Name: Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: למד כיצד ללכוד ולנתח מתחמי חלבון נייטיביים מליזטים של רקמות באמצעות אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד דו-ממדי. שיטה זו מאפשרת ייצוב אגודות חלבוניות לא יציבות ומסייעת בזיהוי מורכבים חלבוניים בתנאי שמור על מבנה טבעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

בתמיכת DA034783 NIH / NIDA. אנו מודים בריאן א קילינגר לקבלת סיוע טכני עם-עמוד multimer.

1. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של 4x חיץ מדגם BN-עמוד (200 מ&quot;מ Bis (2-hydroxyethyl) אמינו-טריס (hydroxymethyl) מתאן (BIS-טריס), 200 מ&quot;מ NaCl, 40% w / גליצרול נ, 0.004% Ponceau S, pH 7.2 ). הערה: פתרון מניות זה עשוי להתבצע מראש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 250 μL של חיץ מדגם 4x ב 750 μL DH 2 O המכילים מעכבי פרוטאז קוקטייל מסחרי 1x. וורטקס ומקררים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize 20 מ&quot;ג של רקמת היעד מ&quot;ל 1x 1 קרים כקרח חיץ מדגם BN-עמוד עם 30 משיכות של homogenizer dounce נקי. הערה: לצורך ניסוי הפגנה זו, רקמת היעד היא רקמת מוח עכברוש כולו. לאחר הומוגניזציה, דגימות ניתן לטפל עם כזה חומר ניקוי עדין כמו 2% digitonin כדי solubilize ולהתיר אלקטרופורזה של חלבונים בממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את homogenate אל צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge, צנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 30 דקות עד גלולת תוכן סלולארי מסיס. Afteצנטריפוגה r, למזוג supernatant לתוך צינור נקי על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל בהתאם להוראות היצרן כדי למדוד ריכוז חלבון supernatant באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) או assay quantitation חלבון דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המדגם homogenate (ים) מכילים חומר ניקוי, להוסיף כמות 5% Coomassie כחול G-250 בתמיסה מימית מספיק כדי להביא את הפתרון homogenate ל 0.25% Coomassie. </li></ol> 2. BN-עמוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 25 מ&quot;ל 20x ילידי כחול (BN) אלקטרופורזה למלאי (1.0 M Bis-טריס, 1.0 M tricine, pH 6.8) לתוך 475 מ&quot;ל DH 2 O המכיל 0.002% Coomassie כחול לעשות 500 מ&quot;ל של חיץ ריצה 1x. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות מכילים חומר ניקוי, במקום לעשות 250 מ&quot;ל של חיץ ריצה 1x המכיל 0.02% Coomassie ועוד 250 מ&quot;ל המכיל אף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ צ&#39;יל (ים) 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה ולהרכיב ג&#39;ל polyacrylamide לשפוך קלטת בהתאם להוראות היצרן. </li><li&gt; יוצק ג&#39;ל polyacrylamide BN (3% בשכבת T ערמה, 6% T שכבת יישוב) על פי מתכון סטנדרטי 7, ולמקם את המסרק היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;לים יש polymerized, יש לשטוף את הקלטת עם DH 2 O ולהרכיב מנגנון אלקטרופורזה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המסרק היטב ולמלא את הבארות עם 1x חיץ ריצת BN-עמוד. הימנע מילוי החדר הפנימי כולו עם חיץ עד דגימות נטענות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות מכילות חומר ניקוי, למלא את הבארות עם המאגר המכיל 0.02% Coomassie כחולים. הערה: בצע שלבים 2.7-2.9 ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת טיפים ג&#39;ל טעינה, פיפטה בנפח של homogenate המכיל 20 מיקרוגרם של חלבון לתוך הבארות הרצויות. פיפטה בהיקף שווה ערך של חיץ מדגם BN-עמוד 1x לתוך כל בארות בשימוש. הערה: השתמש ריכוז החלבון נקבע מן assay BCA לחשב נפח מתאים של homogenate להוסיףהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגימות נטענות, למלא את התא הפנימי עם חיץ ריצת BN-עמוד 1x. הקפד הג&#39;ל הוא שקוע לגמרי במאגר. הבא, למלא את החדר החיצוני עם חיץ ריצת 1x לרמה שצוינה על ידי היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות מכילים חומר ניקוי, למלא את התא הפנימי עם חיץ 1x המכיל 0.02% Coomassie כחול, ואת החדר החיצוני עם חיץ ריצה 1x צבע ללא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את האלקטרודות על אספקת החשמל, וכן electrophorese החלבונים הג&#39;ל על 150 V עד הלהקה צבע מתקדמת ~ 2 ס&quot;מ לתוך שכבת לפתרון. עצור לנתק את אספקת החשמל. </li></ol> 3. cross-linking הערה: בצע שלבים 3.1-3.6 ב 4 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את מנגנון אלקטרופורזה, ולהפריד את שמשות הזכוכית של קלטת ג&#39;ל. סר וזורק את שכבת הערמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחתוך את הג&#39;ל ממש מתחת לקצה התחתון של חזית צבע. לקחתאכפת לעשות חתך זה כמו חלק וישר ככל האפשר, ולאחר מכן למחוק את החתיכה בשימוש של ג&#39;ל. זה ישאיר ~ 2 ס&quot;מ רוחב, רצועה אופקית של ג&#39;ל polyacrylamide, אשר יכיל את כל החלבון במדגם