Name: שיטה פשוטה עבור Glucosinolate הפקה וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: למדו שיטה פשוטה לחילוץ וניתוח גלוקוזינולטים מחומרי צמחים באמצעות HPLC. הפרוטוקול המאומת הזה מסייע לחוקרים באקולוגיה, פתולוגיית צמחים ומדעי המזון לכמת תרכובות הגנה בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NMvD מודה לד"ר מיכאל רייכלט (מכון מקס פלאנק לאקולוגיה כימית, יינה, גרמניה) על שסיפק את דגימות הייחוס הראשונות כשהחלה להשתמש בשיטה זו לפני 16 שנים. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, הולנד), סבסטיאן קרוסה (B-Ware, ניימכן, הולנד) וכריסטיאן ריסטוק (iDiv, לייפציג) זוכים להכרה על שיפור הפרוטוקול במהלך השנים. מירקה מסל ומרטין הוברטי (אוניברסיטת טובינגן, גרמניה) זוכות להכרה על הרשאתן להשתמש בכרומטוגרמה של רוריפה. המחברים מודים בהכרת תודה על תמיכתו של המרכז הגרמני לחקר המגוון הביולוגי האינטגרטיבי (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, הממומן על ידי קרן המחקר הגרמנית (FZT 118).

<ol><li>Hartmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+waste+products+to+ecochemicals%3A+Fifty+years+research+of+plant+secondary+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">From waste products to ecochemicals: Fifty years research of plant secondary metabolism.</a> Phytochemistry. 68 (22-24), 2831-2846 (2007).</li>
<li>Will, H., Laubenheimer, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jlac.18791990109/abstract">Ueber das Glucosid des weissen Senfsamens.</a> Justus Liebigs Annalen der Chemie. 199 (1), 150-164 (1879).</li>
<li>Agerbirk, N., Olsen, C. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22405332">Glucosinolate structures in evolution.</a> Phytochemistry. 77, 16-45 (2012).</li>
<li>Halkier, B. A., Gershenzon, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16669764">Biology and biochemistry of glucosinolates.</a> Ann Rev Plant Biol. 57, 303-333 (2006).</li>
<li>Sønderby, I. E., Geu-Flores, F., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+glucosinolates+-+gene+discovery+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22TIPS%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of glucosinolates - gene discovery and beyond.</a> TIPS. 15 (5), 283-290 (2010).</li>
<li>Kliebenstein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+natural+variation+in+Arabidopsis+glucosinolate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of natural variation in Arabidopsis glucosinolate accumulation.</a> Plant Physiol. 126 (2), 811-825 (2001).</li>
<li>van Leur, H., Raaijmakers, C. E., van Dam, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+glucosinolate+polymorphism+within+natural+populations+of+Barbarea+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">A heritable glucosinolate polymorphism within natural populations of Barbarea vulgaris.</a> Phytochemistry. 67 (12), 1214-1223 (2006).</li>
<li>Kelly, P. J., Bones, A., Rossiter, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+immunolocalization+of+the+glucosinolate+sinigrin+in+seedlings+of+Brassica+juncea%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular immunolocalization of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea.</a> Planta. 206 (3), 370-377 (1998).</li>
<li>van Dam, N. M., Tytgat, T. O. G., Kirkegaard, J. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11101-008-9101-9">Root and shoot glucosinolates: a comparison of their diversity, function and interactions in natural and managed ecosystems.</a> Phytochem Rev. 8 (1), 171-186 (2009).</li>
<li>Ratzka, A., Vogel, H., Kliebenstein, D. J., Mitchell-Olds, T., Kroymann, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12161563">Disarming the mustard oil bomb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (17), 11223-11228 (2002).</li>
<li>Wittstock, U., Kliebenstein, D. J., Lambrix, V., Reichelt, M., Gershenson, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittstock%2C+U+%22Integrative+Phytochemistry%3A+From+ethnobotany+to+molecular+ecology%3A+Recent+Advances+in+Phytochemistry%22">Integrative Phytochemistry: From ethnobotany to molecular ecology: Recent Advances in Phytochemistry</a>. Romeo, J. T. 37, Ch. 5 Pergamon (2003).</li>
<li>Hopkins, R. J., van Dam, N. M., van Loon, J. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+glucosinolates+in+insect-plant+relationships+and+multitrophic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Role of glucosinolates in insect-plant relationships and multitrophic interactions.</a> Ann Rev Entomol. 54 (1), 57(2009).</li>
<li>Kliebenstein, D. J., Gershenzon, J., Mitchell-Olds, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+quantitative+trait+loci+mapping+of+aliphatic%2C+indolic+and+benzylic+glucosinolate+production+in+Arabidopsis+thaliana+leaves+and+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative quantitative trait loci mapping of aliphatic, indolic and benzylic glucosinolate production in Arabidopsis thaliana leaves and seeds.</a> Genetics. 159 (1), 359-370 (2001).</li>
<li>Mithen, R., Bennett, R., Marquez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucosinolate+biochemical+diversity+and+innovation+in+the+Brassicales%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Glucosinolate biochemical diversity and innovation in the Brassicales.</a> Phytochemistry. 71 (17-18), 2074-2086 (2010).</li>
<li>Buchner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchner%2C+R+%22Glucosinolates+in+rapeseed%22">Glucosinolates in rapeseed</a>. Wathelet, J. P. , Martinus Nijhoff Publishers. 50-58 (1987).</li>
<li>Oil seeds - determination of glucosinolates High Perfomance Liquid Chromatography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Official+Journal+of+the+European+Communities%22">Official Journal of the European Communities</a>. , L 170/28. Annex VIII 03.07 27-34 (1990).</li>
<li>Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M., Gershenzon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+glucosinolate+accumulation+among+different+organs+and+developmental+stages+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Variation of glucosinolate accumulation among different organs and developmental stages of Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 62 (3), 471-481 (2003).</li>
<li>Glauser, G., Schweizer, F., Turlings, T. C. J., Reymond, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Profiling+of+Intact+Glucosinolates+in+Arabidopsis+Leaves+by+UHPLC-QTOFMS+Using+a+Charged+Surface+Hybrid+Column%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Rapid Profiling of Intact Glucosinolates in Arabidopsis Leaves by UHPLC-QTOFMS Using a Charged Surface Hybrid Column.</a> Phytochem Analysis. 23 (5), 520-528 (2012).</li>
<li>Crocoll, C., Halkier, B. A., Burow, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrocoll%2C+C+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22">Current Protocols in Plant Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).</li>
<li>Griffiths, D. W., Bain, H., Deighton, N., Botting, N. P., Robertson, A. A. B. <a target="_blank" href="https://pubag.nal.usda.gov/pubag/article.xhtml?id=1446175">Evaluation of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-mass spectrometry for the identification and quantification of desulphoglucosinolates.</a> Phytochem Analysis. 11 (4), 216-225 (2000).</li>
<li>Gimsing, A. L., Kirkegaard, J. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11101-008-9105-5">Glucosinolates and biofumigation: fate of glucosinolates and their hydrolysis products in soil.</a> Phytochem Rev. 8 (1), 299-310 (2009).</li>
<li>Fahey, J. W., Zalcmann, A. T., Talalay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+diversity+and+distribution+of+glucosinolates+and+isothiocyanates+among+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants.</a> Phytochemistry. 56, 5-51 (2001).</li>
<li>de Graaf, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+4-%CE%B1-rhamnosyloxy+benzyl+glucosinolate+in+Noccaea+caerulescens+showing+intraspecific+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of 4-α-rhamnosyloxy benzyl glucosinolate in Noccaea caerulescens showing intraspecific variation.</a> Phytochemistry. 110 (0), 166-171 (2015).</li>
<li>van Dam, N. M., Raaijmakers, C. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00049-005-0323-7">Local and systemic induced responses to cabbage root fly larvae (Delia radicum) in Brassica nigra and B. oleracea.</a> Chemoecology. 16 (1), 17-24 (2006).</li>
<li>Gols, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1439179106000892">Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions.</a> Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

