שיטה פשוטה עבור Glucosinolate הפקה וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC)

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבצע ניתוח קל ופשוט של גלוקוזינולטים בצמחים ובדגימות ביולוגיות אחרות. שיטה זו, למיצוי וניתוח גלוקוזינולטים, יכולה לשמש כדי לענות על שאלות מפתח באקולוגיה של צמחים-חרקים, פתולוגיה של צמחים, גידול צמחים ומדעי המזון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאומתת היטב וישימה באופן נרחב למגוון רחב של דגימות ביולוגיות.

למרות ששיטה זו משמשת בעיקר לכימות גלוקוזינולטים בחומרים צמחיים, ניתן ליישם אותה גם על קרקעות או מוצרי מזון מוכנים. ניתן לבצע הליך מיצוי זה כמעט בכל מעבדה מכיוון שאתה משתמש בעיקר בציוד מעבדה סטנדרטי. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יבצעו את הניתוחים והבדיקה טוב יותר כאשר הם קוראים וצופים בסרט לפחות פעם אחת.

כדי להתחיל בהליך, מערבבים 10 גרם ג'ל דקסטרין צולב G-25 עם 125 מיליליטר מים טהורים במיוחד. אחסנו את התערובת בבקבוק סגור בחום של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ממיסים 10,000 יחידות של ארילסולפטאז מסוג H-1 ב-30 מיליליטר מים טהורים במיוחד.

מוסיפים לזה 30 מיליליטר אתנול מוחלט ומערבבים היטב את התערובת. צנטריפוגה את התערובת בחום של 2, 650 פעמים G למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שלבו את הסופרנטנט עם 90 מיליליטר אתנול מוחלט בכוס.

מערבבים ויוצקים פנימה צינורות צנטריפוגה חדשים. צנטריפוגה את התערובת בחום של 1, 030 פעמים G למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט.

ממיסים ומשלבים את הכדורים בסך הכל 25 מיליליטר מים טהורים במיוחד. מערבלים היטב את התערובת ואז מעבירים את התערובת לצינורות של 1 מיליליטר. אחסן את דגימות הסולפטט בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שנה.

לאחר מכן, שקלו כ-90 מיליגרם סינוגרמה ורשמו את המשקל לדיוק של 1 מיקרוגרם. לאחר מכן, ממיסים את הסינוגרמה מונוהידרט ב -10 מיליליטר מים טהורים במיוחד. הכן מתמיסת מלאי סינוגרמה זו חמש תמיסות ייחוס בריכוזים הנעים בין 50 ל-750 מיקרומולר.

אחסן את פתרונות הייחוס בצינורות של 1.5 מיליליטר בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, עבור כל דגימה והפניה, סמן צינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מיליליטר במצב מתלה עמודים. חוררים כל מכסה צינור מיקרו-צנטריפוגה עם מחט חיתוך לייבוש בהקפאה מאוחר יותר.

הנח את הצינורות המסומנים בבלוק באותה תצורה ומרווח כמו העמודות המסומנות כדי להכין את עמודי פיפטת הזכוכית, השתמש במוט עץ או זכוכית כדי ללחוץ בעדינות חתיכת צמר זכוכית בגודל 1 סנטימטר על 1 סנטימטר לתוך הפיפטה. אורזים את צמר הזכוכית במעבר של חבית הפיפטה לגבעול.

הנח עמוד פיפטה בכל מיקום מסומן על המתלה. מקם את המתלה מעל מגש אשפה. חותכים את קצה קצה הפיפטה מפלסטיק של 1 מיליליטר.

מנערים היטב את ג'ל הדקסטרין המוכן. ואז השתמש בקצה הפיפטה המורחב כדי להעמיס 0.5 מיליליטר ג'ל דקסטרין מוכן לכל עמודה. בדוק אם יש ג'ל דקסטרין דולף בעמודים והחלף עמודים דולפים.

לאחר שכל העמודים הועמסו בג'ל דקסטרין, שטפו כל עמוד ב-1 מיליליטר מים טהורים במיוחד. שקלו בין 50 ל-100 מיליגרם של צעד חופשי, חומר צמחי טחון דק בצינור תגובה של 2 מיליליטר עם מכסה בטיחות, ורשמו את המשקל בדיוק של 0.1 מיליגרם. הניחו שני כדורי מתכת בקוטר 3 מילימטר בכל צינור.

הוסף לכל שפופרת 1 מיליליטר של 70% מתנול במים טהורים במיוחד, ומערבל בקצרה כל תערובת. סגור את הצינורות עם מכסי בטיחות נוספים, והניח אותם מיד באמבט מים של 90 עד 92 מעלות צלזיוס. מחממים את הצינורות עד שהמסור מתחיל לרתוח.

