Name: גל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: למדו את שיטת BN-PAGE לניתוח מתחמי multiprotein מלייזטים תאיים תוך שימור אינטראקציות חלבון-חלבון. הטכניקה משלבת אלקטרופורזה דו-ממדית עם SDS-PAGE לזיהוי הרכב המתחמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מיכאל Reth, הרמן Schägger, ומרגריטה קמאצ&#39;ו-קארוואחאל תמיכה מדעית. עבודה זו מומנה על ידי FORSYS מן fuer Bundesministerium Bildung ו Forschung (BMBF), על ידי BIOSS מן Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), ו נתמך בחלקו על ידי יוזמת מצוינות של ממשלות פדרליות ואת המדינה הגרמנית (GSC-4, Spemann בית הספר למוסמכים ).

<ol><li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer%3A+identification+of+three+dimer-specific+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li>
<li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li>
<li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+%28NAMOS-assay%29+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li>
<li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

במחקר זה, אנו מתארים את הניתוח של MPCs ידי-BN. גישה 2D משמש MPCs נפרד הראשון תחת תנאים מקומיים, ולאחר מכן להמשיך לסעף אותם רכיבים בודדים שלהם מימד שנייה SDS-PAGE. דוגמאות מוכנים lysates מן התא. עבור solubilization של MPCs רבים, חומרי ניקוי מתאים נדרש, אשר שומרת על המבנה של קומפלקסים חלבונים. כאן, אנו משתמשים טריטון 0.1% X-100. עם זאת, חומר ניקוי אופטימלי ריכוז מתאים שלה צריך להיקבע באופן אמפירי לכל MPC. במקרה של טריטון X-100, למשל, זה כבר דווח כי ריכוזים נמוכים אבקת לאפשר זיהוי של צורה dimeric של F 1 F 0-ATPase מורכבות (ארנולד, פייפר et al. 1998). גבוהה טריטון X-100 ריכוזים, לעומת זאת, להוביל ניתוק של dimer ועל גידול מקביל של monomeric ה-F 1 F 0-ATPase מורכבים. זו עולה בקנה אחד עם המחקרים הקודמים שלנו, היינו מראים כי מורכבות multivalent T-cell receptor (TCR) נשמר בעת חילוץ עם ריכוזים נמוכים של Brij 96, ואילו את השימוש של ריכוז גבוה של חומר ניקוי או אחרת בשם התוצאות digitonin ב מיצוי של monomeric TCR (Schamel, Arechaga et al. 2005). דטרגנטים בשימוש נפוץ שניתן לבדוק כוללים digitonin (0.5-1%), טריטון X-100 (0.1-0.5%), Brij 96 (0.1-0.5%), או dodecylmaltoside (0.1-0.5%). ריאגנטים אלה הם חומרי ניקוי nonionic, אשר נוטים להיות הטוב ביותר עבור יציבות MPC. להיות מודעים לכך קשר עם SDS וחומרי ניקוי חזקים אחרים יש להימנע (קמאצ&#39;ו-קארוואחאל, Wollscheid et al. 2004). דיאליזה של lysates נדרש כדי להשיג הפרדה MPC בתוך הג&#39;ל-BN (קמאצ&#39;ו-קארוואחאל, Wollscheid et al 2004).; (Heiss, Junkes et al 2005).. נראה כי התאמה של ריכוז מלח או הסרת זיהומים נמוך משקל מולקולרי הוא קריטי עבור ברזולוציה גבוהה. ראוי לציין כי גם ההכנות הממברנה MPCs, אשר היו immunopurified ו eluted מאוחר יותר מן הנוגדן, מתאימים PAGE-BN (סוואמי, Siegers et al. 2006). בשני המקרים, הדגימות לא צריך להיות dialyzed להפרדה BN-PAGE, אם תמוגה קרום או elution מתבצעת חיץ BN-תמוגה. עבור הפרדה חלבון על ידי-BN, Coomassie את הצבע הכחול יש צורך, אשר נקשר לחלבונים unspecifically ומכסה אותם עם מטענים שליליים. ובכך, Coomassie כחול מאפשרת ניידות electrophoretic של חלבונים לכיוון הקתודה ב-pH נייטרלי (Schägger ו פון יגוב 1991); (Schägger, קריימר et al 1994).. יתר על כן, Coomassie כחול מונע הצטברות חלבון הג&#39;ל לערום במהלך אלקטרופורזה. עבור PAGE-BN, Coomassie G250 יש להשתמש במקום Coomassie כחול R250 או colloidal בלוז Coomassie. לפני הפעלת BN-ג&#39;ל, זה הכרחי על