באמצעות שיטת הר שלמה Immunohistochemical ללמוד את שימור של דרכי המרה סונקוס מורן
15 ביוני 2017
גישה הר שלמה אימונוהיסטוכימי, כדי לחזות ביטוי חלבון neurofilament במערכת מרה מרהיב סונקוס murinus. מוצג כאן. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לנתח את העצבון של כל האיברים הקרביים בס מורינוס או מינים אחרים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בצביעה אימונוהיסטוכימית שלמה להדמיה של התפלגות העצבים בדרכי המרה של Suncus murinus. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח את התפלגות העצבים של האיברים הקרביים של מינים רבים, במיוחד איברים לא סדירים או קטנים שקשה להעריך בשיטות סטנדרטיות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהפעולה פשוטה.
זה לא דורש הליכים מסובכים ויש לו אחוזי הצלחה גבוהים. ידגימו איתי את ההליך יידאן דאי, סטודנט לתואר שני, ושואנג-צ'ין יי, עמית מחקר, שניהם מהמעבדה שלי. התחל בשטיפת החיה עם PBS בודד ו-4% פרפורמלדהיד זלוף בארון אדים.
לאחר מכן הזריק שניים עד שלושה מיליליטר של לטקס ניאופרן לבן דרך צנתר הזלוף לתוך אבי העורקים הבטני כדי לסמן את כלי הדם. וכאשר כל הרקמות המעניינות סומנו, הוציאו את איברי הבטן ואת העצבים וכלי הדם הקשורים אליהם. לאחר מכן יש להזריק כ-0.1 מיליליטר של לטקס ניאופרן כחול לכיס המרה כדי לסמן את מערכת המרה ולאחר מכן לתקן את הרקמות ב-4% פרפורמלדהיד למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס לצביעה חיסונית שלמה.
למחרת בבוקר, העבירו את הדגימה לבקבוקון זכוכית לארבע שטיפות בטמפרטורת החדר של שעה במים מזוקקים על נום. לאחר הכביסה האחרונה, דגרו את הרקמות בחומצה אורתופריודית 1% שהוכנה טרייה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי למנוע תגובות פרוקסידאז מהותיות. לאחר מכן, שטפו את הדגימה במים מזוקקים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה בפפיון טרי של 0.004% למשך שעתיים באמבט מים בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה.
בתום הדגירה יש לשטוף את הדגימה במים מזוקקים למשך 50 עד 60 דקות. לאחר מכן אחסן את הרקמות ב-4% פרפורמלדהיד בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, שטפו את הדגימה במים מזוקקים כפי שהודגם זה עתה ואחריה דגירה נוספת של שעתיים בפפיון טרי.
שטפו את הדגימה למשך 50 עד 60 דקות נוספות במים מזוקקים, ולאחר מכן קיבוע למשך הלילה ב-4% פרפורמלדהיד. בבוקר השלישי, שטפו את הטישו ארבע פעמים במים מזוקקים, ולאחר מכן טבילה בשלוש דגירות סוכרוז עולות ברצף של 30 דקות. לאחר מכן הקפיאו את הדגימה במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות, ולאחר מכן הפשרה מלאה בטמפרטורת החדר.
לאחר מחזור ההקפאה-הפשרה השלישי, העבירו את הדגימה ל-2% Triton X-100 לדגירה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, העבירו את הדגימה למיכל של הנוגדן העיקרי המעניין לנדנוד עדין על הנוטרטור בארבע מעלות צלזיוס למשך שלושה עד שישה ימים בהתאם לגודל הדגימה. לאחר תקופת התיוג המתאימה, הסר את הנוגדן הראשוני הלא קשור בארבע שטיפות של שעה ב-PBS בטמפרטורת החדר וסמן את הדגימה בנוגדנים המשניים המתאימים למשך שלושה ימים עם נדנוד עדין בארבע מעלות צלזיוס.
בתום תקופת תיוג הנוגדנים המשנית, שטפו את הדגימה ארבע פעמים ב-PBS. לאחר מכן דגרו את הרקמות ב-10 מיקרוליטר של מי חמצן 30% ב-100 מיליליטר של תמיסת צביעה טרייה של 0.002% DAB בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 עד 72 שעות עם נדנוד עדין. כאשר הושגה עוצמת הצביעה האופטימלית, העבירו את הדגימה ל-0.04% נתרן אזיד ב-PBS כדי לעצור את תגובת הצביעה.
לאחר מכן טבלו בזהירות את הדגימה בצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטר המכילה PBS טרי וצלמו תמונות שלמות של הרקמות באמצעות מצלמה המותקנת על מיקרוסקופ סטריאו. בנוסף להדמיה של העצבוב של דרכי המרה החוץ-כבדיות, תיוג עם נוגדנים כנגד סיבי עצב חיוביים נוירופילמנט מאפשר גם זיהוי חד משמעי של צפיפות הריצה וההפצה של עצב הנרתיק לאורך הוושט ולתוך הקיבה. תיוג כלי הדם של כיס המרה בלטקס ניאופרן לבן חושף פיברוזיס עצבי דק בניגוד גבוה לרקמות הסובבות עם צפיפות עצבוב גבוהה יותר שנצפתה בצוואר כיס המרה מאשר בפונדוס.
