Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות
5 במאי 2017
שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לאפשר לחוקרים ללכוד, להפריד ולנתח קומפלקסים של חלבונים מקומיים המופקים מליזטים של רקמות באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד. שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים החוקרים חלבונים מכיוון שהיא מסוגלת לייצב אסוציאציות חלבון שאחרת לא היו יציבות בתנאים כמעט טבעיים, מה שמאפשר את זיהויים וניתוחם לאחר מכן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בשיטות ביולוגיות נפוצות ולכן היא ישימה באופן נרחב וניתנת להתאמה למטרות החוקר הבודד.
כדי להתחיל בהליך זה, התכוננו לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד מקורי כחול כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חבר את האלקטרודות לאספקת החשמל ואלקטרופור את החלבונים בג'ל ב -150 וולט עד שרצועת הצבע מתקדמת כשני סנטימטרים לשכבת הפתרון. בשלב זה, עצור ונתק את אספקת החשמל.
לאחר פירוק מנגנון האלקטרופורזה, הפרד את זגוגיות הזכוכית של קלטת הג'ל. הסר והשליך את שכבת הערימה. חותכים בזהירות את הג'ל ממש מתחת לקצה התחתון של חזית הצבע, תוך הקפדה על חיתוך חלק וישר ככל האפשר.
לאחר מכן, השליכו את חתיכת הג'ל שאינה בשימוש. חתוך את כל החלקים שאינם בשימוש לאורך קצוות רצועת הג'ל. מניחים בזהירות את הרצועה לתוך 10 מיליליטר של מי מלח עם חוצץ פוסופט בכלי קטן ומערבבים בעדינות לפי סימון למשך 30 דקות לאיזון.
לאחר שיווי המשקל, השליכו והחליפו את ה- PBS בעוד 10 מיליליטר. פיפטה 500 מיקרוליטר של 25 מילי-מולרי DSP מומס בדימתיל סולפוקסיד לתוך ה-PBS וממשיך לערבב כמקודם למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, שפכו את תמיסת ה- DSP.
ב-10 מיליליטר של 0.375 HSCL מולרי, pH 8.8, המכיל 2% נתרן דודציל סולפט כדי להרוות את ה-DSP הלא מגיב. המשך את הסימון למשך 15 דקות. בזמן שרצועת הג'ל מרווה, הכינו פתרונות ג'ל SDS-PAGE לפי שיטות סטנדרטיות.
אל תוסיף את ריאגנטים לפילמור. לאחר המרווה, החזירו את רצועת הג'ל המקורית הכחולה לטמפרטורת החדר ויצקו את הרצועה לקלטת ג'ל חדשה. לשם כך, הרם בזהירות את הג'ל והניח אותו על צלחת מרווח קלטת ג'ל נקייה.
כוון את הרצועה כך שהיא תתהפך מהכיוון הקודם שלה והחלק התחתון של חזית הצבע יהיה הקרוב ביותר לחלק העליון של הקסטה החדשה. הנח את הרצועה כך שהקצה העליון שלה יהיה אחיד עם הקצה העליון של לוחית הכיסוי. ודא שחזית הצבע מקבילה לקצוות האופקיים של לוחית הזכוכית.
דחוף צד אחד של הרצועה הכרותה כנגד אחד מקירות המרווח, והשאיר מקום בצד השני למזיגת הג'ל ולטעינת תקן חלבון או סולם. אם הקצה התחתון של רצועת הג'ל מכיל אזורים משוננים או לא אחידים, חתוך אותם בזהירות. לאחר שרצועת הג'ל ממוקמת כהלכה, הנח את לוחית הכיסוי מעל לוחית המרווח.
הפעל לחץ עדין כדי לדחוף החוצה בועות אוויר כלואות. המשך להרכיב את מנגנון יציקת הג'ל בהתאם להוראות היצרן. רצועת הג'ל זזה לפעמים כאשר הצלחת העליונה מונחת.