היתרונות הגדולים של שיטה נרחבת והקימה זה נעשה שימוש הם שזה חזק, די פשוט, בעלות נמוכה יחסית לדגימה. רוב הציוד הנדרש לצורך מיצוי הניתוח צריך להיות זמין במעבדה רגילה או יכול להיות עצמית בנוי, למעט ה- PDA-HPLC. יתרון נוסף הוא כי desulfoglucosinolates מומס במים מבחינה כימי יציב למדי כאשר שמרו על קור רוח ועל צלוחיות אוויר חזק (HPLC), כך התמציות יכולות להישלח בקלות לניתוח HPLC במקום אחרת. בניגוד פלטפורמות LC-MS, אשר דורשת ידע או מומחיות וניסיון מעשי נרחב לניהול תוכנה וניתוח נתונים, HPLC-UV / מחשבי כף יד ניתן להפעיל בקלות לאחר תקופת הכשרה קצרה. זה לא רק מפחית את עלויות ההליך, אלא גם עושה בשיטה זו לנגישה יותר מגוון רחב של מדענים, כולל סטודנטים. בדרך כלל, כאשר ההליכים מתוארים מתוארים לעיל carefully, כמה בעיות צריכות להתרחש. באופן כללי, פסגות glucosinolate מופרדות היטב את הכרומתוגרמה. אם זה אינו המקרה, תכנית השיפוע יכולה להיות מותאמת על ידי הפחתת שיעור עליית אצטוניטריל ב eluent. לחלופין, אם יוצר-מראש של עמודות חדשות (200-500 זריקות) או עמודה (1,500 -2000 זריקות) עשוי לפתור את הבעיה. לפעמים, chromatograms של דגימות יחידות באצווה עשוי להיראות מאוד קטן או ללא פסגות. זה בדרך כלל בגלל שגיאות pipetting בעת הוספת sulfatase (למשל, טור כבר דילג או sulfatase לא נשטף כראוי למטה לתוך הטור). לחלופין, ריכוז glucosinolate בחומרים הניסיוניים אולי נמוך מצפוי וחומר מעט מדי נעשה שימוש לצורך המיצוי. אם זו הבעיה, את עוצמת הזריקה ניתן להעלות עד 100 μL, או aliquot מדויק (למשל, 800 μL) של תמצית יכול להיות מרוכז. זו האחרונה יכולה להיות מושגת על ידי ייבוש על ידי קורing התמצית, המסת שאריות נפח קטן יותר (למשל, 100 μL) של מים, reinjecting באמצעות עקומת הפניה אותו. בחישובים עבור הריכוז המקורי של תמצית, המספרים צריך להיות מוכפל במקדם דילול. אם זה לא פותר את הבעיה, החומרים יש לנצל שוב באמצעות חומר-מוצא יותר. אם זה יותר מ -100 מ&quot;ג, היקף ממסי החילוץ ואת הגודל של הצינורות צריכים להיות מותאם באופן יחסי לשמור על יעילות המיצוי. יתרון נוסף הוא כי שיטה זו כבר היטב תוקפת. זאת, משום שהיא תוארה שיטה סטנדרטית כימות של glucosinolates ב לפתית, עבורו הנהלים והדיוק אוששו מספר מעבדות 16. בנוסף, הרקע הגנטי, ביוסינתזה, והתפקידים ביולוגיים של glucosinolates כפופים מאמצי מחקר אינטנסיביים, ב modאל צמח מיני ארבידופסיס thaliana בין היתר 4, 6, 12. לכן, גורמים רבים בתגובת כימות המדויקת של desulfoglucosinolates ביחס sinigrin מוגדרים היטב לציבור רחב 15,17. למרות פרוטוקולים מבוססים LS-MS יותר תפוקה גבוהה, רגישים יותר, והם מסוגלים (בהיסוס) לזהות glucosinolates עבורו אין סטנדרטים זמינים 18, 19, 20, עדר גורמי תגובה אוניברסאלי-MS LC מגביל את כימות מדויק של ריכוזי glucosinolate 18. יתר על כן, שיטות אלה בדרך כלל אינן כוללות צעד ייבוש בהקפאה, ואת כמות מי החומר הצמחי הטרי הוא נעדר בחישובים, מה שהופך כימות מדויק קשה. לבסוף, בגלל שיטת החילוץ שלנו כרוכה טור מבוססטיהור צעד ריכוז, זה יכול לחול גם על דגימות &quot;מלוכלכות&quot; עם ריכוזים נמוכים של glucosinolates, כגון קרקעות 21. בהשוואה לשיטות LC-מבוססות MS שבדרך כלל לחלץ חומרים קפוא טרי, השתמשו 96-גם צלחות להפקה, ואינו כוללים צעד sulfatase 18, 19, בשיטה שלנו היא יחסית זמן רב ועבודה אינטנסיבית. עם מתלי הטור המתואר במאמר זה, אדם אחד יכול לחלץ כ 100-150 דגימות ביום אחד. Elution (למחרת), להקפיא ייבוש (לילה), מחדש המסה יכולה להתקיים בתוך הימים הבאים. עם מזרק HPLC אוטומטי, זמן לרוץ איזון של 40-45 דקות לכל זריקה, ולא אירועים בלתי צפויים, זה ייקח 3-4 ימים כדי לרכוש את הנתונים עבור קבוצת מדגם זה. כשתוכנת HPLC מאפשרת כימות אוטומטית המבוססת על עקומת sinigrin, המחאה ידנית של chromatograms ו- PEהקצאות ak עבור 100 דגימות עשויות רק לקחת עוד h 1 או 2 לפני הנתונים ניתן להשתמש עבור ניתוחים סטטיסטיים. למרות הזמינות הגוברת של סטנדרטים glucosinolate, רק חלק קטן של יותר מ -130 מועמדים יכולים כיום לקנות מסחרית. עם זאת, עם כמה הפניות לכל המעמדות biosynthetic; גישה למאגרי מידע בספרות המפרטת את תרכובות שנמצאו בעבר מיני צמחים (למשל, פאהי ואח 22.); ידע בסיסי של עקרונות chromatographic, כגון ההיגיון של סדרת eluotropic (למשל, עבור מספר גדל והולך של Cs על שרשרת הצד ב אליפטיות, איורים 3 ו -4); ואת האימות של דגימות יחידות על LC-MS 19 או glucosinolates מבודד על תמ&quot;ג 23, אפשר בקלות להתגבר על מגבלה זו. רוב פרוטוקולי glucosinolate מנתח להשתמש עקומות התייחסות פנימיות(כלומר, ריכוז מסוים להפקת sinigrin או sinalbin החילוץ 16 ממס, 17, 19). בעיקר, עקומות התייחסות פנימיות במתכונת מותאמות יותר לתקן שגיאות עיבוד מדגם בודדות ולכן תיאורטית להניב דיוק גבוה. למרות יתרון זה, אנחנו מעדיפים להשתמש עקומת ייחוס חיצוני חמש נקודות, כמו שאנחנו בדרך כלל לנתח מינים ברים שונים, שחלקם מכילים רמות גבוהות של sinigrin (למשל, Brassica nigra 24) או sinalbin (למשל, חַרדָל alba 25), שתי התייחסויות glucosinolate עבורו גורמים בתגובה זמינות. יתר על כן, הוספת תקנים פנימיים מדגם זה מגדילה את עלות הניתוחים, כמו התייחסות לסטנדרטים glucosinolate בדרגה גבוהה הם בדרך כלל די יקרים. לסיכום, למרות הצעדים זמן רב, פרוטוקול זהמספק שיטה פשוטה ונגישה לחלץ ולכמת glucosinolates בדגימות צמח. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון כי רמות glucosinolate עצמם הן רק אינדיקציה לפעילות הביולוגית הפוטנציאל, כפי שניתן לראות את הצורך להגיב עם myrosinase, ו וריאציה את תוצרי התגובה יכולה לנבוע כתוצאת glucosinolate יחיד 11. מבחני אימות חייבות להתבצע על מנת לאשר את הרלוונטיות הביולוגיות.