מנת להבטיח כי אחוז הג&#39;ל מתאים לגודל הצפוי של MPC של עניין. Precast BN-ג&#39;לים עם מילויים שונים מאגרים מתאימים זמינים מסחרית מן Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-טריס מערכת ג&#39;ל). אבל BN-ג&#39;לים יכול גם להיות מוכנים באמצעות מערבל צבע יחד עם משאבה persistaltic. כדי להבטיח שיפוע תקין, הנוזל צריך לזרום ללא הרף במהלך לשפוך ובועות יש להימנע. אנו ממליצים על הטעינה של דילולים מדגם שונה על הג&#39;ל מפני עומס יתר יכול להוביל משקעים חלבון בתהליך אלקטרופורזה. בנוסף, BN-ג&#39;לים יש לרוץ 4 ° C כדי למנוע פירוק חלבונים ולשמור MPCs ללא פגע. לאחר BN-PAGE, ויזואליזציה של MPCs ניתן להשיג על ידי מכתים Coomassie כחול מבריק, כסוף או מכתים immunoblotting. להקות חלבון דמיינו ידי מכתים Coomassie או כסף מתאימים לניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה (קמאצ&#39;ו-קארוואחאל, Wollscheid et al. 2004). במקרה של immunoblotting, תנאי ההעברה האופטימלי עבור MPCs העניין צריך להיקבע באופן אמפירי. שים לב Coomassie כחול מועבר גם במהלך סופג של ג&#39;ל-BN. לכן, ג&#39;ל יהיה חסר צבע לאחר העברת מוצלח, ואילו הממברנה יפעילו צבע כחול. יתר על כן, חשוב לציין כי לא כל נוגדן ראשוני, הפועלת לאיתור לאחר SDS-PAGE, הוא ישים immunoblotting על PAGE-BN. זה יכול לקרות כי הנוגדנים אינם מכירים MPC עניין כי epitope שלהם טמון קונפורמציה הילידים של החלבונים. כדי להתגבר על בעיה זו, אפשר לפגל את החלבונים בתוך הג&#39;ל-BN לפני ההעברה על ידי הרתחת ג&#39;ל בקרוב חיץ מדגם SDS 1x. בדוגמה שלנו, אנו לא הנושא BN-ג&#39;ל ישירות זיהוי של להקות חלבון. במקום זאת, אנו עוד חילקו את BN-PAGE מופרד lysate ידי dimensi secondעל SDS-PAGE. במימד השני SDS ג&#39;ל, חלבונים monomeric נודדים בתוך אלכסוני היפרבולי בשל הג&#39;ל הדרגתי במחצית הראשונה ואת ג&#39;ל ליניארי בממד השני (קמאצ&#39;ו-קארוואחאל, Wollscheid et al. 2004). זה מאפשר זיהוי קל של MPCs, שכן הם נקודתיים מתחת זה אלכסונית היפרבולי. המשנה ברורה של אחד MPC מופרדים בקו אנכי בממד השני SDS-PAGE. רכיבי כי הם המרכיבים של MPCs dinstinct כמה ניתן לזהות על קו אופקי בהתאם לגודל של MPC. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי מספר המקומות חלבון המופיע בשורה אחת אנכי יכול להיות גם חלק מתחמי נפרד להעביר בעמדה זהה PAGE-BN. ההוכחה הסופית שהם נמצאים MPC אותו ניתן להשיג על ידי נוגדן מבוססי assay משמרת ג&#39;ל. ב assay זה, lysate הסלולר הוא מודגרות עם נוגדן כנגד חלבון מיוצג על ידי אחד המקומות המזוהים לפני PAGE-BN. התוצאה היא שינוי של כל MPCs המכילים חלבון זה כלפי מסה מולקולרית גבוהה בממד הראשון. חלבונים אחרים הם גם חלק MPCs אלה יעברו שינוי זה מורכב ספציפיים ולכן הם קל לזהות בממד השני SDS ג&#39;ל. לא רק בהרכב MPCs ניתן לנתח על ידי-BN, אלא גם את הנחישות של stoichiometry שלהם הוא אפשרי (Schamel ו Reth 2000); (Schamel 2001), (סוואמי, Minguet et al 2007).. לענין זה, assay NAMOS (יליד נוגדן מבוססי assay ניידות במשמרת) יכולה להתבצע. כמו נוגדן מבוססי assay משמרת ג&#39;ל, lysates הסלולר מודגרת עם ספציפי למקטע נוגדנים חד שבטיים. זה מוביל אינדוקציה של immunoshifts electrophoretic ב BN-ג&#39;לים, המאפשרים היקש מן מידת השינוי על stoichiometry של MPCs ב conlusion, BN-PAGE מתאים לזיהוי MPCs וקביעת הרכב שלהם, הגודל, כמו גם השפע היחסי. בביצוע כמו assay NAMOS, היא מציעה גם את האפשרות לקבוע את stoichiometry של MPC מסוימים. לאור תחולתה הכללית שלה, טכניקה זו היא כלי מאוד שימושי לאפיון של MPCs (דקר, מולר ואח&#39; 1996.); (Wittig ו Schagger 2008); (וגנר, Rehling et al 2009).; (Wittig ו Schägger 2009) .

