הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות

המטרה הכללית של הליך זה היא לדמיין את האיברים הסטרואידוגניים ואת האיברים המקושרים אליהם בזחלים או בנקבות בוגרות של זבוב הפירות, Drosophila melanogaster. שיטה זו יכולה לסייע בהבנת הביוסינתזה של הורמוני סטרואידים בחרקים, ואת המנגנון הוויסותי העצבי העומד בבסיס ההזדווגות והגלגול. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהעיצוב העצבי של האיברים הסטרואידוגניים והחלק היחסי של האיברים המקושרים אליהם נשארים שלמים.

בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה כיוון שהאיברים הסטרואידוגניים בזבובים נמצאים בשלב הלרבה והם זעירים ושקופים למדי. אני והמעבדה שלי שמחים לשתף את פרוטוקולי הדיסקציה שלנו. אם כך, בואו נתחיל.

לאחר הכנת הזחלים, התחל בביצוע הניתוח בצלחת של שלושה סנטימטרים מלאה ב-PBS, תחת מיקרוסקופ סטריאו. ראשית, אחוז בקרס הפה באמצעות פינצטה. לאחר מכן, באמצעות מיקרו-מספריים, נתק את הגוף בערך בשליש מהאורך מהקצה הקדמי.

בשלב הבא, החזיקו את החלק הקדמי עם זוג פינצטות אחד והשתמשו בזוג שני כדי לדחוף בעדינות את קצה הראש אל תוך הגוף, כדי להפוך בסופו של דבר את גוף הלרבה. הכינו עד 20 לרוות באופן זה בתוך 10 דקות, ולאחר מכן העבירו אותן לתמיסת קיבוע. לאחר 30 דקות, שטפו את הדגימות והמשיכו לצביעה אימונוהיסטוכימית.

כדי להתחיל, השאירו את הזחלים טבולים במים למשך כשעה, כדי לגרום לחנק ובכך לנטרל את תנועת הזחלים. לאחר מכן, הניחו זחל כשהצד הגבי שלו פונה כלפי מעלה בטיפת PBS על צלחת מצופה סיליקון. בצד הגבי נמצאים שני צינורות הנשמה.

תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, השתמשו בפינצטה כדי להחדיר סיכה לחרקים לקצה הקדמי. לאחר מכן, מתחו את הגוף לצד האחורי והחדירו סיכה שנייה לקצה האחורי. לאחר מכן, בצעו חתך קטן ליד הזנב באמצעות מיקרו-מספריים.

מהחתך, גזרו בזהירות את הקוטיקולה הגבית לאורכה לאורך קו האמצע הגבי, לכיוון הראש, תוך הקפדה שלא לפגוע באף אחד מהרקמות מתחת לקוטיקולה. לאחר ביצוע החתך, מתחו את דפנות הגוף לצדדים וקבעו אותן בעזרת סיכות לחרקים בפינות. לאחר מכן, הסירו בעזרת פינצטה את גוף השומן הקדמי ואת בלוטות הרוק, ובכך חשפו את קומפלקס בלוטת טבעת המוח על פני השטח.

כעת, שאבו את ה-PBS, והטבילו את הדגימה בתמיסת קיבוע. לאחר 30 דקות, השתמשו בפינצטה כדי להסיר את סיכות החרקים והעבירו את הדגימה למיקרוטובה מלאה ב-0.3%PBT. לאחר מכן, המשיכו לצביעה אימונוהיסטוכימית.

לאחר צביעה אימונוהיסטוכימית של הזחלים, השתמשו בפיפט חד-פעמי כדי להעביר את הדגימות לצלחית מלאה ב-0.3%PBT. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, אחזו בקוטיקולה או בקוץ הפה בעזרת זוג פינצטות. לאחר מכן, השתמשו במחט 27 gauge המחוברת למזרק של one milliliter, בדומה לסכין, כדי להוציא את קומפלקס בלוטת טבעת המוח ודיסק העין מהקוטיקולה של הגוף, על ידי חיתוך הקצה הקדמי של הוושט ודיסקי העין.

