הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות תסיסנית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את האיברים הסטרואידוגניים ואת האיברים האינטראקטיביים שלהם בזחלים או בנקבות בוגרות של זבוב הפירות, Drosophila melanogaster. שיטה זו יכולה לסייע בהבנת הביוסינתזה של הורמון הסטרואידים של חרקים, ומנגנון הבקרה העצבי העומד בבסיס ההזדווגות והמטמורפוזה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהעצבוב של איברים סטרואידוגניים והחלק היחסי של האיברים האינטראקטיביים שלהם נשאר שלם.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהאיברים הסטרואידוגניים בזחלי זבובים הם זעירים ושקופים למדי. המעבדה שלי ואני שמחים לחלוק את פרוטוקולי הנתיחה שלנו. אז בואו נתחיל.

לאחר הכנת הזחלים, התחל את דיסקציית המסלול בצלחת של שלושה סנטימטרים מלאה ב-PBS, תחת מיקרוסקופ מנתח. ראשית, אחזו בוו הפה בעזרת מלקחיים. לאחר מכן, בעזרת מספריים זעירים, חתכו את הגוף בכשליש מהאורך מהקצה הקדמי.

לאחר מכן, החזיקו את האורך הקדמי עם זוג מלקחיים אחד והשתמשו בזוג שני כדי לדחוף בעדינות את קצה הראש לתוך הגוף, כדי להפוך בסופו של דבר את גוף הזחל מבפנים החוצה. הכינו עד 20 זחלים בצורה זו תוך 10 דקות, ולאחר מכן העבירו אותם לתמיסה מקבעת. לאחר 30 דקות יש לשטוף את התכשירים ולהמשיך בצביעה חיסונית.

כדי להתחיל, השאירו את הזחלים שקועים במים למשך כשעה, כדי לחנוק ובכך לשתק את הזחלים. לאחר מכן, הניחו צד גב של זחל כלפי מעלה בטיפת PBS על צלחת מצופה סיליקון. בצד הגבי יש את שני צינורות קנה הנשימה.

תחת מיקרוסקופ ניתוח, השתמש במלקחיים כדי להכניס סיכת חרקים לקצה הקדמי. לאחר מכן, מתחו את הגוף לצד האחורי והכניסו סיכה שנייה לקצה האחורי. לאחר מכן, בצע חתך קטן ליד הזנב בעזרת מספריים מיקרו

מהחתך, חותכים בזהירות את הקוטיקולה הגבית לאורך קו האמצע הגבי, לכיוון הראש, מבלי לפגוע באף אחת מהרקמות שמתחת לציפורן. לאחר ביצוע החתך, מתחו את קירות הגוף זה מזה, ואבטחו אותם בעזרת סיכות חרקים בפינות. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, הסירו את גוף השומן הקדמי ובלוטות הרוק, ובכך חשפו את קומפלקס בלוטת המוח-טבעת על פני השטח.

כעת, שאפו את ה-PBS, וטבלו את התכשיר בתמיסה מקבעת. לאחר 30 דקות, השתמש במלקחיים כדי להסיר את סיכות החרקים ולהעביר את התכשיר למיקרו-צינור מלא ב-0.3% PBT. לאחר מכן, המשך עם צביעה חיסונית.

לאחר צביעה חיסונית של הזחלים, השתמש בפיפט חד פעמי כדי להעביר את הדגימות לכלי מלא ב-0.3% PBT. תחת מיקרוסקופ ניתוח, אחזו בציפורן או בקרס הפה עם זוג מלקחיים אחד. לאחר מכן, השתמשו במחט בקוטר 27 המחוברת למזרק של מיליליטר אחד, כמו סכין, כדי להסיר את קומפלקס הדיסק של בלוטת המוח מהציפורן בגוף, על ידי חיתוך הקצה הקדמי של הוושט ודיסקי העין.

לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, הפרד בזהירות את הוושט והמעיים מקומפלקס דיסק העין של בלוטת המוח-טבעת. משוך את המעי החוצה לצד האחורי, מכיוון שהוושט עובר דרך המוח מעל חוט העצב הגחוני. לבסוף, כדי לבודד את קומפלקס בלוטת טבעת המוח, חתכו בזהירות את החיבורים בין דיסק המוח, דיסקי העיניים ודיסקי הרגליים, בעזרת סכין מחט.

זה די חיוני להשתמש במלקחיים עדינים עם קצוות חדים במהלך הדיסקציה. אני ממליץ בחום לחדד מלקחיים עם חתיכת אבן שחיקה כדי לחבר את הקצוות שלהם ללא רווחים. כדי להעביר את הדגימות, השתמש במיקרו פיפט עם קצה קדח רחב.

הפקידו את הדגימות במרכז שקופית הזכוכית. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי למקם את הדגימות על צידי הגחון שלהן, כך שניתן יהיה לדמות את בלוטת הטבעת, הממוקמת בצד הגבי של המוח. לאחר מכן, הטה את השקופית ונגב כמה שיותר מה-PBT העודף.

לאחר מכן, הניחו טיפה של מגיב הרכבה ליד הדגימות והשתמשו במלקחיים כדי להוריד לאט לאט החלקת כיסוי מעל המגיב ולאחר מכן מעל הדגימות. כדי לנתח את השחלה הבוגרת, יש להרדים זבובים בגז פחמן דו חמצני. לאחר מכן, ערפו את ראשיהם והעבירו את גופם לצלחת של שלושה סנטימטרים מלאה ב-PBS.

לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ מנתח, אחזו בצד הגבי של בית החזה בעזרת מלקחיים, ואחזו בקטע הבטן A-5 או A-6 עם זוג מלקחיים שני. לאחר מכן, קלף את ציפורן הבטן לכיוון הצד האחורי. לפני שתמשיך, נקה את הציפורן הדביקה מהמלקחיים.

לאחר מכן, צבטו ביצית ובודדו את השחלה. לאחר מכן מסרקים ומורחים את קצות השחלה בעזרת מלקחיים. לאחר המריחה, טבלו את השחלה בתמיסה מקבעת למשך 30 דקות, כדי להכין אותם לצביעה.

להכנת תכשיר השומר על העצבוב של השחלה, העבירו זבובים נקבות מורדמות לכלי מצופה סיליקון מלא ב- PBS. תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, החזיקו את החרטום וקילפו את ציפורן הראש כדי לחשוף את המוח. מהמוח, הסר את קנה הנשימה המחובר, והשאיר את המוח מחובר לחוט העצב הגחוני.

לאחר מכן, החזיקו את בית החזה בצד הגב, והסירו את הרגליים והכנפיים. לאחר מכן, קלף את הציפורן הגחונית של בית החזה, החל מבסיס כל רגל. לאחר חשיפת ה-VNC, הסר בזהירות רבה את שאריות הקוטיקולה הגבית והשרירים המחוברים ל-VNC, באמצעות מלקחיים.

אל תפגע בקשרים בין המוח ל-VNC. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, קלף את ציפורן הבטן כדי לחשוף את השחלות והאיברים האינטראקטיביים שלהן, הכוללים את האביזר, המעיים, הביצית, הרחם ובלוטת האביזר. לבסוף, הסר את כל הרקמות הנותרות, כולל קנה הנשימה וגוף השומן.

לאחר מכן, טבלו את הדגימות בתמיסה מקבעת למשך 30 דקות, כדי להכין אותן לצביעה חיסונית. לאחר צביעה חיסונית, העבירו את הדגימות לשקופית זכוכית עם 0.1% PBT באמצעות מיקרו פיפט. לאחר מכן, צפו בשקופית במיקרוסקופ, והפרידו את מיתרי השחלות זה מזה באמצעות מלקחיים.

אין לפגוע בקצות השחלות במהלך תהליך זה. הם מכילים את הגרמריה. כאשר מכינים את המוח לקומפלקס איברי הרבייה, הסירו את כל שאריות הקוטיקולה ופזרו את המבנים על המגלשה.

לאחר מכן, נגב את רוב עודפי ה-PBT, ולאחר מכן מרח טיפה של מגיב הרכבה על הדגימה. לאחר מכן, הנח לאט לאט פתק כיסוי על המגלשה באמצעות מלקחיים ואחסן את המגלשה בארבע מעלות צלזיוס בחושך. מאוחר יותר, התבונן בדגימות תחת המיקרוסקופ, והביא את האיברים הסטרואידוגניים לשדה הראייה.

לאחר תיקון התצוגה, העבר את מערכת ההדמיה למצב רכישת תמונה. במהלך שלבי הזחל, הבלוטה הפרוטורסית סומנה בנוגדנים נגד אנזימים אקדיסטרואידוגניים, כולל הנוגדן נגד התכריכים. כדי לדמיין את הקשר העצבי בין בלוטת המוח, נותח קומפלקס המוח-טבעת.

שיטת דיסקציה של פילה מציגה את מערכת העצבים הסטומטו-קיבה, שבה קבוצה של נוירונים סרוטונרגיים מקרינים לבלוטת הפרוטורציה, לפרובנטריקולוס ולשרירי הלוע. אצל נקבות בוגרות, אקדיסטרואידים בשחלות משפיעים על היבטים רבים של ביצים, כגון התפשטות GSC. ה- GSCs ממוקמים בגרמריום בקצה כל שחלה בשחלה.

בתוך הגרמריום, ה-GSCs סומנו באופן ספציפי באמצעות שני נוגדנים, 1B1 ו-DE-cadherin. כדי לדמיין את העצבוב של השחלה, נותחה השחלה, יחד עם המוח, VNC, המעיים, האביזר, הרחם והזרע. נוירונים הודגמו על ידי mCD8:GFP תחת שליטת מנהל ההתקן n-Synaptobrevin GAL4.

בנוסף, מבנה השרירים נצבע באמצעות פלואידין מצומד. למרות שדיסקציה של האיברים הסטרואידוגניים יכולה להרגיש קשה בהתחלה, השתמש בסרט זה כדי ללמוד את נקודת החיתוך של הרקמות כדי לבודד את האיבר ביתר קלות ללא פציעה. אנו מקווים שהפרוטוקול שלנו אינפורמטיבי, לא רק למתחילים, אלא גם לחוקרים מנוסים.

לאחר שליטה, תוכל ליישם הליך זה על המחקר שלך, ולצחצח כך שיתאים לצרכים שלך. אנו מקווים שפרוטוקול זה יעזור להבנה מקיפה של ביוסינתזה של הורמונים סטרואידים. פרוטוקולים מפורטים יותר צעד-אחר-צעד זמינים בכתב היד.

בבקשה תבדוק את זה.