ג'ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לאפיין קומפלקס MultiPro מליזטים סלולריים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד מקורי כחול, אשר בניגוד לדף SDS, מאפשר הפרדת חלבון בתנאים טבעיים ושומר על אינטראקציות חלבון חלבון. זה מושג על ידי דיאליזה של הליזאט הסלולרי כדי להסיר עודפי מלחים, מה שהופך את הדגימה לרלוונטית להפרדה על ידי דף מקורי כחול כשלב שני. הליזאט מוחל על דף מקורי כחול של הממד הראשון, המפריד קומפלקסים של חלבונים בתנאים טבעיים בהתאם לגודלם וצורתם.

לאחר מכן, מימד שני. דף דנטורינג SDS מבוצע על מנת לחלק את המתחמים למרכיביהם האישיים. ניתן לדמיין חלבונים על ידי צביעת כסף או קומאסי או כתמים מערביים.

כאן זוהו חלבונים מופרדים על ידי כתם כסף בהדגמה הבאה, עם זאת, ייעשה שימוש בכתמים מערביים. היי, אני בריטה בלום מהמעבדה של וולפגנג שרמל במחלקה לאימונולוגיה מולקולרית במכון מקס פלאנק לאימונוביולוגיה בפרייברג גרמניה. היי, אני דינה פיאלה.

אני גם ממעבדת השאם. היום נראה לכם נוהל לניתוח מתחמי MultiPro מליזטים סלולריים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את ההרכב של קולטני ממברנה מרובי תת-יחידות.

עם זאת, בסרטון זה אנו משתמשים בפרוטאזום טיק כדוגמה. אז בואו נתחיל. בואו לפני תחילת הליך זה, הכינו את כל המאגרים כמתואר בפרוטוקול הכתוב ושמרו אותם בארבע מעלות צלזיוס.

קצרו 10 מיליון תאי HEC 2 9 3 וגלולה אותם על ידי צנטריפוגה ב -350 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את כדורי התאים עם מיליליטר אחד של PBS קר כקרח והשתמשו בצנטריפוגה כדי לגלול את התאים השטופים. חזור על שטיפה זו פעמיים, ואז השהה מחדש את כדור התא השטוף ב -250 מיקרוליטר קרח.

כחול קר, ליזה מקורי, חוצץ, ודוגר את התרחיף על קרח למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את תאי החיים ב-13,000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר חומר בלתי מסיס. בינתיים, ממיסים חור במכסה של צינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר באמצעות הצד המחומם בקוטר גדול של פיפטת פסטה.

לאחר מכן הניחו את הצינור על קרח כדי להתקרר לארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלמת הצנטריפוגה, העבירו את הליזאט לצינור להסרת מלח באמצעות דיאליזה. הנח קרום דיאליזה מנותק של 10 קילו-דלטון על גבי הצינור הפתוח.

סגור את המכסה והסר את כל קרום הדיאליזה העודף שבולט החוצה. לאחר מכן אטמו בזהירות את צד הכובע עם פרם לאחר האיטום, הפכו את הצינור והניחו אותו הפוך לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את הדגימה במהירות הנמוכה ביותר האפשרית למשך 10 שניות.

בצנטריפוגה של תרבית תאים, הכינו של 100 מיליליטר עם מאגר דיאליזה מקורי כחול קר וערבוב מגנטי באמצעות לפחות 10 מיליליטר של מאגר דיאליזה מקורי כחול לכל 100 מיקרוליטר דגימה. לאחר מכן הסר את הצינור ההפוך מהצינור החרוטי בעזרת פינצטה. כדי להימנע מסיבוב הצינור בצד ימין כלפי מעלה.

הזן את הצינור עם סרט הפוך בתוך הכוס והסר את כל בועות האוויר מהחור שמתחת למכסה. בעזרת פיפטה כפופה הפעל את הערבוב המגנטי והשאיר את הדגימה למשך שש שעות או לילה בחדר הקירור לדיאליזה. בדוק את הדגימה מדי פעם כדי לוודא שערבוב אינו יוצר בועות אוויר בקרום הדיאליזה.

לאחר הדגירה, העבירו את ליזט תא הדיאליזה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה מקורר חדש והשאירו אותו על קרח עד להעמסת שיפוע הג'ל. מזיגת ג'ל נעשית בטמפרטורת החדר בעזרת מערבל שיפוע. הניחו את מערבל השיפוע על צלחת ערבוב והצמידו אותו לחתיכת צינור גמיש.

סגור את תעלת מערבל השיפוע באמצעות השסתום וסגור את הצינור בעזרת clamp. מניחים ערבוב מגנטי לתוך הגליל המחובר לצינור. לאחר מכן, השחילו את הצינור הגמיש למשאבה פריסטלטית והצמידו מחט מזרק לקצהו.

לאחר מכן הנח את המחט בין שתי לוחות הזכוכית בחלק העליון של מנגנון הג'ל. הכינו תמיסות ג'ל מפרידות של 4% ו-15% כך שהנפחים המשולבים יהיו שווים לנפח בג'ל המפריד. הוסף לי PS ו-TM מיד לפני.

השתמש ושפך את תמיסות הג'ל לתוך הצילינדרים המתאימים של מערבל השיפוע. ואז הפעל את ופתח את השסתום. לחץ על הגליל השמאלי כדי להוציא בכוח את בועת האוויר בתוך התעלה המחברת בין שני מאגרי הג'ל.

הפעל את המשאבה במהירות של חמישה מיליליטר לדקה. הסר את המהדק ואפשר לג'ל לזרום לאט בין לוחות הזכוכית. הרם לאט את המחט כשהג'ל עוצר, וודא שהמחט תמיד מעל הנוזל.

