עיצוב, משטח טיפול, סלולרי ציפוי, וCulturing של רשתות עצבי מודולרי מורכב ממעגלי קשרים בין פונקציונלי
15 באפריל 2015
כתב יד זה מתאר פרוטוקול לגדול ברשתות מודולרי מבחנה המורכבת של מעגלים עצביים, מבחינה תפקודית בין מחוברים-מוגבלים במרחב. מסכת פולימרים משמשת לדפוס שכבת חלבון לקדם הידבקות סלולרית על מצע culturing. נוירונים מצופים לגדול באזורים מצופים יצירת קשרים ספונטניים ומציג פעילות אלקטרו.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לגדל רשתות מודולריות במבחנה המורכבות ממעגלים עצביים מוגבלים מרחבית, פונקציונליים ומחוברים זה לזה. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של שבלונות ה-PDMS לדפוס שכבת חלבון כדי לקדם הידבקות תאית על פני מצע התרבית. השלב השני הוא ניקוי מצעי התרבות.
במיוחד המשטחים של צלחות פטרי, החלקות כיסוי ומערכי אלקטרודות מרובות. לאחר מכן, שבלונות ה-PDMS מופקדות על מצע התרבות ונוצרות דפוסי שכבת החלבון הדביק הרצויים. השלב האחרון הוא ציפוי תאי הגליה העצביים.
בסופו של דבר, הקלטות מערך אלקטרודות מרובות והדמיית סידן משמשות להצגת הדינמיקה של רשתות העצבים המודולריות שהושגו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות פתוחות מרכזיות בתחום מדעי המוח, כגון חקירת הדינמיקה של תקשורת בין מכלולים עצביים, ותהיה תנאי ניסוי נגדיים. פולימתיל סואן או PDMS מיוצר על ידי ערבוב ראשון של חומר ריפוי חלק אחד עם 10 חלקים של חומר בסיס.
לאחר חמש דקות של ערבוב, העבירו את התערובת לתא ואקום למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, בדוק אם יש בועות והחזיר את התמיסה לתא למשך 15 דקות נוספות. לאחר מכן, הכינו רקיק על קודן הספין.
פתח את ידיות הגז לגז חנקן. שים רקיק על הספינר ואבטח אותו במקומו עם הוואקום. לאחר מכן יוצקים שכבה דקה של PDMS על הוופל.
סובב את הוופל עם PDMS למשך דקה ב-1000 סל"ד כדי ליצור ציפוי PDMS בעובי 100 מיקרון על הוופל. לאחר מכן מעבירים את הוופל לפלטה חמה בחום של 100 מעלות צלזיוס. תן לו לאפות שם 30 דקות.
לאחר שה-PDMS התקשה, השתמש בפיפטה כדי לשרטט את גבולות השבלונות עם יותר PDMS. לאחר מכן אופים את ה-PDMS שנוספו על הוופל. כמו קודם, כאשר גבולות ה-PDMS התקשו, חתכו את השבלונה לאורך הגבולות כדי להוציא את שבלונה הסיליקון מהפרוסה כדי להתחיל RIN.
כיסוי זכוכית בגודל 23 מילימטר מרובע מחליק עם מים מזוקקים, ואחריו 70% אתנול, ואז אצטון, ואז איזופרופנול ולבסוף מים מזוקקים. שוב, יבש את הריבועים מתחת לזרם גז חנקן. לאחר מכן, לחץ בעדינות על שבלונה PDMS אחת על כל החלקת כיסוי.
הכניסו את החלקות הכיסוי עם השבלונות לתא ואקום למשך 15 דקות. לאחר שאיבת האבק, זרוק מיליליטר PDL על השבלונות והחזיר את המכלולים לתא הוואקום למשך 20 דקות. חזור על מחזור הוואקום של 20 דקות פעם אחת, ולאחר מכן תן ל-PDL להתייבש למשך הלילה למחרת.
הכינו את צלחות הפטרי שיתמכו בתאי הרשת. ראשון. מכסים כלים בגודל 3.5 ס"מ במיליליטר PDL למשך שעתיים. בטמפרטורת החדר מאוחר יותר, הסר את ה- PDL מהצלחת על ידי שאיפה.
