Murine לימפוציטים תיוג ידי ⁶⁴ Cu-נוגדן קולטן מיקוד עבור In vivo סחר Cell על ידי PET / CT

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתייג ביציבות לימפוציטים של עכברים עם נוגדן חד שבטי רדיואקטיבי שעבר שינוי בנחושת כדי לעקוב אחר התפלגות טמפורלית של לימפוציטים ודפוסי ביות in vivo על ידי PET/CT במודלים של דלקת או סרטן בעכברים. שיטה זו יכולה לעזור להבהיר את אתרי הפעולה ואת העקרונות הביולוגיים הבסיסיים העיקריים של טיפולים מבוססי תאים, כגון טיפולים בתאי גזע ברפואה רגנרטיבית או אימונותרפיה לסרטן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הדמיה של נדידת תאים במשך 48 שעות עם ניגודיות גבוהה והשפעות מזיקות מינימליות על התאים.

שיטה זו ניתנת להעברה בקלות לכל סוג תא מעניין עם קולטנים ספציפיים הקשורים לממברנה ונוגדנים חד שבטיים מתאימים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק בתהליכי צימוד הקלטור ותיוג הרדיו, וכתוצאה מכך מקטע אימונוריאקטיבי נמוך יותר ופעילות ספציפית לתא. התחל בחיטוי עכבר DO11.10 עם 70% אתנול.

לאחר מכן תקן את הגפיים בעזרת סרט דבק, ובצע חתך מדיאלי לאורך בטן החיה. משוך לרוחב את שני צידי החתך, הפרד את העור מהצפק ואתר את בלוטות הלימפה הצוואריות, הציריות, הברכיאליות והמפשעתיות. בעזרת מלקחיים קהים, העבירו את בלוטות הלימפה למיכל של 1% FCS ב-PBS.

לאחר מכן פתח את הצפק, הפרד את הטחול מהלבלב ורקמת החיבור, ואחסן את הטחול עם בלוטות הלימפה. לאחר איסוף כל הרקמות, העבירו את הדגימות למסנן של 40 מיקרון בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, והשתמשו בבוכנת מזרק כדי להשרות את הרקמות. לאחר מכן שטפו את המסנן עם 10 מיליליטר FCS ב- PBS, ואספו את המתלה החד-תאי על ידי צנטריפוגה.

לאחר ליזה של כדוריות הדם האדומות, יש להשעות מחדש את כדורית תאי הדם הלבנים ב-PBS טרי בתוספת FCS ומיקרו-חרוזים חיוביים ל-CD4 בהתאם להוראות היצרן. לאחר 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את התאים עד 50 מיליליטר של PBS טרי בתוספת מאגר FCS, והשעו מחדש את התאים בנפח המתאים של PBS בתוספת FCS לפליטת עמודה מגנטית של אוכלוסיות התאים השליליים ל-CD4. טען את התאים על עמוד הפרדת תאים מגנטי, ואסוף את הזרימה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

בסוף הפרדת התאים המגנטיים, השתמש בבוכנה כדי לשטוף את אוכלוסיית התאים החיוביים ל-CD4 לתוך צינור חרוטי חדש, והתאם את ריכוז תרחיף תאי ה-T החיוביים ל-CD4 המבודדים ל-1 פעמים 10 לששת התאים למיליליטר במדיום שלם טרי לאחסון של ארבע מעלות צלזיוס. אסוף את התאים השליליים CD4 על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה בנוגדנים חד-שבטיים נגד CD4, אנטי-CD8, נוגדנים חד-שבטיים נגד עכברים והשלמת ארנב, ודגרו למשך 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר איסוף התאים על ידי צנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה בשלושה מיליליטר של מדיום שלם טרי, והקרינו את התאים מציגי האנטיגן שנבחרו באופן שלילי ב-30 אפורים. התאם את ריכוז התאים המציגים אנטיגן לחמש פעמים 10 לששת התאים למיליליטר במדיום שלם טרי, והוסף 100 מיקרוליטר של תאי T חיוביים ל-CD4 ו-100 מיקרוליטר של תאים מציגי אנטיגן לבארות הניסוי המתאימות של צלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות. לאחר מכן הוסף את הגירויים המתאימים לכל באר, והעביר את הצלחת לחממת תרבית תאים.

עבור תיוג רדיו של תאי TH1 ספציפיים לאובאלבומין עוף, השתמש תחילה בכיול מינון כדי לשאוב 37 מגה-בקרל של הנוגדן הרדיואקטיבי הספציפי לתאי T המעניין לתוך מזרק ללא נפח מת. לאחר מכן, הוציאו את הנוגדן לכוס תגובה, ומדדו והפחיתו את כמות התגובתיות הנותרת במזרק מהכמות שנשאבה. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מי מלח לכוס כדי ליצור תמיסה של 37 מגה-בקרל למיליליטר.

לאחר מכן, הוסף פעמיים כפול 10 לששת תאי OVA-TH1 ב-0.5 מיליליטר של מדיום שלם לכל באר של צלחת של 48 בארות, ואחריו 20 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים המסומנת ברדיו. לאחר 30 דקות באינקובטור תרבית תאים בטוח לקרינה, 37 מעלות צלזיוס ו-7.5% פחמן דו חמצני, אסוף את התאים המסומנים ברדיו בצינור חרוטי של 50 מיליליטר לשתי שטיפות ב-10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס PBS. כדי למדוד את הספיגה והפליטה של הנוגדנים המסומנים ברדיו, מיד לאחר השטיפה השנייה, העבירו פעם אחת 10 לששת תאי OVA-TH1 חד-שבטיים המסומנים בנוגדנים חד-שבטיים במיליליטר אחד של מדיום שלם לכל אחד מ-10 צינורות ספירת גמא.

גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה, והעבירו את הסופרנטנטים ל-10 צינורות ספירת גמא חדשים. לאחר מכן, שטפו את התאים במיליליטר אחד של מדיום שלם כדי להסיר כל נוגדן חד שבטי לא קשור עם תווית רדיו, והעבירו את הסופרנטנטים ל-10 צינורות ספירת גמא חדשים. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מדיום שלם טרי לתאים, ומדוד את ערכי הספיגה הראשוניים במונה גמא.

עבור הדמיית PET/CT in vivo, מיד לאחר תיוג רדיו, התאם את תאי OVA-TH1 לריכוז של חמישה כפול 10 לשבעת התאים למיליליטר ב-PBS, ושאב 200 מיקרוליטר של תאים למזרק של מיליליטר המצויד במחט בגודל 30. להזריק את התאים תוך צפקית לחיה חולה בתגובת רגישות יתר מסוג ביצית מושהה בין הפטמה הרביעית לחמישית. לאחר מכן, כדי להקל על רישום משותף של תמונות ה-PET וה-CT במהלך ניתוח התמונה, תקן נימי זכוכית המכילים תמיסת נוגדנים עם תווית רדיו מתחת למיטת בעל חיים קטן.

כאשר מגיעים לרמת ההרגעה המתאימה, יש למרוח משחה על עיני החיה ולהשתמש בצמר גפן ובסרט כירורגי כדי לשתק את העכבר על המיטה. העבירו את העכבר לסורק ה-PET, ומרכזו את שדה הראייה תוך התמקדות בריאות כדי לקבל סריקת PET סטטית של 20 דקות עם חלון אנרגיה של 350 עד 650 קילו-אלקטרון וולט. העבר את מיטת העכבר לסורק ה-CT.

באמצעות תצוגת צופים, מרכז את שדה הראייה על הריאות. רכוש תמונת CT מישורית באמצעות הקרנות 360 במהלך סיבוב של 360 מעלות במצב צעד וצילום עם זמן אקספוזיציה של 350 אלפיות השנייה ומקדם שילוב של ארבעה. המינון הרדיואקטיבי המיושם של 0.7 מגה-בקרל מפחית את כדאיות תאי TH1 ב-8% בלבד, בעוד שמינונים גבוהים יותר מדגימים השפעה בולטת עוד יותר.

בהשוואה לתיוג רדיו עם נחושת-PTSM, לעומת זאת, לא נצפה יתרון משמעותי לנוגדנים המסומנים ברדיו. תאי TH1 המסומנים בנוגדנים רדיואקטיביים ספציפיים לתאי T אינם מראים אובדן פונקציונליות כפי שמעידים הפרשת אינטרפרון גמא, ירידה בפליטת רדיואקטיביות ואינדוקציה מופחתת של אפופטוזיס בהשוואה לתאי TH1 המסומנים בנחושת-PTSM. כאן, מוצגות תמונות PET סטטיות ברזולוציה גבוהה ו-CT אנטומי לאחר העברה מאמצת של תאי הנוגדן החד-שבטי המסומנים ברדיו, כאשר התמונות מתמזגות בתצוגה העטרתית, הצירית והסגיטלית בעזרת נימי זכוכית הממוקמים כפי שהודגם זה עתה.

נפחים מעניינים צוירו על בלוטות הלימפה הריאתיות והפריתימיות בתמונות ה-PET המתוקנות והנורמליות כדי לחשב את אחוז המינון המוזרק לסנטימטר מעוקב. מעקב אחר נדידת תאי OVA-TH1 לבלוטות הלימפה הריאתיות והפריתימיות כאתרי הצגת ביציות בתגובת רגישות יתר מסוג מושהה בדרכי הנשימה מגלה כי אותות ה-PET in vivo הנגזרים מתאי OVA-TH1 של הנוגדן החד-שבטי המסומנים ברדיו גבוהים משמעותית מהאותות מהתאים המסומנים בנחושת-PTSM. יתר על כן, ערכי ספיגת תאי OVA-TH1 היו מוגברים באופן משמעותי בבעלי חיים חולים עם תגובת רגישות יתר מושהית בהשוואה לחברי הביקורת שלהם שלא טופלו.

לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור את התפקידים ואתרי הפעולה הספציפיים של תאי חיסון במודלים של מחלות אנושיות בבעלי חיים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכל סוג תא עשוי להגיב באופן שונה לרדיואקטיביות ולהתאים את כמות הרדיואקטיביות המשמשת לתיוג בהתאם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולתרבית תאי T ספציפיים לאנטיגן, לתייג תאים אלה עם נוגדן רדיואקטיבי ולדמות את קינטיקה ההתפלגות והביות שלהם עם PET/CT.

אל תשכח שעבודה עם רדיואקטיביות עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון שימוש במיגון עופרת מתאים, מזעור זמני החשיפה ומקסום המרחק למקור הרדיואקטיבי בעת ביצוע הליך זה.