הערכה היא כי צמחים מייצרים למעלה מ -200,000 סוגים שונים של תרכובות כימיות 1. רק המיעוט של תרכובת אלה נראה למלא תפקיד בחילוף החומרים העיקריים של הצמח, אשר דלקי גידול ורבייה; מה שנקרא הרוב הם מטבוליטים משניים. למרות שמם, מטבוליטים משניים הם לעתים קרובות קריטיים להישרדות צמח ורבייה, כפי שהם משרתים למשוך מאביקים או להגן על הצמח מפני פתוגנים ואוכלי עשב 1. Glucosinolates הם קבוצה מגוונת מאוד של מטבוליטים משניים כי נחקרו למעלה מ -150 שנה 2. נכון להיום, יותר מ -130 glucosinolates שונים מבחינה מבנית זוהו 3. באופן כללי, glucosinolates נחלק לסוגים שונים המבוססים על חומצות אמיניות שממנו הם מסונתזים. glucosinolates אינדול, למשל, מסונתזים מן חומצת אמינוטריפטופן, פנילאלנין ואילו מספק את שלד הבסיס לסינתזה של glucosinolates ארומטיים 4. במסגרת שיעורים, יש רמה גבוהה של גיוון מבני, אשר מובא על ידי צעדי התארכות שרשרת רציפי מסלולי biosynthetic, כגון בכיתה של glucosinolates אליפטיות, או על ידי שינויי שרשרת צד (למשל, hydroxylation) 4, 5. אחת מיני צמחי glucosinolate עשויים להכיל עד 37 glucosinolates שונים השייכים כיתות מבניות שונות 6. למרות מיני צמחים יש פרופילים glucosinolate טיפוסי, וריאציה intraspecific עבור סוגי glucosinolates נמצא לעתים קרובות בקרב אנשים ואוכלוסיות 6, 7. Glucosinolates השלם מאוחסן vacuoles של תאי צמח ניתן למצוא בכל איבר עילי או belowground 7, &lt;sup class = &quot;Xref&quot;&gt; 8, 9. עם תא קרע (למשל, על ידי herbivory), glucosinolates משתחררת מעורבבות עם האנזים myrosinase בקיזוז פצצת שמן חרדל 10. בשל הפעילות של myrosinase, ו בהתאם למבנה של glucosinolate, תנאי התגובה, ואת הנוכחות של אנזימי שינוי, תרכובות חריפות, רעילות או מזיקים שונות נוצרות, כגון nitriles ו (ISO) thiocyanates 11. מוצרי התגובה יש פעילויות ביולוגיות גבוהות; למשל, הם משמשים דוחים של אוכלי עשב חרק generalist 12. התורשתיות ואת biosynthetic המסלולים של glucosinolates נלמדים היטב, בעיקר בגלל חשיבותם אוכלי עשב והתנגדות הפתוגן, ערכם כרכיבי טעם ב חרדל וכרוב, והשלילי שלהם (progoitrin) וחיוביות (glucoraphanin) השפעות על בריאות אדם 5, </sup&gt; 13, 14. בגלל העניין הרב glucosinolates כמו תרכובות ביולוגיות אקטיביות, שיטות חילוץ וזיהוי מבוססות על כרומטוגרפיה הנוזלית התהפכו פאזיים בלחץ גבוה (HPLC) מצויד אולטרה סגול (UV) או מערך photodiode (PDA) גלאים כבר נפוצים מאז 1980 15 . בהתבסס על שיטה זו, הקהילה האירופית פרסמה פרוטוקול סטנדרטי אשר נבדק ומאומת בכמה מעבדות לניתוח של glucosinolates ב בוטנים (Brassica napus, כרוב הנפוס, קנולה 16). אחרים הוסיפו שיטה זו (למשל, על ידי קביעת גורמי מענה נוספים עבור glucosinolates שאינם נוכחים אונס זרעים להפקת שמן) 17. למרות הזמינות הגוברת של ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS) פלטפורמות ופרוטוקולים תפוקה גבוהה לניתוח glucosinolate 18 <sup&gt;, 19, שיטת HPLC-UV / PDA המקורי עדיין נעשה שימוש נרחב על ידי מדענים. הסיבות העיקריות הן כי שיטה זו היא פשוטה, חסכונית, יחסית נגיש למעבדות ללא תשתית הידע הכימי-אנליטי נרחב. כדי לשרת את הקהילה הזו, אנחנו כאן בפירוט את הפרוטוקול עבור החילוץ של glucosinolates מחומרים הצמח ועל ניתוח desulfo-צורותיהם עם HPLC-PDA.