העבירו את הצינורות לאמבט קולי, וחממו את הדגימות למשך 15 דקות. במהלך סוניקציה, התחל להפשיר את דגימת הסולפטט והפניות לסינוגרמה. לאחר סוניקציה, צנטריפוגה את הדגימות ב -2, 700 פעמים G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

טען את הסופרנטנטים ואת הפניות הסינוגרמה המופשרת על העמודות המתאימות, היזהר לא למשוך חומר צמחי לתוך הפיפטה. הוסף 1 מיליליטר של 70% מתנול לכל צינור. מערבל את התערובות.

ומחממים קולי את התערובות למשך 15 דקות. צנטריפוגה את הצינורות שוב באותם תנאים כמו קודם. טען את הסופרנטנטים על העמודות המתאימות.

הוסף שתי מנות של 1 מיליליטר של 70% מתנול לכל עמודה, מה שמאפשר לעמודות להתייבש בין כל חלק. שטפו שאריות מתנול מכל עמודה עם 1 מיליליטר מים טהורים במיוחד. לאחר מכן, שטפו כל עמודה בשתי מנות של 1 מיליליטר של מאגר נתרן אצטט 20 מילי-מולרי, pH 5.5.

לאחר שהחלקים האחרונים של מאגר הנתרן אצטט התנקזו לתוך מדף הפסולת, הסר את המתלה ממגש הפסולת וייבש את רגלי המתלה עם טישו. מקם את המתלה מעל גוש צינורות המיקרו-צנטריפוגה המסומנים בתווית, כך שקצות העמודים יהיו בצינורות המתאימים. טען 20 מיקרוליטר של תמיסת סולפטט על כל עמוד, וודא שהתמיסה תגיע לפני השטח של חומר העמוד.

שטפו את תמיסת הסולפטט לחומר העמוד עם 50 מיקרוליטר של מאגר נתרן אצטט. חשוב מאוד שהסולפטט יישטף לתוך העמוד. האנזים חייב להיות על העמודה כדי להגיב לגלוקוזינולטים השלמים הקשורים בעמודה.

לאחר שתמיסת הסולפטט נשטפה על כל עמוד, מכסים את העמודים בנייר אלומיניום. אפשר לעמודים לעמוד למשך הלילה. לאחר מכן, רמז לדה-סולפו-גלוקוזינולטים מכל עמודה עם שתי מנות של 0.75 מיליליטר של מים טהורים במיוחד.

לאחר שהעמודים התייבשו, הסר את מתלה העמודים וכסה כל צינור. הקפיאו את הצינורות בחנקן נוזלי, או בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. מקפיאים לייבש את הדגימות למשך 12 עד 24 שעות.

ממיסים כל שאריות ב-1 מיליליטר מים טהורים במיוחד. ולאחר מכן להעביר כל דגימה והפניה לבקבוקוני דגימת HPLC מסומנים. הפרד את התמציות בעמודת CAT בשלב הפוך.

השתמש באורך גל זיהוי של 229 ננומטר. לאחר הפרדה על ידי HPLC, ניתן לזהות את הגלוקוזינולטים על ידי השוואה של זמני החזקה וספקטרום UV עם תקני גלוקוזינולט ידועים. ריכוזי הגלוקוזינולט בדגימה מחושבים מעקומת כיול סינוגרמה, וערכי ספרות לגורמי תגובה.

מכאן ניתן לקבוע את ריכוזי הגלוקוזינולט בדגימת הצמח המקורית. בתנאי HPLC המשמשים, הפרוגויטרין הלא בריא רומז די מוקדם, ומופרד מהגלוקורפנין המועיל ביולוגית. גם האנדו-גלוקוזינולטים מופרדים היטב.

סדרות ליוטרופיות נצפות עם חוליות שרשרת צדדיות הולכות וגדלות עבור אלקונול, מתילפול-אלקונול ומתיל-סולפינול-גלוקוזינולטים ארוכי שרשרת ארוכה יותר. לפיכך ניתן לסווג גלוקוזינולטים לא ידועים באופן זמני על סמך סדרות ליוטרופיות אלה בשילוב עם ספקטרום UV. עם הכנה נכונה, ניתן לחלץ 150 עד 200 דגימות על ידי אדם אחד ביום עבודה אחד.

ייקח עוד יום לרמוז על עמודים, לייבש בהקפאה את הדגימות ולהכין אותן ל-HPLC. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות, כגון LCMS, לזיהוי דסולפו-גלוקוזינולטים לא ידועים בכרומטוגרמה שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ גלוקוזינולטים מהדגימות הביולוגיות שלך ולנתח אותם באמצעות HPLC.

אל תשכח שעבודה עם מתנול יכולה להיות מסוכנת ביותר, וצריכה להיעשות תמיד מתחת למכסה האדים.