ג&#39;ל כחול native polyacrylamide אלקטרופורזה (bn-page) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

מתחמי multiprotein (MPCs) לשחק תפקיד מכריע האיתות בתא, מכיוון שרוב החלבונים ניתן למצוא מתחמי תפקודית או רגולטוריות עם חלבונים אחרים (סאלי, Glaeser et al. 2003). לכן, המחקר של חלבונים רשתות אינטראקציה מחייב אפיון מפורט של MPCs כדי להשיג הבנה אינטגרטיבית של תפקוד חלבונים תקנה. לצורך זיהוי וניתוח, MPCs יש להפריד בתנאים המקומיים. בסרטון זה, אנו מתארים את ניתוח MPCs ידי כחול ג&#39;ל אלקטרופורזה יליד polyacrylamide (BN-PAGE). BN-PAGE היא טכניקה המאפשרת הפרדה של MPCs ב קונפורמציה יליד עם רזולוציה גבוהה יותר המוצעים על ידי סינון ג&#39;ל או צפיפות ultracentrifugation סוכרוז, ולכן הוא שימושי כדי לקבוע את גודל MPC, קומפוזיציה, ואת השפע היחסי (Schägger ו פון יגוב 1991) ; (Schägger, קריימר et al 1994).. לפי שיטה זו, חלבונים מופרדים לפי גודל הידרודינמית שלהם ואת הצורה במטריצה ​​polyacrylamide. הנה, אנחנו מדגימים את ניתוח MPCs של lysates הסלולר הכולל, וציין כי דיאליזה lysate היא צעד חיוני כדי להפוך BN-PAGE החלים אלה דגימות ביולוגיות. באמצעות שילוב של PAGE-SDS BN-first ו המימד השני ממד, אנו מראים כי MPCs מופרדים על ידי-BN אפשר לחלק עוד יותר על ידי SDS-PAGE לתוך מרכיבי האישיות שלהם. ויזואליזציה של מרכיבי MPC על הפרדה בג&#39;ל מתבצע על ידי immunoblotting סטנדרטי. כדוגמה לניתוח MPC על ידי-BN, בחרנו 19S אוקריוטים היטב מאופיין, בשנות ה -20, ו proteasomes 26S.