<table><tbody><tr><td>מתנול HiPerSolv CHROMANORM&reg; דרגת שיפוע עבור HPLC כיתה</td><td>VWR</td><td>20864.320</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט (NaOAc)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>W302406-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>1.09057.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120-10G</td><td></td></tr> <tr><td>(&minus;)-Sinigrin hydrate מחזרת&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S1647-500MG</td><td></td></tr><tr><td>אריל סולפטאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9626-10KU</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>VWR</td><td>20816.298</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת פסטר</td><td>קארל רוט</td><td>4518.1</td><td></td></tr><tr><td>צמר זכוכית</td><td>קארל רוט</td><td>7377.1</td><td></td></tr><tr><td>מקל זכוכית/עץ</td><td>VWR</td><td>HERE1080766</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תגובה של 2 מ"ל</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td></td></tr><tr><td>מחט כריתה</td><td>קארל רוט</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>כלי מעבדה רוטילבו</td><td>קארל רוט</td><td>0772.1</td><td>מגש פסולת</td></tr><tr><td>קליפס איטום רוטילבו</td><td>קארל רוט</td><td>N217.1</td><td></td></tr><tr><td>מייבש הקפאה אזור חופשי 12 ליטר</td><td>Labconco</td><td>7960030</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל סופר שיפוע</td><td>כיתה VWR</td><td>83639.320</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>VWR</td><td>462-5112</td><td></td></tr><tr><td>אמבט אולטרסאונד</td><td>פישר סיינטיפי</td><td>FB 15061</td><td></td></tr><tr><td>PH אלקטרודה</td><td>תרמו פישר STARA2115</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה הראוס מולטיפוגה X1</td><td>תרמו פישר 75004210</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טרום טור</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>69697</td><td>עמודה C18 (4.6 x 10 מ"מ, 5 ומיקרו; מ', 300 וארינג;)&nbsp;</td></tr><tr><td>טור שבחים 300</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>60266</td><td>C18 טור (4.6 x 150 מ"מ, 3 & מיקרו; מ', 300 וארינג;)&nbsp;</td></tr><tr><td>HPLC Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>עם תנור עמודים וגלאי UV או PDA</td></tr><tr><td>בקבוק 1,000 מ"ל</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>תרכובות ייחוס גלוקוזינולט</td><td>Phytoplan</td><td>http://www.phytoplan.de/ שונות</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה פשוטה עבור glucosinolate הפקה וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (hplc)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

גלוקוזינולטים הם קבוצה מגוונת ונחקרת היטב של תרכובות צמחיות טבעיות. הם ממלאים תפקידים חשובים בעמידות צמחים, איכות שמן לפתית, טעם מזון ובריאות האדם. הפעילות הביולוגית של גלוקוזינולטים משתחררת עם נזק לרקמות, כאשר הם מעורבבים עם האנזים מירוזינאז. התוצאה היא היווצרות תוצרי פירוק חריפים ורעילים, כגון איזותיוציאנטים וניטרילים. נכון לעכשיו, זוהו יותר מ-130 גלוקוזינולטים שונים מבחינה מבנית. המבנה הכימי של הגלוקוזינולט הוא גורם חשוב במוצר שנוצר, אשר בתורו קובע את פעילותו הביולוגית. האחרון עשוי לנוע בין מזיק (למשל, פרוגואיטרין) למועיל (למשל, גלוקורפנין). לכל מין צמחים המכיל גלוקוזינולט יש פרופיל גלוקוזינולט ספציפי משלו. מסיבה זו, חשוב לזהות נכון ולכמת באופן אמין את הגלוקוזינולטים השונים הקיימים בגידולי עלים, זרעים ושורשים או, לצורך מחקרים אקולוגיים, בקרוביהם הפראיים. כאן, אנו מציגים שיטה מתוקפת, ממוקדת וחזקה לניתוח פרופילי גלוקוזינולט במגוון רחב של מיני צמחים ואיברי צמחים. גלוקוזינולטים שלמים מופקים מחומרים צמחיים טחונים עם תערובת מתנול-מים בטמפרטורות גבוהות כדי להשבית את פעילות המירוזינאז. לאחר מכן, התמצית המתקבלת מובאת על עמוד חילופי יונים לטיהור. לאחר הטיפול בסולפטאז, הדסולפוגלוקוזינולטים נפלטים במים והאלואט מיובש בהקפאה. השאריות נקלטות בנפח מדויק של מים, אשר מנותח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) עם מערך פוטודיודות (PDA) או גלאי אולטרה סגול (UV). זיהוי וכימות מושגים על ידי ביצוע השוואות של זמני השמירה וספקטרום ה-UV של תקני ייחוס מסחריים. הריכוזים מחושבים על סמך עקומת ייחוס סיניגרין וגורמי תגובה מבוססים היטב. היתרונות והחסרונות של שיטה פשוטה זו, בהשוואה לשיטות מהירות ומתקדמות יותר מבחינה טכנולוגית, נדונים כאן.