לאחר מכן שוטפים את הכלים במים מזוקקים ומשאירים אותם לייבוש. לאחר ייבוש התבשיל, הוסיפו לכלי כמות קטנה של שומן סיליקון בהתאם לארבע הפינות של החלקת הכיסוי. הנח את החלקות הכיסוי על הצלחת כשה-PDMS פונה כלפי מעלה ולחץ אותן בעדינות כלפי מטה כדי לוודא שהן מחוברות.
עכשיו פינצטה עדינה A-P-D-M-S מהמכסה מחליקה ומשאירה את תבנית ה-PDL. לבסוף יש לעקר את הכלים על ידי חשיפתם לקרינת UV למשך שבע דקות. ראשית, נקו את מערך האלקטרודות על ידי שטיפתו מתחת למי ברז ולאחר מכן הפכו אותו לסוניקציה בחומר ניקוי אנזימטי מרוכז.
חזור על שלבים אלה שלוש פעמים. לאחר מכן סוניקציה של ה-MEA במים מזוקקים טהורים שלוש פעמים ולאחר מכן מתחת למכסה המנוע. שטפו את המזרח התיכון במים מזוקקים לפני.
עיקור באור UV למשך 30 דקות. לאחר מכן, הכינו תחילה את הרשת התומכת. יוצקים PDMS לצלחת של 12 או 24 בארות.
לאחר שה-PDMS התקשה, הסר אותו בעזרת מחט. כעת חותכים חורים במרכז הדיסקים ליצירת טבעות, הפועלות כתמיכה בתבנית. כעת הניחו תומך תבנית במרכז ה-MEA וכסו את המשטח החשוף החיצוני של ה-MEA.
תן לזה להתיישב שעתיים בחדר. לאחר מכן שאפו את שטיפת ה-PDL, המשטח החשוף החיצוני של ה-MEA במים מזוקקים, והסר את תמיכת התבנית כך שניתן יהיה לאפשר ל-MEA להתייבש. כעת חבר שבלונה למניפולטור מיקרו מוכן תחת מיקרוסקופ הפוך.
בדוק ויישר את המבנה המעוצב כך שיתאים לאלקטרודות של ה-MEA. לאחר מכן השתמש במניפולטור המיקרו כדי להוריד את השבלונה למשטח MEA. לאחר החיבור, הרם את מניפולטור המיקרום ובמידת הצורך, השתמש בפינצטה כדי להפעיל כמות קטנה של לחץ כדי למנוע מה-PDMS להתנתק.
כעת העבירו את ה- MEA לתא הוואקום למשך 15 דקות. לאחר מכן מרחו טיפה של מיליליטר PDL על השבלונה והחזירו לתא הוואקום למשך שני מחזורים של 20 דקות. תן ל-PDL להתייבש למשך הלילה למחרת.
הסר את השבלונות P DM S מהמדידה באמצעות פינצטה. לבסוף, UV מעקר את המדדים למשך שבע דקות. לאחר מכן הם מוכנים לתאים בהכנת תאי תרבית ומכינים תרחיפים כמו בפרוטוקול הטקסט.
לאחר השעיית מספר התאים הנדרש, צלח אותם במרכז האזור המעוצב ב-MEA או בהחלקת הכיסוי. יש להעמיס MEA בנפחים של 100 מיקרוליטר ותלוש כיסוי. מכיל 1000 מיקרוליטר.
דגרו על תאי הצלחת למשך 40 דקות, ולאחר מכן הוסיפו מדיום ציפוי כדי לשמור על התאים כל ארבעה ימים. הוסף בחזרה מדיום גידול טרי משלים. לאחר היום השישי או השביעי, קשרים עצביים בין המודולים אמורים להתחיל להיווצר בנקודה זו.
מדללים את מדיום התרבות בחומר אנטי מיטוטי למניעת צמיחת יתר של גליה. לאחר ארבעה ימים במבחנה, ניתן לראות שתאי עצב המחוברים בתוך PD DL מקודדים כתמים של 600 מיקרון רבוע לאחר 14 יום. בתרבית, נוירון יצר קשר באופן ספונטני בתוך המודולים ובין המודולים היוצרים רשתות פונקציונליות פעילות.