אפשר לכל הנוזלים להיכנס למנגנון הג'ל. לאחר מכן יש לכסות את הנוזל בעדינות עם איזופרופנול ולשטוף את המכשיר במים מזוקקים. הניחו לג'ל להתפלמר לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הכינו ג'ל ערימה של 3.2%, והוסיפו PS ו-TM me מיד לפני השימוש. יוצקים את ג'ל הערימה על גבי הג'ל המפריד ומכניסים את המסרק בין צלחות הזכוכית, תוך הימנעות מבועות. לאחר שג'ל הערימה התפלמר, יש לקרר את הג'ל לארבע מעלות צלזיוס מיד לפני טעינת הדגימה.

הסר את המסרק ומשוך אותו לאט החוצה בזווית למישור הג'ל. זה מאפשר לאוויר להיכנס לכיסים במהירות, מה שמשפר את איכות הבארות להפרדת הליזאט של תא הדיאליזה על ידי טעינת דפים מקורית כחולה 20 מיקרוליטר של סמן הפריטין ו-40 מיקרוליטר של ליזט הדיאליזה לבארות היבשות בארבע מעלות צלזיוס, נתיבים ריקים מלאים בכמויות שוות של מאגר דיאליזה. לאחר מכן שכבו את הדגימות בכל באר עם מאגר קתודה קר.

מלאו את החדר הפנימי במאגר קתודה קר ואת תא האלזה במאגר אנודה קר. עבדו בארבע מעלות צלזיוס ומרחו 100 וולט עד שהדגימות נכנסו לג'ל ההפרדה. לאחר מכן הגדל את המתח ל -180 וולט והפעל את הג'ל עד שחזית התבנית תגיע לקצה הג'ל.

הריצה אורכת שלוש עד ארבע שעות. לדף SDS של ממד שני, הכן ג'ל SDS סטנדרטי של 10% עם נתיב אחד גדול. נתיב אחד לסמן המשקל המולקולרי ונתיב אחד לסימון של בקרת הליזאט בדיאליזה שעורבבה עם מאגר דגימת SDS והרתיחה במשך חמש דקות ב-95 מעלות צלזיוס, הסר את ג'ל הדף המקורי הכחול בצלחות ממנגנון האלקטרופורזה וחטט בעדינות צלחת אחת.

הסר את ג'ל הערימה וחתוך את הנתיב של ג'ל הדף המקורי הכחול המכיל את החלבונים המעניינים. מניחים את פרוסת הג'ל המקורית הכחולה בדגימת SDS, חוצצים ומדגרים למשך 10 דקות של טמפרטורת החדר על שייקר לאחר הדגירה. מרתיחים את פרוסת הג'ל לזמן קצר במיקרוגל, ואז דוגרים למשך 15 דקות נוספות.

במאגר הדגימה של SDS על שייקר, הסר את המסרק של ג'ל ה-SDS ומלא מעט מאגר SDS לבאר טען את פרוסת הג'ל המקורית הכחולה לבאר הגדולה של ג'ל ה-SDS. הימנעות מבועות אוויר. ייתכן שתרצה להשתמש בפינצטה לעזרה מכיוון שפרוסת הג'ל צריכה להיות בדיוק על ג'ל הערימה.

שכבו את הפרוסה עם מאגר דגימת SDS, ולאחר מכן טענו את הסמן ואת בקרת הליזאט. לבצע אלקטרופורזה והעברת חלבונים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כדי לפרש את התוצאות, חשוב לדעת שמיקומו של חלבון בדף SDS המקורי הכחול של הממד השני נותן עדות אם החלבון הוא חלק מקומפלקס MultiPro או לא.

חלבונים מונומרים ינדדו באלכסון היפרבולי עקב הג'ל השיפוע בממד הראשון, וכג'ל ליניארי בממד השני, תת-יחידות של קומפלקסים של MultiPro יימצאו מתחת לאלכסון ויצרו קו אנכי. אם חלבון מסוים הוא חלק מקומפלקסים נפרדים, מתגלים מספר כתמים בקו אופקי. לסיכום, גישת דף SDS המקורי הדו-ממדי של העמוד הכחול מאפשרת לקבוע את גודל ההרכב המורכב של MultiPro ואת השפע היחסי.

בהדגמה זו זוהו מספר יחידות פרוטאזום או תת-יחידות על ידי כתמים מערביים. ניתן לזהות את תת-היחידות בטא 2 ו-MCP 21 כנקודות בודדות המסודרות אנכית מה שמצביע על כך שהן חלק מאותם קומפלקסים. PA 28 נמצא בקו אנכי אחד עם בטא 2 ו-CP 21 ולכן חלק מאותו קומפלקס.

כאשר מסתכלים על הקווים האופקיים, ניתן לראות שבטא 2 ו-MCP 21 הם חלק משלושה קומפלקסים נפרדים. PA 28 נמצא רק באחד מהמתחמים הללו. לכן, ניתן לזהות את קומפלקסי המולטי-פרו הללו כ-20 פרוטאזום ההצלחה של פרוטאזום 20 שניות.

יחד עם P 28 ו-20 S proteasome בלבד, זה עתה הראינו לך כיצד להפריד ולאפיין מתחמי MultiPro מקוריים מליזאט סלולרי באמצעות דף מקורי כחול. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע דיאליזה זהירה של הדגימה. כדי להימנע ממגע עם SDS ולעבוד תמיד בארבע מעלות, אנו ממליצים להשוות חומרי ניקוי שונים לליזה תאית כדי להשיג גם שלמות של מנוע, קומפלקסים יפים וגם מסיסות מיטבית.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך. אני אכנס.