בצינור המרה העליון מסומנים שני סוגים של צרורות עצבים, צרורות העצבים העדינים היוצרים רשת עצבים לא סדירה וצפופה ופועלים בדבק השוכנים על דרכי המרה ובתוכה והצרורות העצביים העבים יותר המופצים במקביל לפני השטח של דרכי המרה. תיוג צינור המרה המשותף עם לטקס ניאופרן כחול וכלי הדם עם לטקס ניאופרן לבן מאפשר הדמיה של סיבי העצב הדקים בקצה צינור המרה המשותף ואזור הפפילה התריסריון. לפני שתנסה הליך זה, הקפד לשחק את ציר הזמן של כל אחד מהניסויים מכיוון שהתהליך כולו דורש שבועיים-שלושה להשלמתו.
כדי למנוע פגיעה בדגימה בעת החלפת התמיסות, שפכו תמיד את התמיסות במקום להסיר את הדגימה בעזרת מלקחיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל ליישם טכניקה זו על תיוג של מגוון עצבים בתוך איברים קרביים שונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג גישה אימונוהיסטוכימית להרכבה מלאה להדמיית ביטוי חלבון נוירופילמנט במערכת המרה החוץ-כבדית של Suncus murinus. השיטה מאפשרת ניתוח של תפוצת עצבים באיברים פנימיים, במיוחד אלו שהם קטנים או לא סדירים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי העצב
- אימונוהיסטוכימיה
- ניתוח איברים פנימיים
רקע
- אימונוהיסטוכימיה להרכבה מלאה היא טכניקה המשמשת להדמיית תפוצת עצבים.
- Suncus murinus משמש כאורגניזם מודלי לחקר עצבוב של איברים פנימיים.
- שיטה זו מועדפת עבור איברים קטנים או לא סדירים שקשה להעריך אותם בטכניקות סטנדרטיות.
- הפרוטוקול הוא פשוט ויש לו שיעור הצלחה גבוה.
מטרת המחקר
- להדמיית תפוצת עצבים בתוך מערכת המרה של Suncus murinus.
- לספק שיטה אמינה לניתוח עצבוב בכמה איברים פנימיים.
- להדגים את הנוהל למטרות חינוכיות.
שיטות ששימשו
- שטיפת החיה עם PBS והחדרת 4% פרפורמלדהיד.
- צביעה אימונוהיסטוכימית להרכבה מלאה.
- הדמיית ביטוי חלבון נוירופילמנט.
- הדגמה על ידי סטודנטים לתארים מתקדמים וחוקרים.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של תפוצת עצבים במערכת המרה.
- הדגמה של יעילות השיטה עבור איברים קטנים ולא סדירים.
- שיעור הצלחה גבוה של טכניקת האימונוהיסטוכימיה להרכבה מלאה.
מסקנות
- השיטה של אימונוהיסטוכימיה להרכבה מלאה יעילה לניתוח תפוצת עצבים.
- ניתן ליישם את הטכניקה הזו על מינים שונים מעבר ל-Suncus murinus.
- הפרוטוקול הוא פשוט ונגיש לחוקרים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This whole-mount immunohistochemical method enables visualization of nerve distribution in visceral organs, supporting target validation in neurogastroenterology and autonomic nervous system research. By providing high-resolution mapping of innervation patterns in small or irregular organs, it aids mechanistic de-risking of therapeutic targets involved in biliary tract function. The approach offers predictive confidence for early discovery programs focused on neural modulation of visceral organ physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to vagal and visceral nerve function in biliary tract regulation.
- Operational Value: Provides a reliable method for functional target validation through direct visualization of neurofilament-positive nerve fiber distribution.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying neural pathway involvement in biliary tract homeostasis and disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline innervation maps in the biliary tract.
- Quantitative Output: Enables measurement of nerve fiber density and distribution patterns, supporting assay standardization and reproducibility.
- Platform Reuse: Adaptable to other neuronal antibodies, allowing scalable application across visceral organ systems after initial optimization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant system modeling by enabling consistent innervation analysis from discovery through preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by clarifying neural contributions to biliary tract function in preclinical models.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural innervation changes with functional readouts in translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for neuro-modulatory approaches to biliary and visceral organ disorders.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing nerve distribution in the biliary tract and associated organs like esophagus and stomach.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized tissue preparation and high-success-rate immunostaining, enabling reliable compound effect evaluation on neural structures.
- Analytics: Generates quantitative neuroanatomical data on nerve bundle density and distribution, aiding comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling consistent innervation assessment across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable histology platform for visceral organ innervation studies, adaptable to multiple species and neuronal markers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neural control of visceral organs.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through a straightforward protocol with high success rate, minimizing technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing clear neural anatomy data, reducing late-stage biological risk in neuro-visceral therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated innervation patterns in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, tissue dissection, and confocal or stereo microscopy for whole-mount imaging.
- Dependent on access to primary and secondary antibodies, enzymatic inactivation reagents, and DAB substrate for colorimetric detection.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, permeabilization (e.g., Triton X-100), and antibody incubation conditions across laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying to different visceral organs or species, particularly regarding antibody optimization and permeabilization times.
- Limited by the two- to three-week timeline per experiment, requiring planning for longitudinal studies.