בסרטון זה, אנו מתארים את האפיון של מתחמי multiprotein (MPCs) על ידי כחול אלקטרופורזה בג&#39;ל יליד polyacrylamide (BN-PAGE). במימד ראשון, lysates הסלולר dialyzed מופרדים על ידי-BN לזהות MPCs בודדים. במימד השני SDS-PAGE, MPCs עניין מחולקים נוספת לנתח בוחריהם ידי immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

קומפלקסים של ריבוי חלבונים (MPCs) ממלאים תפקיד מכריע באיתות תאי, שכן רוב החלבונים נמצאים בקומפלקסים תפקודיים או רגולטוריים עם חלבונים אחרים...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לאפיין קומפלקס MultiPro מליזאטים תאיים באמצעותה של אלקטרופורזה בגל גל-פוליאקרילמיד בשיטת Blue Native, אשר בניגוד ל-SDS page, מאפשרת הפרדה של חלבונים בתנאים טבעיים (native) ושומרת על אינטראקציות בין חלבונים. דבר זה מושג על ידי דיאליזה של הליזאט התאי להסרת עודפי מלחים, מה שהופך את הדגימה למתאימה להפרדה ב-Blue Native page כשלב שני. הליזאט מועלה ל-Blue Native page בממד ראשון, המפריד קומפלקסים של חלבונים בתנאים טבעיים בהתאם לגודלם ולצורתם.בשלב הבא, ממד שני. מבוצעת הרצת SDS-PAGE דנטורטיבית במטרה להפריד את הקומפלקסים למרכיביהם הבודדים. ניתן להוצאה חזותית של חלבונים באמצעות צביעת כסף או כומאסי, או באמצעות Western blotting.בהדגמה זו חלבונים מופרדים זוהו באמצעות צביעת כסף, אך בפועל ייעשה שימוש ב-western blotting. שלום, אני בריטה בלום מהמעבדה של וולפגנג שארמל במחלקה לאימונולוגיה מולקולרית במכון מקס פלאנק לאימונוביולוגיה בפריבורג, גרמניה. שלום, אני דינה פיאלה.אני גם ממעבדת Sham. היום נדגים לכם פרוצדורה לניתוח קומפלקסים של MultiPro מליזאטים תאיים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את הרכבם של רספטורים ממברנתיים רב-תת-יחידות.עם זאת, בסרטון זה נשתמש ב-tic proteasome כדוגמה. אז בואו נתחיל. לפני תחילת הליך זה, הכינו את כל הבאפפרים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב ושמרו אותם בטמפרטורה של 4 °C.אספו 10 מיליון תאי HEC 2 9 3 והשקיעו אותם על ידי סבב צנטריפוגה ב-350 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את משקעי התאים ב-1 מיליליטר של PBS קר במיוחד והשתמשו בצנטריפוגה כדי להשקיע את התאים השטופים. חזרו על שטיפה זו פעמיים, ולאחר מכן השביעי את משקע התאים השטופים ב-250 µL של קרח.הוסיפו תמיפת ליזיס (lyis buffer) קרה, והדגירו את התרחיף בקרח למשך 15 דקות. לאחר ההדגרה, סבבו את התרחיף בצנטריפוגה במהירות של 13,000 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי להסיר חומרים בלתי מסיסים. בינתיים, צרו חור במכסה של מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL באמצעות הצד החם בעל הקוטר הגדול של פיפטה פסטור.לאחר מכן, הניחו את המבנה על קרח לקירור עד ל-4°C. עם סיום הסריפוגציה, העבירו את הליסאט למבנה להסרת מלחים באמצעות דיאליזה. הניחו ממבנה דיאליזה עם סף של 10 kilodalton מעל פיית המבנה הפתוח.