מעגלים עצביים של 300 מיקרון רבוע נצפו על ידי גודל תכונת ה-PDMS תוך שמירה על אותו ריכוז ציפוי. הדמיית סידן בוצעה באמצעות מטרת מט"ח לפעילות רחבה ברשתות המתורבתות. בין המודולים הירוקים והוורודים נראה מספר גדול יותר של חיבורים בעוד שהמודולים הכחולים והאדומים פחות מחוברים למודולים האחרים.
עלילת רשימה של אירועי הסידן מוצגת לסרט שנרכש ב-30 הרץ עם תמונה של מיליון פיקסלים. המודולים הירוקים והוורודים היו מסונכרנים מאוד, בעוד שהמודולים הכחולים והאדומים היו פחותים. אז.רשת מודולרית קליפת המוח המורכבת משלושה מעגלים נפרדים תועדה ב-21 יום במבחנה.
באמצעות MEA נמצא כי מעגלים עצביים במרחק של כ-600 מיקרון זה מזה מחוברים זה לזה. הפעילות האלקטרופיזיולוגית שלהם שוחזרה. באמצעות אלגוריתם זיהוי ספייק תזמון מדויק, תרשים רשימה של חמש דקות של נתונים אלה נוצר עם נתוני אשכול מקודדים בצבע.
זה מספק השוואה של פעילות רשת שלמה ואשכול יחיד ונותן תובנה לגבי סנכרון בתוך אשכול. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין שבלונות PDM ולהשתמש בהן כדי לעצב את ההידבקות של תאים נוירוגליאליים המובילים להקמת רשת מודאלית פונקציונלית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מתאר פרוטוקול לגידול של רשתות מודולריות in vitro המורכבות ממעגלים עצביים המוגבלים מרחבית ומקושרים תפקודית. דבר זה מושג על ידי הכנת שבלונות PDMS כדי ליצור תבנית של שכבת חלבון המקדמת היצמדות תאית על מצע הגידול.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעיו של המוח
- ביולוגיה של התא
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- רשתות עצביות in vitro הן חיוניות לחקר קישוריות עצבית.
- הגבלה מרחבית של מעגלים עצביים יכולה לשפר את הקישוריות התפקודית.
- הדבקה תאית היא קריטית לצמיחה עצבית מוצלחת.
- שבלונות PDMS משמשות בדרך כלל ליצירת תבניות בתרביות תאים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ליצירת רשתות עצביות מודולריות in vitro.
- בדיקת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של רשתות אלו.
- ביסוס קשרים ספונטניים בין נוירונים שנשתלו.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת שבלונות PDMS לתבנית חלבונים.
- ניקוי מצעי תרבית כגון צלחיות פטרי וכיסויי זכוכית (cover slips).
- הנחת שבלונות PDMS על המצע ליצירת תבניות דבקיות.
- זריעה של תאי גליה עצביים על המצע המתובנית.
תוצאות עיקריות
- הקמה מוצלחת של מעגלים עצביים מוגבלים מרחבית.
- הדגמה של קשרים ספונטניים בין נוירונים.
- פעילות אלקטרופיזיולוגית שנצפתה ברשתות המטופחות.
- תיקוף של הפרוטוקול למחקרים עתידיים על קישוריות עצבית.
מסקנות
- הפרוטוקול יוצר באופן יעיל רשתות נוירונליות מודולריות in vitro.
- הגבלה מרחבית משפרת את הקישוריות התפקודית.
- ניתן להשתמש בשיטה זו למחקרים אלקטרופיזיולוגיים נוספים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
מתודולוגיה זו של רשת עצבית מודולרית in vitro מאפשרת בקרה מרחבית מדויקת של מקבצי נוירונים, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים (de-risking) בתהליכי תיקוף מטרות לגילוי תרופות במדעי המוח. באמצעות הקמת מעגלים המקושרים תפקודית עם מדדים כמותיים של רישום אלקטרופיזיולוגי והדמיית סידן, גישה זו מספקת ביטחון חיזוי בבדיקות של קישוריות עצבית. היא נותנת מענה לאתגר מרכזי בשלב הגילוי: מידול הדינמיקה של מעגלי המוח כדי להעריך את השפעת תרכובות על סנכרון ותקשורת רשתיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מודולציה של המרחק הבין-מדורי להסדרת הסנכרון הבין-מודולי.