שיטה זו מאפשרת זיהוי והפרדה של desulfoglucosinolates נפוץ בכל הכיתות המבניות (איור 3). Progoitrin 2-hydroxyglucosinolate המזיק מגיע יחסית מוקדם הכרומתוגרמה מופרד בבירור מן glucoraphanin glucosinolate המועיל, את methylsulfinylglucosinolate רק מדגם זה. Sinigrin, gluconapin, ו glucobrassicanapin מהווים סדרה eluotropic של glucosinolates alkenyl עם הגדלת אורכי-שרשרת הצד (C3, C4, C5 ו, בהתאמה). סדרה הגיונית דומה גלויה לשני glucosinolates methylthioalkenyl, glucoiberverin (C3) ו glucoerucin (C4). הפסגות של שלושה glucosinolates אינדול, glucobrassicin ונגזרותיו 4-הידרוקסי ו 1-methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin), הם גם הפרדה ברורה. יצוין כי פסגות neoglucobrassicin ו glucoerucin, כמו גם gluconasturtiin, את גלוקו ארומטי רקsinolate במדגם זה, הם גבוהים במיוחד לחלץ Brassica זה נובע מהוספה של תמציות שורש לתערובת 9. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig3.jpg" /> איור 3: הכרומתוגרמה של תמצית glucosinolate. פרט (1-32 דקות) של chromatogram HPLC הנובעים ניתוח של דגימות שורש לירות בשילוב מ nigra Brassica, ב Rapa, ו- B. oleracea. תוויות השיא לציין את זמן שמירה ואת הקיצורים עבור desulfoglucosinolates המזוהה (GSL). progoitrin PRO = (2-OH-3-butenyl GSL); ראף = glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrin (2-propenyl GSL), GNA = gluconapin (3-butenyl GSL); 4OH = 4-hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-methylthiopropyl GSL); GBN = glucobrassicanapin (4-pentenyl GSL); ERU = glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL); GBC = glucobrassicin (indol-3-ylmethyl GSL); NAS = gluconasturtiin (2-phenylethyl GSL); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> Glucosinolates methylsulfinyl שרשרת ארוכים יותר, אשר מצויים לרוב צמח המודל ארבידופסיס, גם להראות סדרת eluotropic, כפי שניתן לראות תמצית שורש austriaca Rorippa. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8), ו glucoarabin (C9) להופיע במרווחי זמן קבועים על הכרומתוגרמה (איור 4). יחד עם ספקטרום UV של הפסגות, סדרה eluotropic הגיונית כאלה עשויות לשמש לסווג, ואת זמנים לזהות, glucosinolates הידוע. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig4.jpg" /> איור 4: chromatogram (מסגרת 9-30 דקות) של desulfoglucosinolates בתמצית austriaca שורש Rorippa. תוויות השיא לציין את זמן שמירה ואת הקיצורים עבור desulfoglucosinolates המזוהה (GSL). הס = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrassicin (indol-3-ylmethyl GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם נפוץ </td><td> מבנה שרשרת צד </td><td> RT (דקות) * </td><td> 229 ננומטר </td><td> התייחסות# </td></tr><tr><td> aliphatiglucosinolates ג </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucocapparin </td><td> מתיל </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> חום </td></tr><tr><td> Sinigrin </td><td> 2-propenyl </td><td> 5.5 </td><td> 1 </td><td> בראון, EC </td></tr><tr><td> Gluconapin </td><td> 3-butenyl </td><td> 9.5 </td><td> 1.11 </td><td> EC </td></tr><tr><td> Glucobrassicanapin </td><td> 4-pentenyl </td><td> 13.5 </td><td> 1.15 </td><td> EC </td></tr><tr><td> Glucoiberverin </td><td> 3-methylthiopropyl </td><td> 10.9 </td><td> 0.8 </td><td> חום </td></tr><tr><td> Glucoerucin </td><td> 4-methylthiobutyl </td><td> 14.0 </td><td> 0.9 </td><td> חום </td></tr><tr><td> Glucoiberin </td><td> 3-methylsulfinylpropyl </td><td> 3.7 </td><td> 1.2 </td><td> חום </td></tr><tr><td> Glucoraphanin </td><td> 4-methylsulfinylbutyl </td><td> 4.9 </td><td> 0.9 </td><td> חום </td></tr><tr><td> Glucoalyssin </td><td> 5-methylsulfinylpentyl </td><td> 7.6 </td><td> 0.9 </td><td> חום </td></tr><tr><td> Glucohesperin </td><td> 6-methylsulfinylhexyl </td><td> 10.5 </td><td> 1 </td><td> חום </td></tr><tr><td> Glucosiberin </td><td> 7-methylsulfinylheptyl </td><td> 13.5 </td><td> 1 </td><td> חום </td></tr><tr><td> Glucohirsutin </td><td> 8-methylsulfinyloctyl </td><td> 16.8 </td><td> 1.1 </td><td> חום </td></tr><tr><td> Glucoarabin </td><td> 9-methylsulfinylnonyl </td><td> 20.5 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> Glucocheirolin </td><td> 3-methylsulfonylpropyl </td><td> 4.2 </td><td> 0.9 </td><td> חום </td></tr><tr><td> Progoitrin </td><td> 2 (R) -OH-3-butenyl </td><td> 4.5 </td><td> 1.09 </td><td> בוכנר, EC </td></tr><tr><td> Gluconapoleiferin </td><td> 2-OH-5-pentenyl </td><td> 8.3 </td><td> 1 </td><td> EC </tד&gt; </tr><tr><td> glucosinolates אינדול </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4-hydroxyglucobrassicin </td><td> 4-hydroxyindol-3-ylmethyl </td><td> 11.2 </td><td> 0.28 </td><td> בוכנר, EC </td></tr><tr><td> Glucobrassicin </td><td> indol-3-ylmethyl </td><td> 15.3 </td><td> 0.29 </td><td> בוכנר, EC </td></tr><tr><td> 4-Methoxyglucobrassicin </td><td> 4-methoxyindol-3-ylmethyl </td><td> 18.2 </td><td> 0.25 </td><td> בוכנר, EC </td></tr><tr><td> Neoglucobrassicin </td><td> 1-methoxyindol-3-ylmethyl </td><td> 22.5 </td><td> 0.2 </td><td> בוכנר, EC </td></tr><tr><td> glucosinolates ארומטיים </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sinalbin </td><td> 4-hydroxybenzyl </td><td> 8.1 </td><td> 0.5 </td><td> בוכנר </td></tr><tr><td> Glucosibarin </td><td> 2 (R) -OH-2-phenylethyl </td><td> 12.1 </td><tד&gt; 0.95 </td><td> לראות הבא </td></tr><tr><td> Glucobarbarin </td><td> 2 (S) -OH-2-phenylethyl </td><td> 12.7 </td><td> 0.95 </td><td> בוכנר </td></tr><tr><td> Glucotropaeolin </td><td> בנזיל </td><td> 13.8 </td><td> 0.95 </td><td> בוכנר, EC </td></tr><tr><td> Gluconasturtiin </td><td> 2-phenylethyl </td><td> 18.0 </td><td> 0.95 </td><td> בוכנר, EC </td></tr><tr><td> לא ידוע - אליפטי / ארומטיים כמו UV ספקטרום </td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> EC </td></tr><tr><td> לא ידוע - אינדול כמו ספקטרום </td><td></td><td></td><td> 0.25 </td><td> EC </td></tr><tr><td colspan="5"> * זמן השמירה המשוער (RT) מעוגל 0.1 דק &#39;הקרוב (± 0.3 דקות תלוי טור, איכות eluent). פעמי שמירה נקבעות על פלטפורמות האולטימטיביות HPLC ThermoFisher / Dionex מצוידות עמודת 18 C (150 x 4.6 מ&quot;מ, 3 מיקרומטר גודל חלקיקים) בתוספת C 18 </sUB&gt; precolumn (10 x 4.6 מ&quot;מ, 5 מיקרומטר גודל החלקיקים) עם תוכנית שיפוע כמו בטבלה 1. </td></tr><tr><td colspan="5"> הפניות # לגורמי בתגובה: בוכנר, ר ב glucosinolates ב לפתית (ed JP Wathelet) 50-58 (מרטינוס Nijhoff Publishers, 1987); בראון, פ&quot;ד, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. &amp; גרשנזון, J. וריאציה של הצטברות glucosinolate בין איברים שונים שלבי ההתפתחות של thaliana ארבידופסיס. Phytochemistry. 62 (3), 471-481, doi: 10.1016 / S0031-9422 (02) 00,549-6, (2003); EC. זרעי שמנים - קביעת glucosinolates בעל ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית. כתב העת הרשמי של הקהילה האירופית. 170/28 L. בנספח VIII 03.07.27-34 (1990). </td></tr></tbody></table> טבלה 3: גורמי תגובה ביותר הנפוץ desulfo-glucosinolates ב תמציות צמחים פעמי השמירה המשוערות שלהם על C 18 עמודים. Eluents, gradient, טמפרטורת טור, ואת קצב זרימה כמו בטבלה 1.

