ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את הביטוי של מגוון רחב של גנים ברמה המשובטת. RT-qPCR מתחיל מתא בודד מייצר תוצאות אמינות ביותר עם רגישות חזקה במשך מאות דגימות וגנים.

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לצפות בביטוי גנים מרובים בתאים בודדים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון הטרוגניות של חתימות מולקולריות בתוך אוכלוסיית תאים, או חתימה מולקולרית נדירה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להעריך חתימות מולקולריות ספציפיות עם לפחות 48 גנים שונים בתאים רבים בו זמנית.

התחל הליך זה על ידי הכנת תערובת הגברה מוקדמת ל -48 תגובות בצינור של 1.5 מיליליטר. הוסף לצינור 240 מיקרוליטר של מאגר רטרו-שעתוק ספציפי, 62.4 מיקרוליטר של מאגר EDTA TE נמוך ו-9.6 מיקרוליטר של Taq DNA פולימראז. בעזרת פיפטה אלקטרונית, הפיצו 6.5 מיקרוליטר מתערובת ההגברה המוקדמת לכל אחת מ-48 הבארות בצלחת חד-תאית בת 96 בארות.

לאחר מכן, הכינו תערובת בדיקה של 0.2x בצינור של 1.5 מיליליטר. הוסף לצינור 1.4 מיקרוליטר מכל פריימר. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל-140 מיקרוליטר עם מאגר EDTA TE נמוך.

בעזרת פיפטה אלקטרונית, הפיצו 2.5 מיקרוליטר מתערובת הבדיקה 0.2x ל-48 הבארות בצלחת המיון של 96 בארות, המכילה את תערובת ההגברה המוקדמת. אוטמים את הצלחת בסרט כיסוי. מערבל את הצלחת וסובב אותה ב -280 פעמים גרם למשך דקה אחת.

תאי לימפה מולדים בודדים בכבד, או ILCs, ימוינו על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות. התחל הליך זה על ידי שימוש בצלחת ריקה של 96 בארות כבדיקה. מקם את לוחית הבדיקה על מחזיק הצלחת עם הבאר משמאל ולכיוון הנסיין.

כוונן את מחזיק הצלחת כדי לקבל טיפה במרכז הבאר האחת עם חרוזי אימות. כאשר הוא מותאם כראוי, הנח את לוחית המיון בעלת 96 הבארות והתא היחיד המכילה את תערובת הבדיקה ואת ההגברה המוקדמת על מחזיק הצלחת. צייר את פריסת הלוח, ומיין תא אחד לכל באר של האוכלוסייה המגודרת.

המיקום הנכון של כל תא על לוחית המיון של 96 בארות, תא יחיד הוא חיוני, ויש לשמור על פריסת צלחת בתוכנת גיליון אלקטרוני. השאירו באר אחת המכילה תערובת בדיקה של 0.2x ותערובת הגברה מוקדמת ללא תאים, כבקרה ללא קלט. לחלופין, השאירו שתי שורות של שש בארות לדילול cDNA כבקרות ליעילות פריימר.

מיד לאחר מיון התא הבודד, מערבולת וסובב את לוח המיון של 96 בארות, תא בודד. הנח את הצלחת במחזור התרמי. בצע תמלול הפוך והגברה מוקדמת כפי שמצוין.

נדרשת הגברה מוקדמת של גני מטרה ספציפיים על תאים בודדים ממוינים על מנת שיהיה מספיק חומר. לדלל את הדגימות המוגברות מראש על ידי הוספת 36 מיקרוליטר של מאגר EDTA TE נמוך לכל באר. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו 191 מיקרוליטר של מאסטר מיקס על ידי פיפטינג של 175 מיקרוליטר של qPCR Master Mix, ו-17.5 מיקרוליטר של מגיב טעינת הדגימה לתוך צינור של 1.5 מיליליטר.

על צלחת חדשה של 96 בארות, חלקו 3.6 מיקרוליטר של תערובת המאסטר לכל אחת מ-48 הבארות. זוהי צלחת הדגימה של 96 בארות. העבר 2.9 מיקרוליטר של cDNA מוגבר מראש מלוח המיון של 96 בארות, תא יחיד לצלחת הדגימה החדשה של 96 בארות, תוך שמירה על אותו מיקום עבור כל דגימה בין שתי הלוחות.

הכן צלחת בדיקה של 96 בארות על ידי חלוקת שלושה מיקרוליטרים של ריאגנט טעינת בדיקה לכל אחת מ-48 הבארות על צלחת חדשה של 96 בארות. הוסף שלושה מיקרוליטר פריימרים לכל באר. המיקום הנכון של כל פריימר בצלחת הבדיקה של 96 בארות הוא חיוני.

שמור פריסת לוחית בתוכנת גיליון אלקטרוני. כדי להתחיל בהליך זה, הנח את המעגל המיקרופלואידי המשולב, או IFC, על הספסל, ובדוק את השסתומים באמצעות מזרק. הסר את מכסה המזרק, הנח אותו בניצב לשסתום אחד ולחץ בחוזקה.