- ערך תפעולי: מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך הערכת מעורבות המטרה (target engagement) באמצעות יצירה ספונטנית של מעגלים נוירונליים והקמה של רשת תפקודית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדידות כמותיות של משתנים תלויים באמצעות הקלטות של מערך אלקטרודות רב-נקודתי ודימוי סידן להערכת הדינמיקה של פעילות הרשת.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות תבנית PDMS הניתנת לשחזור והשקעת שכבת חלבון להבטחת היצמדות תאית עקבית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מציע התאמה של סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי מתאם בין צפיפות קישורים לבין הופעת סנכרון, מה שמאפשר קבלת החלטות על קידום מבוסס התאמה לסיכון.
- ערך תפעולי: מסייע בהמשכיות של מודלים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לתצפית על קשרי עצבים הנוצרים לאחר 6-7 ימים in vitro והתייצבות עד היום ה-14.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת היפותזות של דינמיקת תקשורת נוירונלית, כאשר התוצרים מנחים באופן ישיר זיהוי מובילים (leads) באמצעות פרופיל פעילות רשת.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בהבהרת מסלולים על ידי מתן אפשרות לחקירה מבוקרת של האופן שבו צפיפות החיבורים מווסתת סנכרון בין-מודולרי ברשתות מודולריות.
- סקר (Screening): מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של טיפול שטח והשתלה תאית המבטיחים היצמדות נוירונלית הדירה לאזורים בעלי תבנית PDL.
- אנליטיקה: מספקת זיהוי ספייקים אלקטרופיזיולוגיים ומדידות של תחילת אירועי סידן המאפשרות השוואה כמותית של סנכרון תוך-צבירי ובין-צבירי תחת תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לתיקוף פרה-קליני על ידי הדגמת היווצרות ספונטנית של רשת תפקודית המשקפת עקרונות של תקשורת מעגלית in vivo.
- שימוש חוזר ברמה ארגונית: מכוננת יכולת רב-פעמית ליצירת תבניות של רשתות נוירונליות על גבי מצעים שונים (لوחות כיסוי, MEAs) לתמיכה במערכי סקר חוזרים ובמחקרים לתיקוף מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות נוירונליות על ידי אספקת מערכת ניתנת לבקרה לבחינת האופן שבו טופולוגיה מבנית משפיעה על קישוריות תפקודית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות ציפוי PDL בסיוע ואקום ושלבי עיקור ב-UV, המבטיחים הכנה עקבית של פני השטח לאורך הניסויים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי מתן אפשרות לבדיקת תגובה למינון של תרכובות על סנכרון רשתות, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של פיתוח תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון על ידי כימות ספי סנכרון תלויי-קישור, המייעדים להפחתת סיכון מכניסטית של מטרות נוירונליות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור שבלונות מיקרופלואידיות, תרביות של תאי עצב וטכניקות של רישום אלקטרופיזיולוגי/אופטי.
- תלוי בגישה לציוד לציפוי ספין (spin coating), תאי ואקום, סטריליזטורים UV, מערכים רב-אלקטרודיים (multi electrode arrays) ומערכות לדימוי סידן.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תכנון השבלונה, פרוטוקולי ציפוי בחלבונים וצפיפויות זריעה כדי להבטיח הדירות בין מעבדות.
- כולל שיקולי התאמה עבור סוגי תאי עצב שונים או יחסי תרבית משותפת של תאי גליא כדי לשמור על יציבות הרשת ולמנוע צמיחת יתר.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך ביישור מדויק של השבלונה לאלקטרודות ה-MEA והתלות בגודל מאפייני ה-PDMS להגדרת ממדי המעגל (למשל, מודולים ריבועיים של 300 micron).