כאן, אנו מתארים בפירוט רב פרוטוקול מבוסס וחזק למיצוי גלוקוזינולטים מחומרים צמחיים טחונים. לאחר טיפול בסולפטאז על העמודה של התמציות, הדסולפוגלוקוזינולטים נפלטים ומנותחים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה.

שיטה פשוטה עבור Glucosinolate הפקה וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לבצע ניתוח פשוט וישיר של גלוקוסינולאטים בצמחים ובדגימות ביולוגיות אחרות. שיטה זו למיצוי וניתוח של גלוקוסינולאטים יכולה לשמש למתן מענה לשאלות מפתח באקולוגיה של צמחים וחרקים, פתולוגיה של צמחים, Breeders של צמחים ומדעי המזון. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מתוקתקת היטב ויש לה יישום רחב למגוון רחב של דגימות ביולוגיות.למרות ששיטה זו משמשת בעיקר לכימות גלוקוסינולאטים בחומרים מהצומח, ניתן להחילה אותה גם על קרקעות או על מוצרי מזון מעובדים. ניתן לבצע הליך מיצוי זה כמעט בכל מעבדה, כיוון שנעשה בו שימוש בעיקר בציוד מעבדה סטנדרטי. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יבצעו את האנליזות והבדיקה בצורה טובה יותר לאחר שיקראו ויצפו בסרטון לפחות פעם אחת.כדי להתחיל בהליך, ערבבו 10 grams של ג'ל דקסטרין מצולב G-25 עם 125 milliliters של מים אולטרה-טהורים. אחסנו את התערובת בבקבוק סגור בטמפרטורה של 4 degrees Celsius. לאחר מכן, המיסו 10,000 units של ארילסולפטאז מסוג H-1 ב-30 milliliters של מים אולטרה-טהורים.הוסיפו לכך 30 milliliters של אתנול מוחלט וערבבו היטב את התערובת. סובבו את התערובת בצנטריפוגה במהירות של 2,650 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את הנוזל העליון (supernatant) יחד עם 90 milliliters של אתנול מוחלט לכלי בכר.ערבבו ושפכו למבובות צנטריפוגה חדשות. צנטריפוגו את התערובת ב-1,030 times G למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הנוזל העליון (supernatant).המסו ושלבו את הכדורים בסך של 25 מיליליטר מים אולטרה-טהורים. ערבבו את התערובת היטב באמצעות וורטקס ולאחר מכן העבירו את התערובת למבחנות של 1 מיליליטר. אחסנו את דגימות הסולפט בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת.בשלב הבא, שקלו כ-90 מיליגרם של סינוגרם ורשמו את המשקל בדיוק של 1 מיקרוגרם. לאחר מכן, המסו את הסינוגרם מונוהידראט ב-10 מיליליטר של מים אולטרא-טהורים. הכינו מתמיסת המקור של הסינוגרם חמש תמיסות ייחוס בריכוזים הנעים בין 50 ל-750 מיקרומולארי.שמור את תמיסות הייחוס באנבונות של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, עבור כל דגימה וייחוס, סמן אנבובת מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל במיקום המתאים במעמד האנבונות. נקב את מכסה כל אנבובת מיקרו-צנטריפוגה באמצעות מחט דיסקציה לצורך ייבוש בהקפאה מאוחר יותר.הנח את המבחנות המסומנות בתוך בלוק, באותו סידור ובאותם מרווחים של העמודות המסומנות. כדי להכין את עמודי פיפטות הזכוכית, השתמש במקל עץ או זכוכית כדי לדחוס בעדינות פיסת צמר זכוכית בגודל 1 סנטימטר על 1 סנטימטר לתוך הפיפטה. דחוס את צמר הזכוכית במעבר שבין גוף הפיפטה לבעלה.הניחו עמודת פיפטה בכל אחת מהמיקומים המסומנים על גבי המעמד. מקמו את המעמד מעל תבנית פסולת. גזרו את הקצה של טיפ פיפטה מפלסטיק בנפח 1 milliliter.נערה היטב את ג'ל הדקסטרין שהוכן. לאחר מכן, השתמשו בטיפ פפט רחב כדי להטעין 0.5 milliliters של ג'ל דקסטרין מוכן לכל עמודה. בדקו אם יש דליפה של ג'ל הדקסטרין מהעמודות והחליפו כל עמודה הדולפת.לאחר שכל העמודות הומאו בגל דקסטרין, שטפו כל עמודה עם 1 milliliter של מים אולטר-טהורים. שקלו בין 50 ל-100 milligrams של חומר צמחי גרוס דק Membranes, בתוך מבחנת תגובה של 2 milliliter עם מכסה בטיחות, ורשמו את המשקל בדיוק של 0.1 milligrams. הניחו שתי כדורי מתכת בקוטר 3 millimeter בכל מבחנה.הוסיפו לכל מבחנה 1 milliliter של 70% methanol במים ultrapure, וערבבו כל תערובת קצרה באמצעות vortex. סגרו את המבחנות עם מכסי בטיחות נוספים, והניחו אותן מיד בבנ मराठी מים בטמפרטורה של 90 עד 92 degrees Celsius. חממו את המבחנות עד שהדגימה מתחילה רתיחה.