homogenate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך משם שום חלקים בשימוש לאורך הקצוות של רצועת ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום רצועת לתוך בופר פוספט 10 מ&quot;ל (PBS) במיכל קטן, ומערבבים בעדינות ידי nutation למשך 30 דקות כדי לאזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איזון, להשליך ולהחליף את PBS עם 10 אחר מ&quot;ל. פיפטה 500 μL של 25 מ&quot;מ DSP מומס sulfoxide דימתיל לתוך PBS, וממשיכים לערבב כמו לעיל (שלב 3.4) למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את פתרון DSP. להוסיף 10 מ&quot;ל של 0.375 M טריס (hydroxymethyl) הידרוכלוריד aminomethane (Tris-HCl), pH 8.8, המכיל סולפט dodecyl 2% נתרן (SDS) כדי להרוות את DSP unreacted. המשך nutation עבור 15 דקות. </li></ol> 4. SDS-PAGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד רצועת הג&#39;ל מרווה, להכין SDS-PAפתרונות ג&#39;ל GE פי שיטות סטנדרטיות 9. אל תוסיף ריאגנטים פילמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המרווה, להחזיר את רצועת ג&#39;ל ΒΝ לטמפרטורת חדר, והטיל את הרצועה לתוך קלטת ג&#39;ל חדשה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, בזהירות להרים את ג&#39;ל ולמקם אותו לצלחת spacer קלטת ג&#39;ל נקיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט הרצועה כך התחתון של חזית הצבע הוא קרוב ביותר אל גבי קלטת חדשה (כלומר, בצד כי נסע רחוקה במהלך-העמוד BN יש קרוב העליון של הקלטת החדשה; רצועת ג&#39;ל יש התהפכה מ שלה לפני נטייה). ראה איור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הרצועה כך הקצה העליון שלה טמון גם עם שם בקצה העליון של הצלחת לכסות יהיה (כלומר, זה יהיה בראש של ג&#39;ל החדש). ודא מול צבע מקביל הקצוות האופקיים של צלחת זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Push צד אחד של הרצועה ניכרה נגד אחד קירות spacer, ומשאיר מקום על tהוא הצד השני של ג&#39;ל יימזג ורמת חלבון או סולם כדי לטעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הקצה התחתון של רצועת ג&#39;ל המכיל כל אזורים משוננים או לא אחידים, בזהירות לחתוך אותם. אם הווה, הם יהיו בועות מלכודות במהלך ג&#39;ל לשפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ברצועת ג&#39;ל ממוקמת כראוי, להניח את הצלחת לכסות על צלחת spacer. להפעיל לחץ עדין כדי לדחוף את כל בועות אוויר שנלכדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להרכיב מנגנון מזיגת ג&#39;ל על פי הוראות היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ריאגנטים פילמור למאגר ג&#39;ל לפתרון, ושופכים אותו לתוך קלטת ג&#39;ל מוכן, בעזרת פיפטה סרולוגיות. מלא את קלטת ג&#39;ל אל ~ 2 סנטימטרים מתחת לרצועת ג&#39;ל BN-עמוד הניכר, כדי להשאיר מקום לשכבת הערמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL butanol מעל הג&#39;ל נשפך, ולאפשר 30 דקות עבור פילמור של השכבה לפתרון. יוצקים את butanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ריאגנטים פילמור לפתרון ג&#39;ל הערמה. באמצעות serologפיפטה iCal, שופכים את השכבה בערימה כדי למלא את כל החלל הריק שנותר קלטת ג&#39;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את קלטת ג&#39;ל כשכבת הערמה היא שפכה כדי שימלא את החלל מתחת לרצועת ג&#39;ל, ובועות אוויר לא לכודים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ככל החיץ לערום ג&#39;ל הממלא את חלל הריק מתחת לרצועת ג&#39;ל, בהדרגה להחזיר את קלטת ג&#39;ל אל בסיס רמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך למלא את החלל הריק ליד רצועת ג&#39;ל נכרת עם חיץ ג&#39;ל הערמה, עד שהוא כמעט גולש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שכבת לערום לפלמר עבור 30 דקות. הערה: הפוך חיץ ריצה 10x SDS-PAGE (250 מ&quot;מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס), 1.9 מ &#39;גליצין, 1% SDS) בעוד ג&#39;ל הוא polymerizing. זה יכול להיות גם מראש ולאחסן בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 50 מ&quot;ל 10X SDS-PAGE ריצה חיץ המניות לתוך 450 מ&quot;ל DH 2 O לעשות חיץ עובד 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שכבת הערמה יש polymerized, להסיר את קלטת ג&#39;ל מן לשפוךהמנגנון, לשטוף עם DH 2 O, ולהרכיב מנגנון אלקטרופורזה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא את החדר הפנימי לגמרי עם חיץ ריצת SDS-PAGE 1x, ולאחר מכן למלא את החדר החיצוני לרמה שצוינה על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טענתי את החלל הבא לרצועת ג&#39;ל נכרתה עם סולם משקל מולקולרי או תקן חלבון מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף אלקטרודות אספקת החשמל, וכן electrophorese דגימות ב 120 V. כאשר הצבע Coomassie בורח הג&#39;ל, להפסיק ולנתק את אספקת החשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הג&#39;ל באמצעות שיטות סטנדרטיות של electroblotting וזיהוי חלבונים על ידי נוגדן מחייב 10. </li></ol>