זה עוזר לתת לרצועה לתלות מעט מעל קצה הצלחת העליונה כך שניתן יהיה לכוונן אותה בעזרת מרית כדי לתקן כל תזוזות. הוסף ריאגנטים לפילמור למאגר הג'ל הפותר ושפך אותו לקלטת הג'ל המוכנה באמצעות פיפטה סרולוגית. מלאו את קלטת הג'ל עד כשני סנטימטרים מתחת לרצועת הג'ל הכחולה המקורית PAGE כדי להשאיר מקום לשכבת הערימה.
לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר בוטנול מעל הג'ל שנמזג ואפשרו 30 דקות לפילמור של שכבת הפתרון לפני ששופכים את הבוטנול. לאחר מכן, הוסף את ריאגנטים הפילמור לתמיסת הג'ל הערימה. בעזרת פיפטה סרולוגית, יוצקים את שכבת הערימה כדי למלא את כל החלל הריק שנותר בקלטת הג'ל.
הטה את קלטת הג'ל בזמן ששכבת הערימה נשפכת כך שהיא תמלא את החלל שמתחת לרצועת הג'ל ובועות אוויר לא יילכדו. כאשר מאגר הג'ל הערום ממלא את החלל הריק מתחת לרצועת הג'ל, החזר בהדרגה את קלטת הג'ל לבסיס ישר. המשיכו למלא את החלל הריק ליד רצועת הג'ל שנכרתה עם מאגר הג'ל הערום עד שהוא כמעט עולה על גדותיו.
לאחר מכן, הניחו לשכבת הערימה להתפלמר למשך 30 דקות. לאחר ששכבת הערימה התפלמרה, הסר את קלטת הג'ל ממנגנון המזיגה, שטוף אותה במים מזוקקים והרכיב את מנגנון האלקטרופורזה בהתאם להוראות היצרן. מלא את החדר הפנימי לחלוטין עם מאגר ריצה 1x SDS-PAGE.
לאחר מכן, מלא את החדר החיצוני עד לרמה שצוינה על ידי היצרן. טען את החלל שליד רצועת הג'ל הנכרת בסולם משקל מולקולרי או בתקן החלבון המתאים. חבר את האלקטרודות לאספקת החשמל ואלקטרופור את הדגימות ב -120 וולט.
כאשר צבע Coomassie נגמר מהג'ל, הפסק את הריצה ונתק את אספקת החשמל. לנתח את הג'ל בשיטות סטנדרטיות של אלקטרובלוטינג וזיהוי חלבונים מבוססי נוגדנים. אימות של multimer-PAGE מוצג כאן באמצעות immunoblot.
קומפלקס הקינזין שנלכד נחתך על ידי דיפיו-3-איטול, מה שמראה כי אגרגטים בעלי משקל מולקולרי גבוה נוצרים על ידי קישור צולב של תחליפים קטנים יותר. מתואר כאן, ליזאטים במוח שטופלו בריכוזים הולכים וגדלים של SDS או טריטון הגדילו את הזיהוי של אלפא-סינוקלאין מונומרי תוך הפחתת הזיהוי של טטרומר האוליגומר המסיס. כאן, מוצגות תוצאות מייצגות של multimer-PAGE המשמש ללכידת קומפלקסים מסיסים בליזאט מוח של חולדות.
חלבונים זוהו באמצעות אימונובלוט. המשקל המונומרי הצפוי של כל חלבון מוצג מתחת למסלולים. באופן דומה, לכידת קומפלקסים הקשורים לממברנה מוצגת כאן.
Multimer-PAGE לפעמים לא מצליח ללכוד קומפלקס, כפי שמוצג במתחם הנשימה SDHA Two Blot. דיון בהסברים אפשריים לכך ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע קישור צולב בתוך הג'ל של קומפלקסים חלבונים מקוריים ואחריו יציקה מחדש של ג'ל והפרדה על ידי SDS-PAGE משני. אל תשכח שעבודה עם אקרילאמיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש ללבוש ציוד מגן אישי בזמן יציקת הג'ל. לאחר הליך זה, ניתן לנטרל או לחתוך את הקומפלקסים המיוצבים המופרדים מהג'ל וניתן לנתח אותם באמצעים רבים, כולל זיהוי חיסוני או ספקטרומטריית מסה בהתאם לצרכי החוקר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג שיטה לייצוב והפרדה של מתחמי חלבון טבעיים מתוך ליזטים של רקמות באמצעות מערכת אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי פוליאקרילאמיד (PAGE) חדשנית. היא מאפשרת ניתוח של קשרים בין חלבונים בתנאים כמעט טבעיים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביוכימיה
- פרוטאומיקה
- אלקטרופורזה
רקע
- הבנת מתחמי חלבונים היא חיונית עבור מחקרים ביולוגיים רבים.
