שיטה פשוטה עבור Glucosinolate הפקה וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC)

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לבצע ניתוח פשוט וישיר של גלוקוסינולאטים בצמחים ובדגימות ביולוגיות אחרות. שיטה זו למיצוי וניתוח של גלוקוסינולאטים יכולה לשמש למתן מענה לשאלות מפתח באקולוגיה של צמחים וחרקים, פתולוגיה של צמחים, Breeders של צמחים ומדעי המזון. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מתוקתקת היטב ויש לה יישום רחב למגוון רחב של דגימות ביולוגיות.

למרות ששיטה זו משמשת בעיקר לכימות גלוקוסינולאטים בחומרים מהצומח, ניתן להחילה אותה גם על קרקעות או על מוצרי מזון מעובדים. ניתן לבצע הליך מיצוי זה כמעט בכל מעבדה, כיוון שנעשה בו שימוש בעיקר בציוד מעבדה סטנדרטי. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יבצעו את האנליזות והבדיקה בצורה טובה יותר לאחר שיקראו ויצפו בסרטון לפחות פעם אחת.

כדי להתחיל בהליך, ערבבו 10 grams של ג'ל דקסטרין מצולב G-25 עם 125 milliliters של מים אולטרה-טהורים. אחסנו את התערובת בבקבוק סגור בטמפרטורה של 4 degrees Celsius. לאחר מכן, המיסו 10,000 units של ארילסולפטאז מסוג H-1 ב-30 milliliters של מים אולטרה-טהורים.

הוסיפו לכך 30 milliliters של אתנול מוחלט וערבבו היטב את התערובת. סובבו את התערובת בצנטריפוגה במהירות של 2,650 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את הנוזל העליון (supernatant) יחד עם 90 milliliters של אתנול מוחלט לכלי בכר.

ערבבו ושפכו למבובות צנטריפוגה חדשות. צנטריפוגו את התערובת ב-1,030 times G למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הנוזל העליון (supernatant).

המסו ושלבו את הכדורים בסך של 25 מיליליטר מים אולטרה-טהורים. ערבבו את התערובת היטב באמצעות וורטקס ולאחר מכן העבירו את התערובת למבחנות של 1 מיליליטר. אחסנו את דגימות הסולפט בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת.

בשלב הבא, שקלו כ-90 מיליגרם של סינוגרם ורשמו את המשקל בדיוק של 1 מיקרוגרם. לאחר מכן, המסו את הסינוגרם מונוהידראט ב-10 מיליליטר של מים אולטרא-טהורים. הכינו מתמיסת המקור של הסינוגרם חמש תמיסות ייחוס בריכוזים הנעים בין 50 ל-750 מיקרומולארי.

שמור את תמיסות הייחוס באנבונות של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, עבור כל דגימה וייחוס, סמן אנבובת מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל במיקום המתאים במעמד האנבונות. נקב את מכסה כל אנבובת מיקרו-צנטריפוגה באמצעות מחט דיסקציה לצורך ייבוש בהקפאה מאוחר יותר.

הנח את המבחנות המסומנות בתוך בלוק, באותו סידור ובאותם מרווחים של העמודות המסומנות. כדי להכין את עמודי פיפטות הזכוכית, השתמש במקל עץ או זכוכית כדי לדחוס בעדינות פיסת צמר זכוכית בגודל 1 סנטימטר על 1 סנטימטר לתוך הפיפטה. דחוס את צמר הזכוכית במעבר שבין גוף הפיפטה לבעלה.

הניחו עמודת פיפטה בכל אחת מהמיקומים המסומנים על גבי המעמד. מקמו את המעמד מעל תבנית פסולת. גזרו את הקצה של טיפ פיפטה מפלסטיק בנפח 1 milliliter.

נערה היטב את ג'ל הדקסטרין שהוכן. לאחר מכן, השתמשו בטיפ פפט רחב כדי להטעין 0.5 milliliters של ג'ל דקסטרין מוכן לכל עמודה. בדקו אם יש דליפה של ג'ל הדקסטרין מהעמודות והחליפו כל עמודה הדולפת.

לאחר שכל העמודות הומאו בגל דקסטרין, שטפו כל עמודה עם 1 milliliter של מים אולטר-טהורים. שקלו בין 50 ל-100 milligrams של חומר צמחי גרוס דק Membranes, בתוך מבחנת תגובה של 2 milliliter עם מכסה בטיחות, ורשמו את המשקל בדיוק של 0.1 milligrams. הניחו שתי כדורי מתכת בקוטר 3 millimeter בכל מבחנה.

הוסיפו לכל מבחנה 1 milliliter של 70% methanol במים ultrapure, וערבבו כל תערובת קצרה באמצעות vortex. סגרו את המבחנות עם מכסי בטיחות נוספים, והניחו אותן מיד בבנ मराठी מים בטמפרטורה של 90 עד 92 degrees Celsius. חממו את המבחנות עד שהדגימה מתחילה רתיחה.