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+as+a+collection+of+protein+machines%3A+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li>
<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).</li>
<li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+methods+for+detection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).</li>
<li>Ho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry.</a> Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Beisiegel, U. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.1150070102/abstract">Protein Blotting.</a> Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).</li>
<li>Killinger, B. A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+alpha-Synuclein+Multimer+Stoichiometry+in+Complex+Biological+Samples+by+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis.</a> Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).</li>
<li>Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein.</a> PLoS One. 8 (11), e81314(2013).</li>
<li>Wong, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWong%2C+SS+%22Chemistry+of+protein+conjugation+and+cross-linking%22">Chemistry of protein conjugation and cross-linking</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1991).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+proteins+in+detergent+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane proteins in detergent solutions.</a> Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).</li>
<li>Peters, K., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking%3A+reagents+and+problems+in+studies+of+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure.</a> Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).</li>
<li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+of+extended+biological+structures%3A+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+%5B35S%5Ddithiobis%28succinimidyl+propionate%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate).</a> J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).</li>
<li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+mitochondrial+respiratory+membrane+protein+complex+II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II.</a> Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
</ol>

החוקרים אין לחשוף.

אינטראקציות חלבון-חלבון חשובות עבור כל משימת חי דברים לפועל. מסיבה זו, הם מושא לביקורת ומחקר אינטנסיבי. Multimer-עמוד הוא שיטה חדשנית עבור לכידה, מפריד, וניתוח מגוון רחב של קומפלקסי חלבונים. הוכחנו ישימותה בעבר לומד oligimerization של 11-synuclein α חלבון הקשורים למחלות. עם זאת, היא ניתנת להרחבה ל קומפלקסי חלבונים רבים, כפי שמודגם באיור 2. בהשוואה לשיטות אחרות של לימוד קומפלקסי חלבונים,-עמוד multimer הוא יתרון בגלל הפשטות הקוצרת שלה. שעת ממ...

