בדיקת כימות משנית אוביקוויאין-פעילות פרוטאסדום במוח מכרסם

פרוטוקול זה מודד רמות חלבון תת-תאי בכל מקום ופעילות פרוטזום במוח המכרסמים המאפשרת בתוך הנבדקים להשוות את האופן שבו פעילות בכל מקום-פרוטאיום משתנה בתגובה לפעילות תאית, למידה או מחלה. הפרוטוקול מאפשר איסוף של שברים סינפטיים, ציטופלסמיים וגריוניים מאותו מוח מכרסמים. צמצום אובדן, זה יכול להתבצע עם כמויות רקמות קטנות וציוד מעבדה בסיסי.

הדגימה של ההליך תהיה טיילור מקפאדן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. התחל הליך זה עם איסוף ותסת של רקמת המוח מכרסמים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ודא כי חצי הכדור בשימוש הוא נגד מאוזן על פני תנאי החילוץ עבור כל קבוצת ניסוי.

הסר את מיקרוטובת הצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכילה חצי כדור אחד של אזור העניין מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. באמצעות אזמל, להעביר את רקמת המוח הקפואה כדי homogenizer זכוכית שני מיליליטר טפלון. הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר תזה לצינור טפלון.

באמצעות עלה B, הומוגניזציה אותה רקמה עם 15 משיכות עד לא כמות גלויה של חומר מוצק קיים. השתמש בתנועה מסתובבת במהלך כל קו. עם פיפט 1,000 מיקרוליטר, העבר את הדגימה ההומוגנית לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר.

מניחים את הצינור על קרח רטוב ודגירה במשך 30 דקות. מניחים את הצינור במיקרוצנטריפוגה ומסתובבים במשך 10 דקות ב 845 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלמת, להסיר בזהירות את supernatant על ידי צינורות מקום לתוך צינור microcentrifuge חדש 1.5 מיליליטר.

זה השבר הציטופלסמי. הוסף 50 microliters של חיץ החילוץ גלולה וכתוצאה מכך resuspend על ידי צינורות. אל תמערבולת את גלולה.

מניחים את הצינור המכיל את גלולה resuspended על קרח דגירה במשך 30 דקות. ואז צנטריפוגה הצינור במשך 20 דקות ב 21, 456 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את supernatant על ידי צינורות והמקום לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר חדש.

זה החלק הגרעיני. הומוגניזציה של חצי כדור אחד של אזור העניין כבעבר למעט שימוש ב- 500 מיקרוליטרים של מאגר TEVP במקום במאגר תמוגה. באמצעות פיפט 1,000 מיקרוליטר, להעביר את המדגם הומוגנית לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר חדש.

צנטריפוגה המדגם ב 1, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant ולהעביר אותו צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר חדש באמצעות פיפט 1, 000 מיקרוליטר. צנטריפוגה המדגם ב 10, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

השלך את גלולת המקורית המכילה גרעינים ואת הפסולת הגדולה. העבר את העל-טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. זה השבר הציטוסולי.

הוסף 50 microliters של חיץ הומוגניזציה גלולה resuspend על ידי צינורות עד חומר מוצק לא גלוי. צנטריפוגה המדגם ב 20, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבר את העל-טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר.

זה שבר הממברנה הסינפטוזומלי הגולמי. כדי להגדיר את ההתמדה, לפני המלחמה את קורא הלוחות ל 37 מעלות צלזיוס ולהחזיק דרך הריצה. הגדר את העירור ל 360 ננומטר ו הפליטה ל 460 ננומטר.

אם לוח 96 היטב בשימוש ברור, להגדיר את מיקום אופטיקה לתחתית. אם נעשה שימוש בצלחת 96 באר כהה, הגדר את מיקום האופטיקה למעלה. תכנת ריצה קינטית עם זמן של שעתיים סריקה כל 30 דקות.

יש ליישב מחדש את מאגר ההצגות 20S 10X המסופק בערכה עם 13.5 מיליליטר של מים אולטרה-יציבים. הוסף 14 מיקרוליטרים של ATP 100 מילימולר למאגר 1X עכשיו. פעולה זו משפרת באופן משמעותי את פעילות הפרוטזום בדגימות ומשפרת את אמינות המדגמים.

תשב מחדש את תקן AMC המסופק בערכה עם 100 מיקרוליטרים של DMSO. בצע שלבים באמצעות תקן AMC בחושך או בתנאי תאורה נמוכה מכיוון שהתקן רגיש לאור. צור עקומה סטנדרטית של AMC מסדרה של ריכוזי AMC גבוהים עד נמוכים.