בשלב הבא, השתמשו בפינצטה כדי להפריד בזהירות את הוושט ומערכת העיכול מקומפלקס המוח-בלוטת הטבעת-דיסקיות העיניים. משכו את מערכת העיכול לכיוון הצד האחורי, כיוון שהוושט עובר דרך המוח מעל חבל העצבים הבטני. לבסוף, כדי לבודד את קומפלקס המוח-בלוטת הטבעת, חתכו בזהירות את החיבורים בין דיסקיות המוח, דיסקיות העיניים ודיסקיות הרגליים, באמצעות סכין-מחט.

השימוש בפינצטה עדינה בעלת קצוות חדים הוא חיוני מאוד במהלך הדיסקציה. אני ממליץ בחום להשחיז את הפינצטה באמצעות אבן השחזה כדי להבטיח שהקצוות ייפגשו ללא מרווחים. להעברת הדגימות, השתמשו במיקרופיפטה עם טיפ רחב.

הניחו את הדגימות במרכז למסחרית הזכוכית. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי למקם את הדגימות על צדם הבטני, כך שניתן יהיה לצלם את בלוטת הטבעת (ring gland), הממוקמת בצד הגבי של המוח. לבסוף, הטו את הלמסחרית ונגבו כמה שיותר מעודפי ה-PBT.

לאחר מכן, הניחו טיפה של חומר קיבוע (mounting reagent) ליד הדגימות והשתמשו בפינצטה כדי להנמיך באיטיות זכוכית כיסוי על חומר הקיבוע, ולאחר מכן על הדגימות. כדי לבצע נתיחה של השחלה של נקבה בוגרת, הרדימו את הזבובים באמצעות גז פחמן דו-חמצני. לאחר מכן, חתכו את ראשיהם והעבירו את גופם לצלחת של שלושה סנטימטרים מלאה ב-PBS.

בשלב הבא, תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting microscope), אחזו בצדו הגבי של החזה בעזרת פינצטה, ואחזו במקטע בטני A-5 או A-6 באמצעות זוג פינצטות שני. לאחר מכן, קלפו את הקוטיקולה של הבטן לכיוון הצד האחורי. לפני ההמשך, נקו את הקוטיקולה הדביקה מהפינצטות.

בשלב הבא, צבטו צינור ביצים (ovaduct) ובדלו את השחלה. לאחר מכן, סרקו ופרסו את קצות השחלה באמצעות פינצטה. לאחר הפריסה, טבלו את השחלה בתמיסת קיבוע למשך 30 דקות, כדי להכינה לצביעה.

כדי להכין דגימה השומרת על העצבוב של השחלה, העבירו זבובים נקבות הרדומים לצלחת מצופה סיליקון ומלאה ב-PBS. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, החזיקו את החרטום וקלפו את קוטיקולת הראש כדי לחשוף את המוח. מהמוח, הסירו את הקנה (trachea) המחובר, והשאירו את המוח מחובר לחבל העצבים הגבי (ventral nerve cord).

לאחר מכן, החזקו את החזה מהצד הגבי (dorsal side), והסירו את הרגליים והכנפיים. בשלב הבא, קלפו את הקוטיקולה הבטנית (ventral cuticle) של החזה, החל מבסיסו של כל רגל. ברגע שחבל העצבים הוונטרלי (VNC) נחשף, הסירו בזהירות רבה באמצעות פינצטה את שאריות הקוטיקולה הגבית ואת השרירים המחוברים ל-VNC.

אין לפגוע בחיבורים שבין המוח ל-VNC. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, קלפו את הקוטיקולה של הבטן כדי לחשוף את השחלות ואת האיברים המקושרים אליהן, הכוללים את ה-prop, המעי, תעלת הביצית, הרחם ובלוטת העזר. לבסוף, הסירו רקמות ששאינן נחוצות, כולל הטרכיאה וגוף השומן.