העבירו את המבחנות לאמבט אולטרסוני, וחממו את הדגימות באמצעות גלי קול למשך 15 דקות. במהלך הסוניקציה, התחילו להפשיר את דגימת הסולפיה ואת רפרנסי הסינוגרמה. לאחר הסוניקציה, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 2,700 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.העבירו את העל-נשיבים (supernatants) ואת רפרנסי הסינוגרמה (sinogram references) שהופשרו לעמודות המתאימות, תוך הקפדה שלא לשאוב חומר צמחי למטפטה. הוסיפו 1 מיליליטר של מתנול 70% לכל מבחנה. ערבבו את התערובות באמצעות וורטקס.חממו את התערובת באמצעות אולטרסאונד למשך 15 דקות. סבבו את המבחנות שוב בצנטריפוגה תחת אותם תנאים כפי שבוצע קודם לכן. העמיסו את העילאיים על העמודות המתאימות.הוסיפו שתי מנות של 1 milliliter של 70%methanol לכל עמודה, והמתינו עד שהעמודות יתייבשו בין מנה למנה. שטפו שאריות methanol מכל עמודה בעזרת 1 milliliter של ultrapure water. לאחר מכן, שטפו כל עמודה בשתי מנות של 1 milliliter של sodium acetate buffer בריכוז 20 millimolar, pH 5.5.לאחר שחלקיו האחרונים של בופר סודיום אצטט התנקזו למסננת הפסולת, הוצא את המסננת ממגש הפסולת ויבש את רגלי המסננת בעזרת נייר סופג. מקם את המסננת מעל הבלוק של מבחנות המיקרוצנטריפוגה המסומנות, כך שקצות העמודות נמצאים במבחנות המתאימות. טען 20 µL של תמיסת סולפייט לכל עמודה, תוך וידוא שהתמיסה מגיעה לפני השטח של חומר העמודה.שטפו את תמיסת הסולפטאז אל תוך חומר העמודה באמצעות 50 µL של חוצץ נתרן אצטט. חשוב מאוד שסולפטאז יישטף פנימה אל תוך העמודה. האנזים חייב להימצא על העמודה כדי להגיב עם הגלוקוסינולאטים השלמים הקשורים לעמודה.לאחר שפתרון הסולפט שוטף כל עמודה, כסו את העמודות בנייר אלומיניום. הניחו לעמודות לעמוד בן לילה. לאחר מכן, אלוטו את ה-de-sulfo-glucosinolates מכל עמודה באמצעות שתי מנות של 0.75 milliliter של מים ultrapure.לאחר שהעמודות התרוקנו, הוצא את מתקן העמודות וסגור כל מבחנה עם פקק. הקפא את המבחנות בחנקן נוזלי, או ב-80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. ייבש בתנאי ואקום (lyophilize) את הדגימות למשך 12 עד 24 שעות.המסו כל שארית ב-1 milliliter של מים אולטרה-טהורים. לאחר מכן, העבירו כל דגימה ודגימת ייחוס לבקבוקוני דגימה למכשור HPLC מסומנים. הפרידו את התמציות על עמודת reverse phase CAT.השתמש באורך גל גילוי של 229 nanometers. לאחר ההפרדה באמצעות HPLC, ניתן לזהות את הגלוקוסינולטים על ידי השוואת זמני השהייה וספקטרום UV מול סטנדרטים ידועים של גלוקוסינולטים. ריכוזי הגלוקוסינולטים בדגימה מחושבים על בסיס עקומת כיול סינוגרמה וערכי ספרות עבור מקדמי תגובה.מכאן ניתן לקבוע את ריכוזי הגלוקוסינולאט בדגימת הצמח המקורית. תחת תנאי ה-HPLC שבהם נעשה שימוש, הפרוגויטרין הבלתי בריא מופיע בשלב מוקדם למדי, והוא מופרד מהגלוקורפנין המועיל ביולוגית. גם האנדו-גלוקוסינולאטים מופרדים היטב.סדרות ליוטרופיות נצפות עם הגדלה של קישורי שרשראות הצד עבור alconol, methylfol-alconol, וג'לוקוסינולאטים בעלי שרשראות ארוכות יותר של methyl-solfinol. לפיכך, ניתן לסווג באופן ראשוני ג'לוקוסינולאטים שאינם ידועים על בסיס סדרות ליוטרופיות אלו בשילוב עם ספקטרום UV. בהכנה נכונה, אדם אחד יכול להפיק בין 150 ל-200 דגימות ביום עבודה אחד.ייקח יום נוסף כדי להתייחס לעמודות, להקפיא-ייבש את הדגימות ולהכין אותן ל-HPLC. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להחיל שיטות אחרות, כגון LCMS, כדי לזהות desulfo-glucosinolates לא ידועים בchromatogram שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לך הבנה טובה של אופן מיצוי ה-glucosinolates מהדגימות הביולוגיות שלך וניתוחן באמצעות HPLC.זכרו כי עבודה עם מתנול עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לבצעה תמיד תחת מנדף כימיים.

