גבוהה פרופיל Proteome Synaptic החלטה כמותי של אזורים במוח העכבר לאחר למידה אפליה שמיעתית

המטרה הכוללת של גישה פרוטאומית זו היא אפיון של ארגון מחדש מולקולרי בסינפסות לאחר למידה ויצירת זיכרון כדי להבין מנגנונים בסיסיים ומסלולי איתות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא גישה נטולת השערות, המאפשרת כימות ואפיון בקנה מידה גדול של פוסט-תרגום ושינויים בתוך פרוטאומים סינפטיים. זרימת העבודה המבוססת שלנו מאפשרת מתאם בין שינוי מולקולרי מסוים להתנהגות מסוימת.

למידה ויצירת זיכרון מבוססים על שינויים ביעילות הסינפטית ולכן מחקרים פרוטאומיים צריכים להתמקד יותר בניתוח מבנים סינפטיים כמו סינפטוזומים מאשר בהומוגנטים מרקמת המוח. תוצאות פרוטאומיות מייצגות מערכי נתונים מורכבים ביותר ולכן דורשים עיבוד ביואינפורמטי. התחל את האימון על ידי הנחת עכבר הבדיקה בקופסת מעבורת מוארת עמומה בתוך תא אטום לרעש.

השתמש בלוח זמנים למידה מבוקר מחשב מלא ללמידת אפליה שמיעתית. התחל בתקופת הרגלה של שלוש דקות של שקט לפני תחילת האימון. במהלך מבחני גו, החיה צריכה לעבור את המשוכה תוך שש שניות מהצגת הצליל כדי להבקיע.

במהלך ניסויים אסורים, החיה צריכה להישאר בתא הנוכחי של תיבת המעבורת במהלך שש השניות של הצגת הצלילים. בצע 30 ניסויים ו-30 ניסויים ללא כניסה בסדר פסאודו-אקראי, עם מרווח בין ניסויים של 20 שניות, כך שמפגש אחד מורכב מ-60 ניסויים ונמשך כ-25 דקות. לאחר ביצוע כל הניסיונות, החזירו את העכבר המאומן לכלוב הביתי עד להקרבה.

לאחר הקרבת העכבר והסרת המוח, מקמו את קליפת המוח השמיעתית באמצעות ציוני דרך חזותיים כולל כלי דם וצורת פני השטח. לאחר מכן השתמש באזמל ובמחט כדי לנתח באופן דו-צדדי את קליפת המוח השמיעתית כגוש רקמה מלבני. השתמשו ב-chiasma opticum כציון דרך, נתחו את קליפת המוח הקדמית כפרוסת מוח בין Bregma 3.56 ל-1.54.

נתחו את הסטריאטום כפרוסת מוח בין ברגמה 1.54 ל-0.5. והסר בזהירות את רקמת קליפת המוח. נתח את ההיפוקמפוס על ידי ייצוב המוח עם המחט דרך המוח הקטן ופתיחת קליפת המוח החל מהאונה העורפית.

הקפאת הלם ניתחה דגימות מוח בחנקן נוזלי. התחל בטיהור סינפטוזומים על ידי העברת רקמת המוח המנותחת לכלי הומוגניזציה המכילים מיליליטר אחד של מאגר קר כקרח. צנטריפוגה את הדגימות ב -1, 000 פעמים G למשך 10 דקות.

לאחר הצנטריפוגה, שמור את הסופרנטנטים. הומוגניזציה מחדש של הגלולה כמו קודם, ושלב את הסופרנטנטים. סובב את הסופרנטנטים המשולבים למשך 20 דקות ב-12,000 פעמים G.השהה מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של מאגר הומוגניזציה והומוגניזציה עם שש פעימות ב-900 סל"ד ולאחר מכן צנטריפוגה ב-1,200 פעמים G למשך 20 דקות.

במהלך הצנטריפוגה לייצור כדורי P2 מכינים שיפועי מדרגות סוכרוז בצינורות אולטרה-צנטריפוגה. התחל עם 2.5 מיליליטר של מאגר סוכרוז מולארי 1.0 ולאחר מכן השתמש בפיפטה פסטר מזכוכית כדי לשכב 1.5 מיליליטר של מאגר סוכרוז מולארי 1.2. לאחר הצנטריפוגה, הוסף 0.5 מיליליטר של מאגר סוכרוז מולארי של 0.32 לכדורי P2.

