Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות
5 במאי 2017
שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת.
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לאפשר לחוקרים ללכוד, להפריד ולנתח קומפלקסים של חלבונים טבעיים שחולצו מליזטים של רקמות באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד. שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים הלומדים חלבונים מכיוון שהיא מסוגלת לייצב קשרי חלבונים שאלמלא כן היו לא יציבים תחת תנאים דמויי-טבע, ובכך לאפשר את זיהוים ואת ניתוחם בהמשך. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בשיטות ביולוגיות נפוצות, ולכן היא own ישימה באופן רחב וניתנת להתאמה למטרותיו של החוקר הבודד.
כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את הניתוח להרצת โปรטאינים בג'ל פוליאקרילאמיד בשיטת Blue Native כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. חברו את האלקטרודות לספק הכוח והריצו את החלבונים בג'ל במתח של 150 volts עד שפס הצבע יתקדם כ-שני סנטימטרים לתוך שכבת ההפרדה (resolving layer). בנקודה זו, הפסיקו את ההרצה ונתקו את ספק הכוח.
לאחר פירוק מכשיר האלקטרופורזה, הפרידו את לוחות הזכוכית של קסטת הג'ל. הסירו והשליכו את שכבת הריכוז (stacking layer). חתכו בזהירות את הג'ל ממש מתחת לקצה התחתון של חזית הצבע, תוך הקפדה על ביצוע חיתוך חלק וישר ככל האפשר.
לאחר מכן, השליכו את חלק הג'ל שאינו בשימוש. גזרו חלקי ג'ל מיותרים מקצות רצועת הג'ל. הניחו בזהירות את הרצועה לתוך 10 milliliters של phosophate buffered saline במיכל קטן וערבבו בעדינות על ידי ניעור במשך 30 דקות להגעה לשיווי משקל.
לאחר השיווי, השילוף והחלף את ה-PBS ב-10 מיליליטר נוספים. טפטף באמצעות פיפטה 500 µL של DSP בריכוז 25 mM המומס ב-dimethyl sulfoxide לתוך ה-PBS והמשך בערבוב כקודם למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, שפוך החוצה את תמיסת ה-DSP.
הוסיפו 10 מיליליטר של HSCL בריכוז 0.375 מולארי, pH 8.8, המכיל 2% sodium dodecyl sulfate כדי להשבית את ה-DSP שלא הגיב. המשיכו את ההשבחה למשך 15 דקות. בזמן השבחת רצועת הג'ל, הכינו תמיסות ג'ל עבור SDS-PAGE לפי שיטות סטנדרטיות.
אין להוסיף את ריאגנטים הפולימריזציה. לאחר ההשכבה (quenching), החזירו את רצועת ג'ל ה-blue native לטמפרטורת החדר ויצקו את הרצועה לתוך קסטת ג'ל חדשה. לשם כך, הרימו בזהירות את הג'ל והניחו אותו על פלטת מרווח נקייה של קסטת ג'ל.
כוון את הרצועה כך שתהיה הפוכה מכיוונה הקודם, כאשר החלק התחתון של חזית הצבע קרוב לקצה העליון של הקסטה החדשה. מקם את הרצועה כך שהקצה העליון שלה יהיה בקו אחד עם המקום שבו ימוקם הקצה העליון של לוחית הכיסוי. ודא שחזית הצבע מקבילה לקצוות האופקיים של לוחית הזכוכית.
דחפו צד אחד של הרצועה הגזורה אל מול אחד מקירות המפריד, תוך השארת מקום בצד השני למזיגת הג'ל ולטעינת סולם חלבונים (protein standard or ladder). אם הקצה התחתון של רצועת הג'ל מכיל אזורים משוננים או לא אחידים, גזרו אותם בזהירות. לאחר שרצועת הג'ל ממוקמת כראוי, הניחו את פלטת הכיסוי מעל פלטת המפריד.
הפעילו לחץ עדין כדי להוציא בועות אוויר שנלכדו. המשיכו להרכיב את מכשיר יציקת הג'ל בהתאם להוראות היצרן. רצועת הג'ל זזה לעיתים בעת הנחת הפלטה העליונה.
מומלץ להניח לרצועה לבלוט מעט מעבר לדפנות הפלטה העליונה, כדי שניתן יהיה לכוון אותה בעזרת שפכטל לתיקון הסטות. הוסיפו את ריאגנטי הפולימריזציה לתמיפת ג'ל ההפרדה (resolving gel) ושפכו אותה אל תוך קסטת הג'ל המוכנה באמצעות פיפטה סרולוגית. מלאו את קסטת הג'ל עד לגובה של כשני סנטימטרים מתחת לרצועת ג'ל ה-blue native PAGE שנחתכה, כדי להשאיר מקום לשכבת הערימה (stacking layer).
לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של בוטנול מעל הג'ל שנמזג והמתינו 30 דקות לפולימריזציה של שכבת ההפרדה לפני שיוצקו את הבוטנול. לאחר מכן, הוסיפו את ריאגנטי הפולימריזציה לתמיסת ג'ל הערימה. בעזרת פיפט סרולוגית, מזגו את שכבת הערימה כדי למלא את כל השטח הריק שנותר בקסטת הג'ל.