לאחר מכן, טבלו את הדגימות בתמיסת קיבוע למשך 30 דקות, כדי להכינן לצביעה אימונוהיסטוכימית. לאחר הצביעה, העבירו את הדגימות ללשונית זכוכית עם 0.1%PBT באמצעות מיקרופיפט. לאחר מכן, בחנו את הלשונית תחת מיקרוסקופ, והפרידו את שרשראות ה-ovarioles זו מזו באמצעות פינצטה.

הקפידו לא לפגוע בקצות השחלאונים (ovarioles) במהלך תהליך זה, שכן הם מכילים את הגרמריום (germaria). בעת הכנת קומפלקס המוח ואיברי הרבייה, הסירו את שאריות הקוטיקולה ופרסו את המבנים על גבי הזכוכית.

בשלב הבא, נגבו את רוב עודפי ה-PBT, ולאחר מכן טפטפו טיפה אחת של ריאגנט קיבוע (mounting reagent) על הדגימה. לאחר מכן, הניחו באיטיות זכוכית כיסוי על השקופית בעזרת פינצטה ואחסנו את השקופית בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך. מאוחר יותר, בחנו את הדגימות תחת המיקרוסקופ והביאו את האיברים הסטרואידוגניים למרכז שדה הראייה.

ברגע שהמבט מקובע, העבירו את מערכת ההדמיה למצב רכישת תמונה. במהלך שלבי הזחלים, בלוטת הפרוטורקס (prothoracic gland) סומנה באמצעות נוגדנים נגד אנזימים אקדיסטרואידוגניים (ecdysteroidogenic enzymes), כולל הנוגדן anti-shroud. כדי להדמיות את הקשר העצבי בין בלוטת הפרוטורקס למוח, בוצע דיסקציה של קומפלקס המוח-בלוטת הטבעת (brain-ring gland complex).

שיטת נתיחת הפילה (filet dissection) מציגה את מערכת העצבים הסטומטוגסטרית, שבה קבוצה של נוירונים סרוטונינרגיים מקרינים לבלוטת הפרוטורקס (prothoracic gland), לקיבלה (proventriculus) ולשרירי הלוע. בנקבות בוגרות, אקדיסטרואיד שחלאי משפיע על היבטים רבים של האובוגנזה, כגון פרוליפרציה של GSC. ה-GSCs ממוקמים בגרמריום (germarium) בקצה של כל אווריולה בשחלה.

בתוך הגרמריום (germarium), תאי הגזע של השגרה (GSCs) סומנו באופן ספציפי באמצעות שני נוגדנים, 1B1 ו-DE-cadherin. כדי להדגים את העצבוב של השחלה, בוצע דיסקציה של השחלה, יחד עם המוח, ה-VNC, המעי, הפרופ (prop), הרחם והספרמטקה (spermatheca). נוירונים הודגמו באמצעות mCD8:GFP תחת שליטתו של הדרייבר n-Synaptobrevin GAL4.

בנוסף, מבנה השרירים נצבע באמצעות phalloidin מצומד. למרות שניתוח של האיברים הסטרואידוגניים עשוי להיראות קשה בתחילה, השתמשו בסרטון זה כדי ללמוד את נקודות החיתוך של הרקמות כדי לבודד את האיבר בקלות רבה יותר וללא פגיעה. אנו מקווים שהפרוטוקול שלנו יהיה אינפורמטיבי, לא רק עבור מתחילים, אלא גם עבור חוקרים מנוסים.

לאחר שתשלטו בשיטה, תוכלו ליישם הליך זה במחקריכם ולהתאימו אותו לצרכיכם. אנו מקווים שפרוטוקול זה יסייע להבנה מקיפה של הביוסינתזה של הורמונים סטרואידיים. פרוטוקולים מפורטים יותר שלב אחר שלב זמינים במאמר.

אנא בדקו זאת.