<html> פונקציה סלולרית רגילה תלויה אינטראקציות חלבון-חלבון 1, 2. כתוצאה מכך, מחל אנושיות מסומנות לעתים קרובות על ידי הפרעות באסיפה וההתנהגות של קומפלקסי חלבונים שונים 3. היכולת לאפיין אינטראקציות כזה ולכן הוא קריטי. נוכחי אמצעי לגילוי אינטראקציות אלה דורשים טיהור של חלבונים היעד, לעתים קרובות ואחריו הנפתח של השותפים באינטראקציה שלהם. טיהור קונבנציונלית מושג על ידי צנטריפוגה הפרש, משקעים, ו / או כרומטוגרפיה 4. שיטות אלה הן זמן רב, יש לשנותו לכל חלבון מטרה, ולעתים קרובות לגרום תשואות נמוכות. שיטות לטיהור מודרניות לערב את ההיתוך של תגי פפטיד למקד חלבונים, ואחריו immunoprecipitation או חילוץ על עמודות עמוסות חרוזים מאוגדים מולקולה לכידה 5,&quot;&gt; 6. אמנם זה להרחבה לחלבונים רבים, זה דורש שינוי רצף של היעד, וכתוצאה מכך לגרום מבנים שונים בזיקת השותפים המחייבים הרגיל שלהם. האופי העדין של כמה אינטראקציות חלבון-חלבון אומר ששיטה זו לא יכולה להיות רלוונטית לתרחישים רבים. בנוסף, מבחני הנפתח משמשים למיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא יכולים ללכוד תמונת הסלולר מדויקת, בשל מעלות מוגבלות של חופש ורמות שאינם ילידים של חלבון הפיתיון. באופן אידיאלי, מתחמי החלבון ניתן היה לזהות מדינות האם שלהם, ללא צורך טיהור או הנפתח. ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידי כחול (BN-עמוד) פותחה כחלופה פחות-denaturing כדי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE), ומאפשר הפרדה של כמה חלבונים מתחמי מ דגימות ביולוגיות 7. עם זאת, חלבונים ב-עמוד BN להפריד מבוסס על לארGE מספר משתנים, כולל גודל, מטען, תלת ממדי המבנה, והקשר עם מולקולות אחרות. האינטראקציות של הגורמים הללו לעתים לגרום שיתוף הפרדת חלבונים, היווצרות המצרפי, ורזולוצית להקת חלבון ירודה. דו ממדי ילידים-polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה פותרת חלק, אך לא כולם, של בעיות אלו 8. כדי לעקוף את הסיבוכים הקשורים הפרדה מקומית, חלק מחברים להשתמש ריאגנטים אמינים-reactive cross-linking, כגון dithiobis (propionate succinimidyl) (DSP), כדי ללכוד קומפלקסי חלבוני lysates רקמות 4. lysates מטופלים אלה לאחר מכן ניתן מפוגל מופרד SDS-PAGE, תוך שמירה על הגודל ואיפור יליד מתחמי חלבון. עם זאת, מאז ריאגנטים cross-linking מגיב מבוססים על קרבה של מולקולה אחת לאחרת, וחלבונים ב lysates רקמות יש דרגות חופש רבות ויכולים stochastically אינטראקציה, צלב רקע ספציפי-linking יכול להיות גבוה, במיוחד דגימות מרוכזות. זה יכול להוביל לתוצאות קשות לפרש. הנה, אנחנו מדגימים את השימוש בשיטה היברידית BN-עמוד / SDS-PAGE, כינה ג&#39;ל אלקטרופורזה multimer-polyacrylamide (multimer-עמוד), להפריד ולהבחין מכלולים החלבון תערובות מורכבות. בתחילה, lysate התא מושעה ב ג&#39;ל polyacrylamide באמצעות BN-עמוד. הג&#39;ל המכילים lysate אז הוא הגיב עם DSP ריאגנט cross-linking. Pseudo-משותק ואינו מופרד מעט על ג&#39;ל, חלבונים הם הרבה פחות סביר להגיב nonspecifically, כלומר תגובתיות רקע צולב מקשר מצטמצמות. לאחר cross-linking, להקות ג&#39;ל הם נכרתו ומופרדים באמצעות SDS-PAGE. הג&#39;ל כתוצאה מכן ניתן לנתח בכל אמצעי הקשורות בדרך כלל ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide. שיטה זו מאפשרת הפרדה וזיהוי של קומפלקסים חלבונים ילידים lysate רקמות ללא שינוי, ללא צורך טיהור נוסף או למשוך-דאוn.