הטה את קסטת הג'ל בזמן מזיגת שכבת הריכוז (stacking layer), כך שהיא תמלא את החלל שמתחת לרצועת הג'ל ובועות אוויר לא ייכלאו. ככל שתמיסות הג'ל המרכז (stacking gel buffer) ממלאות את החלל הריק מתחת לרצועת הג'ל, החזר בהדרגה את קסטת הג'ל למצב מאוזן. המשך למלא את החלל הריק לצד רצועת הג'ל שהוצאה באמצעות תמיסות הג'ל המרכז עד שהן כמעט גולשות.
לאחר מכן, המתן 30 דקות עד לסיום הפולימריזציה של שכבת הריסוף (stacking layer). לאחר ששכבת הריסוף עברה פולימריזציה, הוצא את קסטת הג'ל ממכשיר היציקה, שטוף אותה במים מזוקקים, והרכב את מכשיר האלקטרופורזה בהתאם להוראות היצרן. מלא את התא הפנימי לחלוטין ב-1x SDS-PAGE running buffer.
לאחר מכן, מלאו את התא החיצוני עד למפלס המצוין על ידי היצרן. טענו את החלל הסמוך לרצועת הג'ל שגולשה בסולם משקלים מולקולרי או בסטנדרט חלבון מתאים. חברו את האלקטרודות לספק הכוח ובצעו אלקטרופורזה לדגימות במתח של 120 volts.
כאשר צבע ה-Coomassie יוצא מהג'ל, יש להפסיק את ההרצה ולנתק את ספק הכוח. יש לנתח את הג'ל באמצעות שיטות סטנדרטיות של electroblotting וזיהוי חלבונים מבוסס נוגדנים. תיקוף של multimer-PAGE מוצג כאן באמצעות immunoblot.
קומפלקס הקינזין שנלכד נחיתך על ידי diphyo-3-itol, מה שמראה כי אגרגטים בעלי משקל מולקולרי גבוה נוצרו על ידי קישור צולב של רכיבים קטנים יותר. מוצג כאן כי ליסיס של מוח שטופל בריכוזים עולים של SDS או Triton הגביר את הזיהוי של alpha-synuclein מונומרי, בעוד שהוא הפחית את הזיהוי של הטטרומר האוליגומרי המסיס. כאן מוצגות תוצאות מייצגות של multimer-PAGE ששימש ללכידת קומפלקסים מסיסים בליסיס של מוח חולדה.
חלבונים זוהו באמצעות אימונו-בלוט. המשקל המונומרי הצפוי של כל חלבון מוצג מתחת לנתיבים. באופן דומה, לכידה של קומפלקסים קשורי ממברנה מוצגת כאן.
לעיתים Multimer-PAGE נכשל בלכידת קומפלקס, כפי שמוצג בבלוט של קומפלקס הנשימה שתיים SDHA. דיון בהסברים אפשריים לכך ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בכשמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע קישור צולב (cross-linking) בתוך ג'ל של קומפלקסים של חלבונים במצבם הטבעי (native), ולאחריו יציקה מחדש של הג'ל והפרדה באמצעות SDS-PAGE משנית. זכרו כי עבודה עם אקרילאמיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להשתמש בציוד מגן אישי בעת יציקת הג'ל. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להמיס (elute) או לגזור מהג'ל את הקומפלקסים המיוצבים שהופרדו, ולנתח אותם באמצעים רבים, כולל זיהוי אימונולוגי או ספקטרומטריית מסות, בהתאם לצורכי החוקר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג שיטה לייצוב ולהפרדה של קומפלקסי חלבונים טבעיים (native) מליזטים של רקמות באמצעות מערכת חדשה של אלקטרופורזה של חלבונים בג'ל פוליאקרילמיד דו-ממדי (PAGE). שיטה זו מאפשרת ניתוח של קשרי חלבונים תחת תנאים קרובים למצבם הטבעי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- פרוטאומיקה
- אלקטרופורזה
רקע
- הבנת קומפלקסים של חלבונים היא קריטית למחקרים ביולוגיים רבים.
- קשרי חלבונים במצבם הטבעי (native) עשויים להיות לא יציבים וקשים לניתוח.
- שיטות ביולוגיות נפוצות מקלות על יישומה של טכניקה זו.
- שיטה זו מאפשרת גישות מותאמות אישית לניתוח חלבונים.
מטרת המחקר
- ללכידה וניתוח של קומפלקסי חלבונים טבעיים מליזאטים של רקמות.
- לייצוב קשרי חלבונים לצורך זיהוי משופר.
- לספק שיטה בעלת יישום רחב עבור חוקרים.
שיטות שנבחנו
- הכנה לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד בשיטת Blue Native.
- אלקטרופורזה של חלבונים במתח של 150 volts.
- מעקב אחר התקדמות פס הצבע בג'ל.
- שימוש בחומר מקשר (cross-linker) לחלבונים המגיב לאמינים.
תוצאות עיקריות
- ייצוב מוצלח של קומפלקסים של חלבונים טבעיים.