סגרו את הפקק וגזרו כל שארית של ממברנת דיאליזה הבולטת החוצה. לאחר מכן, אטמו בזהירות את דפנות הפקק עם פראפמין; לאחר האיטום, הפכו את המבחנה והניחו אותה הפוך בתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר. סובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות הנמוכה ביותר האפשרית למשך 10 שניות.בצנטריפוגה לתרביות תאים, הכין כוס כימית של 100 מיליליטר עם בופר דיאליזה blue native קר ומגנט לערבוב, תוך שימוש של לפחות 10 מיליליטר של בופר דיאליזה blue native לכל 100 מיקרוליטר של דגימה. לאחר מכן, הוצא את המבחנה ההפוכה מהמבחנה הקונית בעזרת פינצטה. הימנע מהפיכת המבחנה למצב זקוף.קבעו את המבחנה בעזרת סרט הדבקה כשהיא הפוכה בתוך הביקר, והסירו בועות אוויר מהחור שמתחת למכסה. בעזרת פיפט פסטור כפופה, הפעילו את ערבוב המגנטי והשאירו את הדגימה למשך שש שעות או למשך הלילה בחדר הקירור לצורך דיאליזה. בדקו את הדגימה מדי פעם כדי לוודא שהערבוב אינו יוצר בועות אוויר בממברנת הדיאליזה.לאחר הדגירה, העבירו את ליזאט התאים שעבר דיאליזה למבחנה מיקרו-צנטריפוגית מקוררת חדשה והשאירו אותה על קרח עד לטעינת הג'ל במדרג. יציקת הג'ל תתבצע בטמפרטורת החדר באמצעות מערבל מדרג (gradient mixer). הניחו את מערבל המדרג על פלטת ערבול וחברו אותו לקטע של צינור גמיש.סגור את התעלה של מערבל הגרדיאנט באמצעות השסתום וסגור את הצינור באמצעות תפס. הנח מגנט Stirring בתוך הגליל המחובר לצינור. לאחר מכן, השחל את הצינור הגמיש לתוך משאבה פריסטלטית וחבר מחט של מזרק לקצתו.לאחר מכן, מקמו את המחט בין שתי לוחות הזכוכית בחלקו העליון של מכשיר הג'ל. הכינו תמיסות ג'ל מפריד בריכוזים של 4% ו-15%, כך שהנפחים המשולבים יהיו שווים לנפח הג'ל המפריד. הוסיפו PS ו-TM מיד לפני כן.השתמשו בתמיסות הג'ל ומזגו אותן למבחנות המתאימות של מערבל הגרדיאנט. לאחר מכן, הפעילו את המכשיר ופתחו את השסתום. לחצו על המבחנה השמאלית כדי לדחוף החוצה את בועת האוויר שבתוך התעלה המחברת בין שני מאגרי הג'ל.הפעל את המשאבה בקצב של five milliliters per minute. הסר את התסמיך ואפשר לג'ל לזרום באיטיות בין לוחות הזכוכית. הרם באיטיות את המחט בזמן שהג'ל עוצר, תוך הבטחה שהמחט תהיה תמיד מעל הנוזל.אפשרו לכל הנוזל להיכנס למכשיר הג'ל. לאחר מכן, כסו בעדינות את הנוזל בשכבת איזופרופנול ושטפו את המכשיר במים מזוקקים. המתינו לפולימריזציה של הג'ל למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, הכין ג'ל ריכוז (stacking gel) בריכוז 3.2%, והוסף PS ו-TM מיד לפני השימוש. שפוך את ג'ל הריכוז מעל ג'ל ההפרדה והכנס את המסרק בין לוחות הזכוכית, תוך הימנעות מיצירת בועות. לאחר שג'ל הריכוז עבר פולימריזציה, קורר את הג'ל ל-4 °C מיד לפני טעינת הדגימות.הסר את המסרק באיטיות על ידי משיכתו בזווית למישור הג'ל. פעולה זו מאפשרת לאוויר להיכנס לחללים במהירות, דבר המשפר את איכות הבארות. כדי להפריד את הליזאט התאי שעבר דיאליזה באמצעות blue native page, טען 20 µL של סמן פריטין ו-40 µL של הליזאט שעבר דיאליזה אל הבארות היבשות בטמפרטורה של 4 °C; את הנתיבים הריקים מלא בנפחים שווים של בופר דיאליזה. לאחר מכן, כסה את הדגימות בכל בארה בבופר קתודה קר.