<table><tbody><tr><td><חזק>כימיקלים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&אפסילון;-חומצה אמינוקפרואית</td><td>סיגמא</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד</td><td>אקרוס אורגני</td><td>164855000</td><td>רעילה.</td></tr><tr><td>אקרילאמיד/ביסקרילאמיד 37.5:1 (תמיסת מלאי 40%T)</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>רעיל.</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>סיגמא</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>אנטי ארנב IgG-HRP מעיז</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חומצה ביסינצ'ונינית</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>בוטנול</td><td>פישר מדעי</td><td>A399-1</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מצע כימילומינסנציה</td><td>ThermoFisher</td><td>24078</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie כחול G-250</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>רעיל.</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>דיתיוביס (succinimidylpropionate)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>22585</td><td></td></tr><tr><td>חלב יבש ללא שומן</td><td>LabScientific</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>פישר Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל</td> <td>מעכב פרוטאז להפסיקThermofisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>לטיטרציה. קאוסטי.</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A412-4</td><td>להפעלת ממברנת PVDF. רעיל.</td></tr><tr><td>מונוקלונלי אנטי &אלפא;-סינוקלאין IgG מארנב</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-methylenebisacrylamide</td><td>Acros Organics</td><td>16479</td><td>רעיל.</td></tr><tr><td>NP40</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-872</td><td></td></tr><tr><td>פוליסורבט 20 (tween-20)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>ממברנות העברת פלואוריד פוליווינילידן</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט monobasic</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Thermo Scientific</td><td>88265</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת SDS (10% w/v)</td> <td>BioRad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>סיגמא</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (מאגר 0.5 M, pH 6.8)</td> <td>BioRad</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (מאגר 1.5 M, pH 8.8)</td> <td>BioRad</td><td>161-0798</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק> מספר קטלוגי</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Imagequant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-10</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת</td><td>ImageJ NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 קורא מיקרו-פלטות</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Former + Stand</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרופוגה 22R צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל הומוגנייזר</td><td></td><td></td><td></td>dounce</tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר רקמות אולטרסאונד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB120220</td><td></td></tr></tbody></table>

multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

ישנן שיטות רבות מפותחות לטיהור ולומד חלבונים ופפטידים יחידים. עם זאת, רוב הפונקציות הסלולר מבוצעות על ידי רשתות של קומפלקסי חלבוני אינטראקציה, אשר לעתים קשה לחקור, כי הכבילה אינה ניתן קוולנטיים ומודאג בקלות על ידי טכניקות טיהור. עבודה זו מתארת ​​שיטה של ​​ייצוב ומפריד קומפלקסים חלבונים ילידי מרקמות ללא שינוי באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו מימדי. lysate רקמות נטען על ג&#39;ל polyacrylamide כחול שאינם ילידי-denaturing, אז זרם חשמלי מוחל עד חלבון נודד מרחק קצר לתוך הג&#39;ל. רצועת ג&#39;ל המכיל חלבון שמועבר הוא נכרת אז וטופחו עם אמין-reactive-הצלב המקשר dithiobis ריאגנט (propionate succinimidyl), אשר קוולנטית מייצב קומפלקסים חלבונים. רצועת ג&#39;ל המכיל מתחמי צולבים אז הוא יצוק לתוך ג&#39;ל polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן, ו tהוא מורכב הם מופרדים לחלוטין. השיטה נשענת על טכניקות וחומרים המוכרים לרוב הביולוגים המולקולריים, כלומר היא זולה וקלה ללמוד. אמנם היא מוגבלת ביכולת שלה להפריד בין מכלולים גדולים מאוד, ולא הצליחה באופן אוניברסלי, אבל השיטה היתה מסוגלת ללכוד מגוון רחב של קומפלקסים שנלמדו היטב, וישימה ככל הנראה למערכות רבות של עניין.

בניסוי זה הפגנה, multimer-PAGE בוצע על lysate מוח שלם חולדה. החלבונים שהופרדו כתוצאה מכך היו מסוממים על ממברנות polyvinylidene diflouride (PVDF), ולאחר מכן לחקור עם נוגדנים נגד חלבונים הידועים כדי ליצור קומפלקסים. איור 1 מציג אימות של הפרוטוקול בשני אמצעים. ראשית, אנו מדגימים כי חלבונים צולבים הם מחוספס על ידי תוספת של סוכן הפחתת, כלומר גבוה יותר משקל המולקולרי משקל מיוצרים נוצרות על ידי מגיב חוצה מקשר, ולא בשל כל רכיב אחר של הפרוט...

שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת.