- הפרדה יעילה של חלבונים בתמרירי רקמה.
- זיהוי של קשרי חלבונים בתנאים קרובים למצב הטבעי.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את הניתוח של קומפלקסים של חלבונים.
- היא ניתנת להתאמה למטרות מחקר שונות.
- שימוש בשיטות נפוצות מגביר את הנגישות עבור חוקרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות למגזר התעשייה
שיטת Multimer-PAGE מאפשרת לצוותי מחקר ופיתוח בביופארמה לייצב ולהפריד קומפלקסים של חלבונים במצבם הטבעי מתוך ליזטים של רקמות בתנאים הקרובים למצב הטבעי, ובכך לתמוך בתיקוף של מטרות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. על ידי שימור אינטראקציות חלבוניות לא יציבות המאבדות לרוב בתהליכי טיהור קונבנציונליים, השיטה משפרת את רמת הביטחון החזויה בניתוח מסלולים ובזיהוי מטרות תרופתיות מבוססות קומפלקסים. גישה זו מחזקת את הרצף התרגומי משלב הגילוי ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי אספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור של היווצרות קומפלקסים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי לכידה של אינטראקציות חלבוניות טבעיות ללא הפרעה של קשרי אי-קוולנטים.
- ערך תפעולי: משתמש בטכניקות נגישות של blue-native ו-SDS-PAGE המוכרות לרוב צוותי הביולוגיה המולקולרית, ובכך מפחית את הצורך בהכשרה מיוחדת.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי ייצוב קומפלקסים לצורך זיהוי בהמשך באמצעות immunoblot או ספקטרומטריית מסות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר פרופילים מופרדים של קומפלקסים שיכולים לשמש כסממנים ביולוגיים כמותיים לסטנדרטיזציה של בדיקות לאורך קמפיינים של סריקה.
- ערך תפעולי: נשען על ריאגנטים וציוד זולים וזמינים באופן נרחב, מה שמאפשר יישום בר-הרחבה במתקני ליבה.
- מוכנות הבדיקה: מייצר קומפלקסים המופרדים ב-SDS-PAGE התואמים לשיטות זיהוי המשך כגון זיהוי אימונולוגי, ובכך תומך בשילוב של סריקה בעלת תוכן גבוה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין שלבי הגילוי לתהליכי העבודה הפרה-קליניים על ידי שימור שלמות הקומפלקסים לצורך תיקוף במערכות הרלוונטיות למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאפשרת הערכה של היווצרות קומפלקסים בתנאים משתנים (למשל, חשיפה לחומרי דטרגנט או SDS), ובכך מספקת מידע על חוסנו של המטרה.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשרת קבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) בהתבסס על יציבות ושכיחות הקומפלקס, ובכך מפחיתה את שיעור הנשירה בשלבים מאוחרים עקב אי-ודאות מכניסטית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת Multimer-PAGE משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה ועד לאופטימיזציה של המוליך (lead optimization), ומספקת גשר מכניסטי לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח של קומפלקסים חלבוניים טבעיים (native) מדגימות המופקות מרקמות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי לכידה של קומפלקסים אנדוגניים מליזאטים של רקמה לא מעובדת.
- סריקה: מאפשרת פיתוח של בדיקות (assays) באמצעות הפרדה וזיהוי הדירות של קומפלקסים, ובכך מסייעת בהערכת השפעת תרכובות על מעורבות המטרה.
- אנליטיקה: מספקת הפרדה כמותית של קומפלקסי חלבונים באמצעות SDS-PAGE משני, המאפשרת השוואה בין תנאים או טיפולים.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי שמירה על יציבות הקומפלקס לצורך תיקוף במודלים של מחלות, ובכך תומכת ביישור ביומארקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר ולא כבדיקה חד-פעמית, וניתנת להתאמה למטרות ולאזורי מחלה מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת עמימות מכניסטית ברשתות אינטראקציה של חלבונים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה באמצעות תהליכי עבודה מבוססי ג'ל סטנדרטיים וטכניקות אלקטרופורזה מוכרות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות, ובכך ממזער השקעה במכניזמים שאינם מאומתים כראוי.
- השפעה על תיק הפיתוח: מסייע לתיעדוף מותאם סיכון על ידי אספקת ראיות ישירות להיווצרות קומפלקסים וליציבותם בהקשרים טבעיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של native PAGE ו-SDS-PAGE, כולל יציקת ג'ל והפרדה אלקטרופורטית.
- תלוי בגישה למכשור אלקטרופורזה, ספקי כוח וריאגנטים סטנדרטיים כגון DSP crosslinker ו-SDS.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח לכידה וזיהוי עקביים של קומפלקסים בין קבוצות הגילוי והקבוצות הפרה-קליניות.
- כולל שיקולי התאמה לסוגי רקמות שונים ולגדלי קומפלקסים שונים, שכן יעילות ההפרדה עשויה להשתנות בהתאם למשקל המולקולרי.
- מוגבל על ידי אתגרים בהפרדה של קומפלקסים גדולים במיוחד ושונות פוטנציאלית ביעילות הקישור הצולב (crosslinking), כפי שצוין בחומרי המקור.