a-straightforward-method-for-glucosinolate-extraction-analysis-with

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

השיטה הפשוטה היא ובלבד מאפשר מיצוי ניתוח מהיר של הורמונים צמחיים מרובים דגימות רקמה קטנות. הליך משתמשת מיצוי שלב אדי כצעד טיהור חגיגית. דוגמאות מנותחות על ידי GC / MS עם יינון כימי שמייצר בעיקר (M 1) יונים +.

ניטור הורמונים צמחיים במהלך התגובות מתח

בסרטון זה, אנו מדגימים מיצוי מבוסס SPME של מטבוליטים מכליה מתורם שנקטף מראש. ניתן להשתמש במטבוליטים שחולצו לביצוע אנליזה מטבולית וליפידומית על מנת להעריך את איכות האיברים להשתלה.

דגימת מיקרו-מיצוי בשלב מוצק: טכניקה מבוססת בדיקה לחילוץ דגימות מרקמות השתל

פרוטוקול מיצוי מקיף של שומנים, מטבוליטים חלבונים מ רקמות ביולוגיות באמצעות מדגם אחד מוצג.

שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

נציג של מיצוי מוצק-פאזי נוח מצמידים כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) עם זיהוי אלקטרוכימי (ECD) נחישות סימולטני של נוירוטרנסמיטרים מונואמין שלוש ושתיים של מטבוליטים שלהם בשתן תינוקות. אנחנו גם לזהות את המטבוליט MHPG כמו סמן פוטנציאלי לאבחון מוקדם של נזק מוחי תינוקות.

שיטה נוחה עבור חילוץ וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה של נוירוטרנסמיטורים קטכולאמין מטבוליטים שלהם

פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

כאן אנו מתארים חילופי אניון חזקים כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים של [3H]-מיו-אינוזיטול תווית שתילים אשר היא שיטה רגישה מאוד כדי לזהות ולכומת פוליפוספטים אינוזיטול בצמחים.

מיצוי וכימות של פוליפוספטים לאנוזיטול מסיסים עם תיבול רדיו ממין צמחי שונים באמצעות SAX-HPLC

השיטה שפותחה של תיוג 13C6-Glucose בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציית מסה ברזולוציה גבוהה היא רב-תכליתית ומניחה את הבסיס למחקרים עתידיים על האיברים והמסלולים העיקריים המעורבים בסינתזה של מטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא, כמו גם ניצול מקיף של מטבוליטים שניוניים אלה.

13C6-תיוג גלוקוז הקשור LC-MS: זיהוי של איברים ראשוניים צמחיים בסינתזת מטבוליטים משנית

מחקר זה פיתח כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשילוב עם שיטת ספקטרומטריית מסה משולשת (HPLC-QQQ-MS) לזיהוי וכימות אלקלואידים של טרופן (היוסציאמין, אניסודמין, סקופולמין) ב-Anisodus tanguticus. השיטה הוכיחה את עצמה כמהירה, מדויקת ואמינה לניתוח מהיר של צמחי מרפא.

שיטת HPLC-QQQ-MS יעילה ומהירה לכימות אלקלואידים טרופאן בצמחי מרפא

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

דופן התא החיידקי מורכבת מפפטידוגליקן, רשת מקרומולקולרית של גדילי סוכר המוצלבים על ידי פפטידים. כרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים מספקת רזולוציה גבוהה ותפוקה לגילויים חדשניים של הרכב פפטידוגליקני. אנו מציגים הליך לבידוד קירות התא (sacculi) והכנתם לאחר מכן לניתוח באמצעות UPLC.

בידוד והכנת קירות תא חיידקי לניתוח קומפוזיציוני על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים

למדו שיטה פשוטה לחילוץ וניתוח גלוקוזינולטים מחומרי צמחים באמצעות HPLC. הפרוטוקול המאומת הזה מסייע לחוקרים באקולוגיה, פתולוגיית צמחים ומדעי המזון לכמת תרכובות הגנה בצמחים.

שיטה פשוטה עבור Glucosinolate הפקה וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC)

גלה סרטונים נוספים