לאחר מכן הומוגניזציה מחדש באמצעות שש משיכות. טען את השברים ההומוגניים על גבי השיפועים. הנח את השיפועים העמוסים ברוטור דלי מתנדנד ולאחר מכן סובב במהירות של 85, 000 פעמים G למשך שעתיים באולטרה-צנטריפוגה.

לאחר השלמת הצנטריפוגה, השליכו את שכבת הסוכרוז המולרית העליונה של 0.32, כולל החומר בממשק למאגר הסוכרוז המולרי 1.0. אסוף סינפטוזומים בממשק חיץ סוכרוז מולארי אחד עד 1.2. הוסף 0.32 מאגר סוכרוז מולרי לשבר הסינפטוזומלי ביחס של 1.1.

מערבבים בזהירות ומסובבים בחום של 150, 000 פעמים גרם למשך שעה. סינפטוזומים נמצאים בגלולה, וניתן לתלות אותם מחדש במאגר להמשך עיבוד. ממיסים את הסינפטוזומים של כל אזור במוח של בעל חיים ב-20 עד 50 מיקרוליטר של 8 אוריאה מולרית על ידי דגירה על קרח למשך שעה באמבט אולטראסוני.

יש לדלל באחוז אחד של חומר ניקוי נשלף כדי להבטיח ריכוז סופי של שתי אוריאה מולארית. לאחר קביעת כמויות החלבון היחסיות באמצעות פיפטה SDS-PAGE, שליש משארית כל דגימה לתוך שפופרת טרייה. בצע את העיכול בתמיסה על ידי הוספת שני DTT מילי-מולרי ו-25 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט ומערבל בעדינות את הדגימה.

צמצמו את הדגימות למשך 45 דקות בחום של 20 מעלות צלזיוס. יש להוסיף 10 מילי-מולרי יוטה אצדומיד לשאריות ציסטאין קרבמידומתילאט ולערבב. דוגרים במשך 30 דקות בחושך בחום של 20 מעלות צלזיוס.

לבסוף, הוסיפו מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי טריפסין ודגרו בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. כדי להסיר את חומר הניקוי הניתן לחומצה, הוסף חומצה טריפלואורואצטית לריכוז סופי של אחוז אחד ודגירה למשך שעה נוספת בחום של 20 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה של הדגימות ב -16, 000 פעמים G למשך 10 דקות, אספו בזהירות את הסופרנטנטים.

הנח את עמודת החילוץ בשלב המוצק במתלה ואזן את המטריצה עם שני מיליליטר מתנול. לאחר הכביסה, הוסף שני מיליליטר נוספים של מאגר B וטען את הדגימה. לאחר שטיפה שלוש פעמים עם Buffer B, יש להסיר את הפפטידים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 70 אחוז אצטוניטריל ו-0.1 אחוז חומצה טריפלואורואצטית.

לאחר מכן יבש את הדגימות המטוהרות בצנטריפוגת ואקום. בדוגמה זו, בעלי חיים שאומנו במשימת הבחנת צלילי FM מראים שיעור הולך וגדל של פגיעות ושיעור יורד של אזעקות שווא במהלך מפגשי האימון. אפליה משמעותית מתרחשת מהמפגש הרביעי.

השפע הסינפטי היחסי של חלבונים נבחרים מושווה בין עכברים שאומנו במשימת הבחנת טונים FM לבין עכברי ביקורת נאיביים 24 שעות לאחר האימון הראשון. לאחר האימון, רמות החלבון CYFP2 משתנות בכל האזורים הנחקרים. אל תשכח שבעלי החיים מציגים לעתים קרובות שונות תוך-אישית.

לכן מומלץ מאוד לכלול לפחות חמישה שכפולים ביולוגיים או יותר של קבוצות בעלי חיים תואמות היטב במחקר. לאחר הקמתה, ניתן להתאים את הטכניקה הזו בקלות למינים אחרים. לדוגמה, הוא שימש לניטור שינויים בביטוי חלבונים תלויי למידה במוחות של זבוב פירות בודד.