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לאפשר לחוקרים ללכוד, להפריד ולנתח קומפלקסים של חלבונים טבעיים שחולצו מליזטים של רקמות באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד. שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים הלומדים חלבונים מכיוון שהיא מסוגלת לייצב קשרי חלבונים שאלמלא כן היו לא יציבים תחת תנאים דמויי-טבע, ובכך לאפשר את זיהוים ואת ניתוחם בהמשך. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בשיטות ביולוגיות נפוצות, ולכן היא own ישימה באופן רחב וניתנת להתאמה למטרותיו של החוקר הבודד.כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את הניתוח להרצת โปรטאינים בג'ל פוליאקרילאמיד בשיטת Blue Native כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. חברו את האלקטרודות לספק הכוח והריצו את החלבונים בג'ל במתח של 150 volts עד שפס הצבע יתקדם כ-שני סנטימטרים לתוך שכבת ההפרדה (resolving layer). בנקודה זו, הפסיקו את ההרצה ונתקו את ספק הכוח.לאחר פירוק מכשיר האלקטרופורזה, הפרידו את לוחות הזכוכית של קסטת הג'ל. הסירו והשליכו את שכבת הריכוז (stacking layer). חתכו בזהירות את הג'ל ממש מתחת לקצה התחתון של חזית הצבע, תוך הקפדה על ביצוע חיתוך חלק וישר ככל האפשר.לאחר מכן, השליכו את חלק הג'ל שאינו בשימוש. גזרו חלקי ג'ל מיותרים מקצות רצועת הג'ל. הניחו בזהירות את הרצועה לתוך 10 milliliters של phosophate buffered saline במיכל קטן וערבבו בעדינות על ידי ניעור במשך 30 דקות להגעה לשיוו

multimer-page-method-for-capturing-resolving-protein-complexes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

התא חדיר crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] מייצב אינטראקציות חלוף...

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

בסרטון זה, אנו מתארים את האפיון של מתחמי multiprotein (MPCs) על ידי כחול אלקטרופורזה בג'ל יליד polyacrylamide (BN-PAGE). במימד ראשון, lysates הסלולר dialyzed מופרדים על ידי-BN לזהות MPCs בודדים. במימד השני SDS-PAGE, MPCs עניין מחולקים נוספת לנתח בוחריהם ידי immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

סרטון זה מתאר PAGE מולטימרי להפרדת קומפלקסים חלבוניים טבעיים מהומוגנאטים ברקמות. הטכניקה היא הכלאה של טכניקות כחולות-ילידיות-PAGE ו-SDS-PAGE. ניתן לאפיין ולחקור את המתחמים המופרדים על תפקידם בתפקוד התא.

Multimer-PAGE להפרדת קומפלקסים חלבוניים מקומיים: טכניקת הפרדה היברידית המורכבת מ- Blue Native-PAGE ו- SDS-PAGE להפרדת חלבונים מולטימריים שלמים מליזט רקמות

קומפלקסי חלבונים לזרז תפקודים תאיים מרכזיים. אפיון פונקציונלי והמבני מפורט של מתחמים רבים חיוניים דורש ייצור רקומביננטי. MultiBac הוא מערכת תא baculovirus / חרק מותאם במיוחד לביטוי חלבונים אוקריוטים והמתחמים שלהם. MultiBac יושם כפלטפורמת גישה פתוחה, ונהלי עבודה סטנדרטיים שפותחו על מנת למקסם את התועלת שלו.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

הארכיטקטורה של מתחמי חלבון חיוני לתפקוד שלהם. שילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric הוכיח עוצמה ללמוד ההרכבה שלהם. אנחנו מספקים פרוטוקולים cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה ולהראות כמה שיטות משלימות אלה לעזור להבהיר את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון הרכבות.

שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות

כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול לטיהור ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה זיקה (BiCAP). שיטה חדשנית זו מקלה על ספציפיות בידוד ואפיון פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם של כל שני חלבונים אינטראקציה, בעוד למעט האו ם-ומורכבת חלבונים בודדים, כמו גם מתחמי הקים עם שותפים איגוד מתחרות.

ויבתר חלבון רב מתחמי איתות על ידי טיהור זיקה קומפלמנטציה ריאקציה דו-מולקולרית (BiCAP)

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

הפרוטוקול BN-MS רב-תכליתי באמצעות מיקרוטומה מוצג ברזולוציה גבוהה complexome פרופיל.

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

למד כיצד ללכוד ולנתח מתחמי חלבון נייטיביים מליזטים של רקמות באמצעות אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד דו-ממדי. שיטה זו מאפשרת ייצוב אגודות חלבוניות לא יציבות ומסייעת בזיהוי מורכבים חלבוניים בתנאי שמור על מבנה טבעי.

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

גלה סרטונים נוספים