מלאו את התא הפנימי בבופר קתודה קר ואת תא ה-alsa בבופר אנודה קר. עבדו בטמפרטורה של 4°C והפילו 100 V עד שהדגימות יחדרו לג'ל ההפרדה. לאחר מכן, הגבירו את המתח ל-180 V והריצו את הג'ל עד שחזית הצבע תגיע לסוף הג'ל.ההרצה נמשכת שלוש עד ארבע שעות. עבור ה-SDS page במימד השני, הכינו ג'ל SDS סטנדרטי בריכוז 10% עם נתיב רחב אחד. נתיב אחד עבור סמן המשקל המולקולרי ונתיב אחד עבור מנה של בקרת הליזט הדיאלוגי שערבבה עם בופר דגימות SDS והורתחה במשך חמש דקות ב-95 °C; הוציאו את ג'ל ה-blue native page מהלוחיות ממכשיר האלקטרופורזה והרימו בעדינות אחת מהלוחיות.הסיר את ג'ל הערימה (stacking gel) וגזור את הנתיב מג'ל ה-blue native page המכיל את החלבונים הרלוונטיים. הנח את פרוסת ג'ל ה-blue native page בבופר לדגימות SDS והדגרה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר לאחר ההדגרה. הרתח את פרוסת הג'ל למשך זמן קצר במיקרוגל, ולאחר מכן הדגרה למשך 15 דקות נוספות.בתוך חוצץ דגימות SDS על שייקר, הוציאו את המסרק של ג'ל ה-SDS ומלאו מעט חוצץ SDS לתוך הבאר. העבירו את פרוס ג'ל ה-blue native page אל תוך הבאר הגדולה של ג'ל ה-SDS, תוך הימנעות מבועות אוויר. ניתן להיעזר בפינצטה, שכן על פרוסת הג'ל להיות מונחת בדיוק על ג'ל הערימה (stacking gel).כסו את הפרוסה בבופר דגימות SDS, ולאחר מכן טענו את המארקר ואת בקרת הליזט. בצעו אלקטרופורזה והעברת חלבונים בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. כדי לפרש את התוצאות, חשוב לדעת כי מיקומו של חלבון במימד השני של ה-blue native SDS page מהווה ראיה לשאלה האם החלבון הוא חלק מקומפלקס MultiPro או לא.חלבונים מונומריים ינדדו באלכסון היפרבולי בשל ג'ל הגרדיאנט בממד הראשון, וכג'ל ליניארי בממד השני; תתי-יחידות של קומפלקסים MultiPro יימצאו מתחת לאלכסון ויהוו קו אנכי. אם חלבון מסוים הוא חלק מקומפלקסים שונים, יזוהו מספר נקודות בקו אופקי. לסיכום, גישת ה-SDS page ו-blue native page הדו-ממדית מאפשרת קביעת הגודל, ההרכב והשכיחות היחסית של קומפלקס MultiPro.בהדגמה זו, מספר פרוטאוזומים או תתי-יחידות שלהם זוהו באמצעות western blotting. ניתן היה לזהות את תתי-היחידות beta two ו-MCP 21 כנקודות בודדות המסודרות אנכית, מה שמעיד על כך שהן חלק מאותם קומפלקסים. PA 28 נמצא בקו אנכי אחד עם beta two ו-CP 21, ולכן הוא חלק מאותו קומפלקס.בבחינה של הקווים האופקיים, ניתן לראות כי beta two ו-MCP 21 הם חלק משלושה קומפלקסים נפרדים. PA 28 נמצא רק באחד מאותם קומפלקסים. לפיכך, ניתן לזהות קומפלקסי MultiPro אלה כפרוטאוזום 20s, הפרוטאוזום 20s.יחד עם P 28 והפרוטאוזום 20 S לבדו, הראינו לכם כעת כיצד להפריד ולאפיין קומפלקסים של MultiPro טבעיים מליזט תאי באמצעות blue native page. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע דיאליזה זהירה לדגימה. כדי למנוע מגע עם SDS ולעבוד תמיד בטמפרטורה של ארבע מעלות, אנו ממליצים להשוות דטרגנטים שונים לליזיס תאי כדי להשיג הן שמירה על שלמות הקומפלקסים של המנוע והן את המסיסות המיטבית.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם. אני אסיים כעת.

