך-תאיים אחרים כמו ברוצלה ומיקרובקטריה.

הגנו לראשונה לפרוטוקול זה כאשר ניסינו להבין בדיקה פשוטה ואמינה מספיק לשימוש בפורמט סינון בעל תפוקה גבוהה מאוד. אל תשכח שלעבודה עם פתוגנים חיידקיים, קווי תאים וציוד רובוטי יש כמה סיכונים מובנים ויש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים, כגון שימוש בציוד מגן אישי מתאים בעת ביצוע הליך זה.