עקומה זו תשמש לכיול וניתוח של פעילות פרוטזום בדגימות הומוגניות. תן מחדש את תת-התת-ת-תבליט הפרוטאזום המסופק בערכה עם 65 מיקרוליטרים של DMSO. גם לבצע שלב זה בחושך או בתנאי תאורה נמוכה כמו המצע הוא רגיש לאור.

לאחר מכן ליצור דילול אחד עד 20 של המצע proteasome בצינור microcentrifuge חדש 1.5 מיליליטר באמצעות חיץ בדיקה 20S. הוסף כמות מנורמלת של הדגימות הרצויות לצלחת 96 באר. הפעל כל דגימה בכפילות.

כמות הדגימה הדרושה משתנה בהתאם להכנת רקמות. בדרך כלל, 10 עד 20 מיקרוגרם מספיק לכל שבר תת-תאי. הביאו את נפח הבאר לדוגמה ל-80 מיקרוליטר עם מים אולטרה-חמים.

הסכום שנוסף תלוי באמצעי האחסון של המדגם שנוסף. בשתי בארות נפרדות, מוסיפים 80 מיקרוליטרים של מים בלבד. אלה יהיו החסרים של ההתנסויות.

הוסף 10 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה של 20S לכל באר, כולל גם תמונות ריקות. השתמש ב-repeater או ב-pipette אוטומטי כדי להבטיח נפח מים עקבי בין בארות. כבה את האורות או הזן חדר חשוך.

הוסף את כל 100 המיקרוליטרים של תקני AMC מדוללים ל באר חדשה באמצעות באר אחת לכל תקן. בחושך, השתמשו ב-repeater או בצנרת אוטומטית כדי להוסיף 10 מיקרוליטרים של מצע פרוטאזום מדולל ל בארות המכילות תווי סרק לדוגמה ומדגמים, אך לא את תקן AMC. מניחים את הצלחת לתוך קורא הלוח ולהתחיל את הריצה הקינטית.

בצע כימות של תגי פוליוביקיטין מגוונים בשברים תת-תאיים שונים שנאספו מרקמת המוח המכרסמת באמצעות מגוון פרוטוקולי סופג מערביים סטנדרטיים בשילוב עם נוגדנים פוליאוביקיטין ייחודיים ספציפיים לקישור. חלק מהתמונות הכתימות המערביות בכל מקום יספקו טורים של להקות נפרדות בעוד שאחרות מפיקות תבנית דמוית מריחה עם מעט או ללא קווים ברורים. לכימות כתמים מערביים בתמונה, צייר תיבה מסביב לעמודה המרחיבה את סולם הסטנדרטים המולקולריים כולו.

כוונן את התיבה אם כתמי אוביקיטין אכן נמשכים לאורך הסולם כולו. זה נפוץ עבור ליסטין 48 שינויים משתנה מאוד על פני תאים subcellular. לבסוף, הפחת את הרקע המחושב כצפיפות האופטית הממוצעת של הרקע המקיף מיד את העמודה מכל הצדדים.

מוצג כאן הוא כימות של פעילות פרוטזום בשברים שונים שנאספו מן האמיגדלה מצדד של אותה חיה. במהלך בדיקה של פעילות פרוטאזום במבחנה, יחידות פלואורסצנטיות יחסיות שזוהו גדלו מתחילתו ועד סופו של ההתגלות בשבר הסינפטי, השבר הציטופלסמי והשבר הגרעיני. מעכב הפרוטאסום בטא-לאק מנע מ-RFUs להשתנות לאורך כל הפגישה.

הבדלים תת-תאיים נצפו בפעילות פרוטזום באמיגדלה התת-תאית של אותה חיה. עלייה בפעילות הפרוטזום הגרעיני זוהתה בבעלי חיים מאומנים ביחס לפקדים שהתאמו לירידה בפעילות בתוך השבר הסינפטי. פעילות פרוטאזום ציטופלזמית נותרה בבסיס.

מוצגים כאן הבדלים תת-תאיים בכל מקום חלבון ספציפי לקישור באמיגדלה האודם של אותה חיה לאחר הלמידה. חלה עלייה בכל מקום הכולל בשבר הגרעיני לאחר למידה אשר בקורלציה עם ירידה בשבר הציטופלסמי. לאחר הלמידה, בכל מקום ליניארי גדל שבר גרעיני אבל לא שברים ציטופלסמיים או סינפטיים.

מעניין, K63 בכל מקום גדל בשבר הגרעיני לאחר למידה אשר בקורלציה עם ירידה בשבר הסינפטי. בעוד שחד-שוויון K48 גדל בשברים הגרעיניים והציטופלסמיים לאחר הלמידה, אך לא בשבר הסינפטי. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי להבין את התפלגות תת תאית ותפקוד של חלבונים אחרים בתוך אותה חיה.