Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לאפשר לחוקרים ללכוד, להפריד ולנתח קומפלקסים של חלבונים מקומיים המופקים מליזטים של רקמות באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד. שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים החוקרים חלבונים מכיוון שהיא מסוגלת לייצב אסוציאציות חלבון שאחרת לא היו יציבות בתנאים כמעט טבעיים, מה שמאפשר את זיהויים וניתוחם לאחר מכן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בשיטות ביולוגיות נפוצות ולכן היא ישימה באופן נרחב וניתנת להתאמה למטרות החוקר הבודד.

כדי להתחיל בהליך זה, התכוננו לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד מקורי כחול כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חבר את האלקטרודות לאספקת החשמל ואלקטרופור את החלבונים בג'ל ב -150 וולט עד שרצועת הצבע מתקדמת כשני סנטימטרים לשכבת הפתרון. בשלב זה, עצור ונתק את אספקת החשמל.

לאחר פירוק מנגנון האלקטרופורזה, הפרד את זגוגיות הזכוכית של קלטת הג'ל. הסר והשליך את שכבת הערימה. חותכים בזהירות את הג'ל ממש מתחת לקצה התחתון של חזית הצבע, תוך הקפדה על חיתוך חלק וישר ככל האפשר.

לאחר מכן, השליכו את חתיכת הג'ל שאינה בשימוש. חתוך את כל החלקים שאינם בשימוש לאורך קצוות רצועת הג'ל. מניחים בזהירות את הרצועה לתוך 10 מיליליטר של מי מלח עם חוצץ פוסופט בכלי קטן ומערבבים בעדינות לפי סימון למשך 30 דקות לאיזון.

לאחר שיווי המשקל, השליכו והחליפו את ה- PBS בעוד 10 מיליליטר. פיפטה 500 מיקרוליטר של 25 מילי-מולרי DSP מומס בדימתיל סולפוקסיד לתוך ה-PBS וממשיך לערבב כמקודם למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, שפכו את תמיסת ה- DSP.

ב-10 מיליליטר של 0.375 HSCL מולרי, pH 8.8, המכיל 2% נתרן דודציל סולפט כדי להרוות את ה-DSP הלא מגיב. המשך את הסימון למשך 15 דקות. בזמן שרצועת הג'ל מרווה, הכינו פתרונות ג'ל SDS-PAGE לפי שיטות סטנדרטיות.

אל תוסיף את ריאגנטים לפילמור. לאחר המרווה, החזירו את רצועת הג'ל המקורית הכחולה לטמפרטורת החדר ויצקו את הרצועה לקלטת ג'ל חדשה. לשם כך, הרם בזהירות את הג'ל והניח אותו על צלחת מרווח קלטת ג'ל נקייה.

כוון את הרצועה כך שהיא תתהפך מהכיוון הקודם שלה והחלק התחתון של חזית הצבע יהיה הקרוב ביותר לחלק העליון של הקסטה החדשה. הנח את הרצועה כך שהקצה העליון שלה יהיה אחיד עם הקצה העליון של לוחית הכיסוי. ודא שחזית הצבע מקבילה לקצוות האופקיים של לוחית הזכוכית.

דחוף צד אחד של הרצועה הכרותה כנגד אחד מקירות המרווח, והשאיר מקום בצד השני למזיגת הג'ל ולטעינת תקן חלבון או סולם. אם הקצה התחתון של רצועת הג'ל מכיל אזורים משוננים או לא אחידים, חתוך אותם בזהירות. לאחר שרצועת הג'ל ממוקמת כהלכה, הנח את לוחית הכיסוי מעל לוחית המרווח.

הפעל לחץ עדין כדי לדחוף החוצה בועות אוויר כלואות. המשך להרכיב את מנגנון יציקת הג'ל בהתאם להוראות היצרן. רצועת הג'ל זזה לפעמים כאשר הצלחת העליונה מונחת.