העבירו את המבחנות לאמבט אולטרסוני, וחממו את הדגימות באמצעות גלי קול למשך 15 דקות. במהלך הסוניקציה, התחילו להפשיר את דגימת הסולפיה ואת רפרנסי הסינוגרמה. לאחר הסוניקציה, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 2,700 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

העבירו את העל-נשיבים (supernatants) ואת רפרנסי הסינוגרמה (sinogram references) שהופשרו לעמודות המתאימות, תוך הקפדה שלא לשאוב חומר צמחי למטפטה. הוסיפו 1 מיליליטר של מתנול 70% לכל מבחנה. ערבבו את התערובות באמצעות וורטקס.

חממו את התערובת באמצעות אולטרסאונד למשך 15 דקות. סבבו את המבחנות שוב בצנטריפוגה תחת אותם תנאים כפי שבוצע קודם לכן. העמיסו את העילאיים על העמודות המתאימות.

הוסיפו שתי מנות של 1 milliliter של 70%methanol לכל עמודה, והמתינו עד שהעמודות יתייבשו בין מנה למנה. שטפו שאריות methanol מכל עמודה בעזרת 1 milliliter של ultrapure water. לאחר מכן, שטפו כל עמודה בשתי מנות של 1 milliliter של sodium acetate buffer בריכוז 20 millimolar, pH 5.5.

לאחר שחלקיו האחרונים של בופר סודיום אצטט התנקזו למסננת הפסולת, הוצא את המסננת ממגש הפסולת ויבש את רגלי המסננת בעזרת נייר סופג. מקם את המסננת מעל הבלוק של מבחנות המיקרוצנטריפוגה המסומנות, כך שקצות העמודות נמצאים במבחנות המתאימות. טען 20 µL של תמיסת סולפייט לכל עמודה, תוך וידוא שהתמיסה מגיעה לפני השטח של חומר העמודה.

שטפו את תמיסת הסולפטאז אל תוך חומר העמודה באמצעות 50 µL של חוצץ נתרן אצטט. חשוב מאוד שסולפטאז יישטף פנימה אל תוך העמודה. האנזים חייב להימצא על העמודה כדי להגיב עם הגלוקוסינולאטים השלמים הקשורים לעמודה.

לאחר שפתרון הסולפט שוטף כל עמודה, כסו את העמודות בנייר אלומיניום. הניחו לעמודות לעמוד בן לילה. לאחר מכן, אלוטו את ה-de-sulfo-glucosinolates מכל עמודה באמצעות שתי מנות של 0.75 milliliter של מים ultrapure.

לאחר שהעמודות התרוקנו, הוצא את מתקן העמודות וסגור כל מבחנה עם פקק. הקפא את המבחנות בחנקן נוזלי, או ב-80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. ייבש בתנאי ואקום (lyophilize) את הדגימות למשך 12 עד 24 שעות.

המסו כל שארית ב-1 milliliter של מים אולטרה-טהורים. לאחר מכן, העבירו כל דגימה ודגימת ייחוס לבקבוקוני דגימה למכשור HPLC מסומנים. הפרידו את התמציות על עמודת reverse phase CAT.

השתמש באורך גל גילוי של 229 nanometers. לאחר ההפרדה באמצעות HPLC, ניתן לזהות את הגלוקוסינולטים על ידי השוואת זמני השהייה וספקטרום UV מול סטנדרטים ידועים של גלוקוסינולטים. ריכוזי הגלוקוסינולטים בדגימה מחושבים על בסיס עקומת כיול סינוגרמה וערכי ספרות עבור מקדמי תגובה.

מכאן ניתן לקבוע את ריכוזי הגלוקוסינולאט בדגימת הצמח המקורית. תחת תנאי ה-HPLC שבהם נעשה שימוש, הפרוגויטרין הבלתי בריא מופיע בשלב מוקדם למדי, והוא מופרד מהגלוקורפנין המועיל ביולוגית. גם האנדו-גלוקוסינולאטים מופרדים היטב.

סדרות ליוטרופיות נצפות עם הגדלה של קישורי שרשראות הצד עבור alconol, methylfol-alconol, וג'לוקוסינולאטים בעלי שרשראות ארוכות יותר של methyl-solfinol. לפיכך, ניתן לסווג באופן ראשוני ג'לוקוסינולאטים שאינם ידועים על בסיס סדרות ליוטרופיות אלו בשילוב עם ספקטרום UV. בהכנה נכונה, אדם אחד יכול להפיק בין 150 ל-200 דגימות ביום עבודה אחד.

ייקח יום נוסף כדי להתייחס לעמודות, להקפיא-ייבש את הדגימות ולהכין אותן ל-HPLC. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להחיל שיטות אחרות, כגון LCMS, כדי לזהות desulfo-glucosinolates לא ידועים בchromatogram שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לך הבנה טובה של אופן מיצוי ה-glucosinolates מהדגימות הביולוגיות שלך וניתוחן באמצעות HPLC.

זכרו כי עבודה עם מתנול עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לבצעה תמיד תחת מנדף כימיים.