- קשרים טבעיים בין חלבונים יכולים להיות רגישים וקשים לניתוח.
- שיטות ביולוגיות נפוצות מאפשרות את היישום של טכניקה זו.
- שיטה זו מאפשרת גישות מותאמות לניתוח חלבונים.
מטרת המחקר
- ללכוד ולנתח מתחמי חלבון טבעיים מתוך ליזטים של רקמות.
- לייצב קשרים בין חלבונים לזיהוי טוב יותר.
- לספק שיטה שימושית ומתאימה לחוקרים.
שיטות בשימוש
- הכנה לאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד כחול טבעי.
- אלקטרופורזה של חלבונים ב-150 וולט.
- מעקב אחר התקדמות רצועת הצבע בג'ל.
- שימוש בצלבן חלבון תגובתי לאמין.
תוצאות עיקריות
- ייצוב מוצלח של מתחמי חלבון טבעיים.
- הפרדה יעילה של חלבונים בליזטים של רקמות.
- זיהוי של קשרים בין חלבונים בתנאים כמעט טבעיים.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את ניתוח מתחמי החלבון.
- היא מתאימה למטרות מחקר שונות.
- שימוש בשיטות נפוצות מגדיל את הנגישות לחוקרים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Multimer-PAGE enables biopharma R&D teams to stabilize and resolve native protein complexes from tissue lysates under near-native conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By preserving labile protein associations that are often lost in conventional purification, the method improves predictive confidence in pathway analysis and complex-based drug target identification. This approach enhances translational continuity from discovery through preclinical evaluation by providing reproducible, quantitative readouts of complex formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing native protein interactions without perturbing non-covalent bindings.
- Operational Value: Uses accessible blue-native and SDS-PAGE techniques familiar to most molecular biology teams, reducing specialized training needs.
- Predictive Value: Supports functional target validation by stabilizing complexes for downstream identification via immunoblot or mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates resolved complex profiles that can serve as quantitative biomarkers for assay standardization across screening campaigns.
- Operational Value: Relies on inexpensive, widely available reagents and equipment, enabling scalable implementation in core facilities.
- Assay Readiness: Produces SDS-PAGE-separated complexes compatible with downstream detection methods like immunodetection, supporting high-content screening integration.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by preserving complex integrity for validation in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of complex formation under varying conditions (e.g., detergent or SDS exposure), informing target robustness.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on complex stability and abundance, reducing late-stage attrition due to mechanistic uncertainty.
Pipeline & Workflow Integration
Multimer-PAGE fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing a mechanistic bridge to preclinical validation by enabling analysis of native protein complexes in tissue-derived samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing endogenous complexes from unmodified tissue lysates.
- Screening: Enables assay development through reproducible complex separation and detection, facilitating compound effect evaluation on target engagement.
- Analytics: Delivers quantitative separation of protein complexes via secondary SDS-PAGE, allowing comparison of conditions or treatments.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining complex stability for validation in disease models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability rather than a single-use assay, adaptable across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction networks.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized gel-based workflows and familiar electrophoresis techniques.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, minimizing investment in poorly validated mechanisms.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of complex formation and stability in native contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE and SDS-PAGE techniques, including gel casting and electrophoretic separation.
- Depends on access to electrophoresis apparatus, power supplies, and standard reagents such as DSP crosslinker and SDS.
- Necessitates cross-team standardization for consistent complex capture and detection across discovery and preclinical groups.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and complex sizes, as separation efficiency may vary with molecular weight.
- Limited by challenges in resolving extremely large complexes and potential variability in crosslinking efficiency, as noted in source material.