זה עוזר לתת לרצועה לתלות מעט מעל קצה הצלחת העליונה כך שניתן יהיה לכוונן אותה בעזרת מרית כדי לתקן כל תזוזות. הוסף ריאגנטים לפילמור למאגר הג'ל הפותר ושפך אותו לקלטת הג'ל המוכנה באמצעות פיפטה סרולוגית. מלאו את קלטת הג'ל עד כשני סנטימטרים מתחת לרצועת הג'ל הכחולה המקורית PAGE כדי להשאיר מקום לשכבת הערימה.

לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר בוטנול מעל הג'ל שנמזג ואפשרו 30 דקות לפילמור של שכבת הפתרון לפני ששופכים את הבוטנול. לאחר מכן, הוסף את ריאגנטים הפילמור לתמיסת הג'ל הערימה. בעזרת פיפטה סרולוגית, יוצקים את שכבת הערימה כדי למלא את כל החלל הריק שנותר בקלטת הג'ל.

הטה את קלטת הג'ל בזמן ששכבת הערימה נשפכת כך שהיא תמלא את החלל שמתחת לרצועת הג'ל ובועות אוויר לא יילכדו. כאשר מאגר הג'ל הערום ממלא את החלל הריק מתחת לרצועת הג'ל, החזר בהדרגה את קלטת הג'ל לבסיס ישר. המשיכו למלא את החלל הריק ליד רצועת הג'ל שנכרתה עם מאגר הג'ל הערום עד שהוא כמעט עולה על גדותיו.

לאחר מכן, הניחו לשכבת הערימה להתפלמר למשך 30 דקות. לאחר ששכבת הערימה התפלמרה, הסר את קלטת הג'ל ממנגנון המזיגה, שטוף אותה במים מזוקקים והרכיב את מנגנון האלקטרופורזה בהתאם להוראות היצרן. מלא את החדר הפנימי לחלוטין עם מאגר ריצה 1x SDS-PAGE.

לאחר מכן, מלא את החדר החיצוני עד לרמה שצוינה על ידי היצרן. טען את החלל שליד רצועת הג'ל הנכרת בסולם משקל מולקולרי או בתקן החלבון המתאים. חבר את האלקטרודות לאספקת החשמל ואלקטרופור את הדגימות ב -120 וולט.

כאשר צבע Coomassie נגמר מהג'ל, הפסק את הריצה ונתק את אספקת החשמל. לנתח את הג'ל בשיטות סטנדרטיות של אלקטרובלוטינג וזיהוי חלבונים מבוססי נוגדנים. אימות של multimer-PAGE מוצג כאן באמצעות immunoblot.

קומפלקס הקינזין שנלכד נחתך על ידי דיפיו-3-איטול, מה שמראה כי אגרגטים בעלי משקל מולקולרי גבוה נוצרים על ידי קישור צולב של תחליפים קטנים יותר. מתואר כאן, ליזאטים במוח שטופלו בריכוזים הולכים וגדלים של SDS או טריטון הגדילו את הזיהוי של אלפא-סינוקלאין מונומרי תוך הפחתת הזיהוי של טטרומר האוליגומר המסיס. כאן, מוצגות תוצאות מייצגות של multimer-PAGE המשמש ללכידת קומפלקסים מסיסים בליזאט מוח של חולדות.

חלבונים זוהו באמצעות אימונובלוט. המשקל המונומרי הצפוי של כל חלבון מוצג מתחת למסלולים. באופן דומה, לכידת קומפלקסים הקשורים לממברנה מוצגת כאן.

Multimer-PAGE לפעמים לא מצליח ללכוד קומפלקס, כפי שמוצג במתחם הנשימה SDHA Two Blot. דיון בהסברים אפשריים לכך ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע קישור צולב בתוך הג'ל של קומפלקסים חלבונים מקוריים ואחריו יציקה מחדש של ג'ל והפרדה על ידי SDS-PAGE משני. אל תשכח שעבודה עם אקרילאמיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש ללבוש ציוד מגן אישי בזמן יציקת הג'ל. לאחר הליך זה, ניתן לנטרל או לחתוך את הקומפלקסים המיוצבים המופרדים מהג'ל וניתן לנתח אותם באמצעים רבים, כולל זיהוי חיסוני או ספקטרומטריית מסה בהתאם לצרכי החוקר.