blue-native-polyacrylamide-gel-electrophoresis-bn-page-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר טכני הליך סטנדרטי המערבי סופג באמצעות אלקטרופורזה זמינים מסחרית NuPAGE מיני ג'ל המערכת Invitrogen.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

סרטון זה מדגים טכניקת הפרדה מבוססת פוליאקרילאמיד דנטורינג עבור חלבונים. טכניקה זו מסייעת בזיהוי ראשוני של חלבונים על בסיס משקלם המולקולרי.

נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח חלבונים: טכניקה להפריד ולדמיין חלבונים על בסיס משקל מולקולרי

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה אלקטרופורטית, הנקראת Blue native PAGE, לניתוח קומפלקסים של חלבוני נשימה מיטוכונדריאליים במצבם המקופל ופעיל מבחינה תפקודית. הצבע הכחול האניוני Coomassie גורם לקומפלקסים החלבוניים להיות טעונים שלילית, ומאפשר הפרדה על בסיס גודל ומבנה.

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד מקורי כחול: טכניקת הפרדה ללא דנטורינג לניתוח קומפלקסים שלמים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית

סרטון זה מתאר PAGE מולטימרי להפרדת קומפלקסים חלבוניים טבעיים מהומוגנאטים ברקמות. הטכניקה היא הכלאה של טכניקות כחולות-ילידיות-PAGE ו-SDS-PAGE. ניתן לאפיין ולחקור את המתחמים המופרדים על תפקידם בתפקוד התא.

Multimer-PAGE להפרדת קומפלקסים חלבוניים מקומיים: טכניקת הפרדה היברידית המורכבת מ- Blue Native-PAGE ו- SDS-PAGE להפרדת חלבונים מולטימריים שלמים מליזט רקמות

בסרטון זה אנו מדגימים שיטת אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל המפרידה חלבונים בודדים מתערובת חלבונים מורכבת המתקבלת מרקמות גידוליות של אדנומת יותרת המוח האנושית הלא תפקודית (NFPA). החלבונים מופרדים על בסיס המטען החשמלי שלהם בממד הראשון ובהמשך מופרדים על בסיס משקלים מולקולריים בממד השני.

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין ולבצע אלקטרופורזה של לכידת שבר נוזלי מקורי ברור (CN-GELFrEE), טכניקת הפרדה מקורית עבור מכלולים ביומולקולריים לא קוולנטיים וחלבונים מדגימות הטרוגניות התואמת לטכניקות ניתוח חלבונים שונות במורד הזרם.

CN-GELFrEE - Native נקה ג&#39;ל eluted שבר נוזלי אלקטרופורזה מילכוד

שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת.

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את הרכב החלבון גדול מקורי: חלבון וחלבון: חומצות גרעין מתחמי מהאונס שמן (נולד ב- napus) תפליט שיפה בגישה של תלת-ממד לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) שילוב של כחול מקורי (בסון) עם שני עמודים denaturing ואחריו זיהוי המוני spectrometric.

שיפה Sap דגימה של כרוב napus עבור תלת-ממד-דף של חלבונים, קומפלקסים Ribonucleoprotein

פרוטוקול עבור הבהרה של הצמח תילקואיד חלבון הארגון מורכבים ו הלחנה אצל כחול לזיהוי יליד ג'ל אלקטרופורזה (בסון-עמוד) ותיאר 2D-מרחביות עמודים. הפרוטוקול ממוטבת עבורו תודרנית לבנה, , אבל ניתן להשתמש עבור שאר מיני צמחים עם שינויים מזעריים.

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

פרוטוקול זה מדגים הניתוח קומפלקסי שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי מאת כחול מקורי לזיהוי בג'ל. כאן מתוארת השיטה להחיל בתרבית תאים אנושיים.

ניתוח של מתחמי שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי בתאים תרבותי אנושי באמצעות כחול מקורי לזיהוי בג'ל ו- Immunoblotting

למדו את שיטת BN-PAGE לניתוח מתחמי multiprotein מלייזטים תאיים תוך שימור אינטראקציות חלבון-חלבון. הטכניקה משלבת אלקטרופורזה דו-ממדית עם SDS-PAGE לזיהוי הרכב המתחמים.

ג'ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

גלה סרטונים נוספים