טבעת ה-O צריכה לזוז. מלאו את השבב בנוזל קו בקרה. לאחר חזרה על השלבים הקודמים עם השסתום השני, הסר את הסרט השחור מתחתית השבב.

טען את השבב לבקר IFC. במסך בקר IFC, בחר ראשוני ולאחר מכן הפעל. לאחר מכן, הוצא את השבב ואטום מחדש את הסרט השחור בתחתית השבב.

בעזרת פיפטה בעלת שמונה ערוצים, העבירו חמישה מיקרוליטר מלוח הבדיקה של 96 הבארות לצד האחד, או השמאלי, של השבב. שנה טיפים לכל באר של השבב. הימנע מיצירת בועות, ואם מופיעות בועות, השתמש בקצוות של 10 מיקרוליטר כדי להסיר אותן.

מלא את הצד השמאלי של השבב כפי שמצוין. באותו אופן, מלאו את הצד הימני של השבב באמצעות חמישה מיקרוליטר מצלחת הדגימה של 96 בארות. להצלחת ניסוי זה, חיוני ששבב ה-IFC יתמלא כראוי לטעינה נכונה בבקר IFC.

הסר את הסרט הכחול מתחתית השבב, וטען את השבב לבקר IFC. במסך בקר IFC, בחר טען ערבוב ולאחר מכן הפעל. בסיום, הוצא את השבב ואטום מחדש את הסרט הכחול בתחתית השבב.

כדי להפעיל את השבב, בחר תחילה את תוכנת איסוף הנתונים במחשב ה-qPCR המיקרופלואידי. לאחר שהוא מתחיל, בחר הפעלה חדשה. בחר הוצא וטען את השבב.

לאחר הגדרת התוכנה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, בחר התחל הפעלה. התגובה תארך כ-90 דקות. כדי להתחיל בניתוח נתונים, פתח את תוכנת ניתוח ה-PCR בזמן אמת, בחר קובץ ופתח, מצא את תיקיית הניסוי ובחר שבב הפעל נקודה b m קובץ אחד.

לחץ על תצוגת ניתוח, טבלת תוצאות ותצוגת מפת חום. תיבות המסומנות ב-x נמצאות מתחת לרמת זיהוי הסף, ו/או היו להן עקומות הגברה גרועות. תן שם לדוגמאות.

עבור אל הגדרה לדוגמה ובחר SBS 96 חדש. לחץ על המיפוי ובחר את פריסת המדגם בהתאם לפריסת לוחות הדגימה של 96 בארות. העתק והדבק את עיצוב הפריסה לדוגמה מתוכנת הגיליון האלקטרוני.

הגדר את הפריסה המודבקת כשם לדוגמה. השתמש באותו הליך כדי לתת שם לבדיקות. הזן את שמות הפריימר בהגדרת הגלאי, והגדר את הפריסה המודבקת כשם הגלאי.

לחץ על תצוגת ניתוח וניתוח. בחר קובץ, ייצא ושמור כתוצאות מפת חום. באמצעות ציטומטריית זרימה, אוכלוסיות ILC בכבד מוינו על סמך סמני ILC המתבטאים באופן נרחב, והוגדרו שלוש אוכלוסיות נפרדות.

שבב ביטוי גנים מרובה תאים טעון כהלכה אמור להופיע עם קווים ישרים ושורות, כאשר כל תא תגובה מלא ובאותו ממד. שבב טעון בצורה לא נכונה יכלול קווים ריקים ושורות של תאי תגובה, כמו גם קווי כיפוף. נתון פלואורסצאין אמידיט זה של שבב טעון כהלכה מראה הבדלים בבהירות תא התגובה המופיעים לאחר מספר מחזורים.

תאי תגובה עם אות הגברה נראים בהירים יותר מתאי תגובה ללא אותות הגברה או נמוכים. לאחר מיון תאים נאותים, הגברה מוקדמת וטעינה, אוכלוסיית ILC נראתה הטרוגנית לביטוי גנים בכבד של עכברים בוגרים מסוג בר. משמאל מפת חום ללא שינויים.

בצד ימין מפת החום שהשתנתה המתקבלת לאחר הגדרת שם הדגימה והבדיקה. באמצעות תוכנה מקוונת, זוהו חתימות ביטוי גנים ספציפיות לתא וקשרי אוכלוסיית תאים. כל קו מייצג גן, וכל שורה מייצגת את אותו תא, ושלוש אוכלוסיות התאים מיוצגות בכחול, אדום וירוק.

שליטה אחת, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך תשע שעות, אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לעקוב בקפידה אחר כיוון הצלחת להפצת תאים ופריימר. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור חתימות מולקולריות נדירות וספציפיות באוכלוסיות תאים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך ביטוי גנים מרובים בתאים בודדים רבים בו זמנית, לאחר מיון תאים נכון, הגברה מוקדמת וטעינה.