עיצוב, משטח טיפול, סלולרי ציפוי, וCulturing של רשתות עצבי מודולרי מורכב ממעגלי קשרים בין פונקציונלי

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לגדול ברשתות מודולרי מבחנה המורכבת של מעגלים עצביים, מבחינה תפקודית בין מחוברים-מוגבלים במרחב. מסכת פולימרים משמשת לדפוס שכבת חלבון לקדם הידבקות סלולרית על מצע culturing. נוירונים מצופים לגדול באזורים מצופים יצירת קשרים ספונטניים ומציג פעילות אלקטרו.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגדל רשתות מודולריות במבחנה המורכבות ממעגלים עצביים מוגבלים מרחבית, פונקציונליים ומחוברים זה לזה. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של שבלונות ה-PDMS לדפוס שכבת חלבון כדי לקדם הידבקות תאית על פני מצע התרבית. השלב השני הוא ניקוי מצעי התרבות.

במיוחד המשטחים של צלחות פטרי, החלקות כיסוי ומערכי אלקטרודות מרובות. לאחר מכן, שבלונות ה-PDMS מופקדות על מצע התרבות ונוצרות דפוסי שכבת החלבון הדביק הרצויים. השלב האחרון הוא ציפוי תאי הגליה העצביים.

בסופו של דבר, הקלטות מערך אלקטרודות מרובות והדמיית סידן משמשות להצגת הדינמיקה של רשתות העצבים המודולריות שהושגו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות פתוחות מרכזיות בתחום מדעי המוח, כגון חקירת הדינמיקה של תקשורת בין מכלולים עצביים, ותהיה תנאי ניסוי נגדיים. פולימתיל סואן או PDMS מיוצר על ידי ערבוב ראשון של חומר ריפוי חלק אחד עם 10 חלקים של חומר בסיס.

לאחר חמש דקות של ערבוב, העבירו את התערובת לתא ואקום למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, בדוק אם יש בועות והחזיר את התמיסה לתא למשך 15 דקות נוספות. לאחר מכן, הכינו רקיק על קודן הספין.

פתח את ידיות הגז לגז חנקן. שים רקיק על הספינר ואבטח אותו במקומו עם הוואקום. לאחר מכן יוצקים שכבה דקה של PDMS על הוופל.

סובב את הוופל עם PDMS למשך דקה ב-1000 סל"ד כדי ליצור ציפוי PDMS בעובי 100 מיקרון על הוופל. לאחר מכן מעבירים את הוופל לפלטה חמה בחום של 100 מעלות צלזיוס. תן לו לאפות שם 30 דקות.

לאחר שה-PDMS התקשה, השתמש בפיפטה כדי לשרטט את גבולות השבלונות עם יותר PDMS. לאחר מכן אופים את ה-PDMS שנוספו על הוופל. כמו קודם, כאשר גבולות ה-PDMS התקשו, חתכו את השבלונה לאורך הגבולות כדי להוציא את שבלונה הסיליקון מהפרוסה כדי להתחיל RIN.

כיסוי זכוכית בגודל 23 מילימטר מרובע מחליק עם מים מזוקקים, ואחריו 70% אתנול, ואז אצטון, ואז איזופרופנול ולבסוף מים מזוקקים. שוב, יבש את הריבועים מתחת לזרם גז חנקן. לאחר מכן, לחץ בעדינות על שבלונה PDMS אחת על כל החלקת כיסוי.

הכניסו את החלקות הכיסוי עם השבלונות לתא ואקום למשך 15 דקות. לאחר שאיבת האבק, זרוק מיליליטר PDL על השבלונות והחזיר את המכלולים לתא הוואקום למשך 20 דקות. חזור על מחזור הוואקום של 20 דקות פעם אחת, ולאחר מכן תן ל-PDL להתייבש למשך הלילה למחרת.

הכינו את צלחות הפטרי שיתמכו בתאי הרשת. ראשון. מכסים כלים בגודל 3.5 ס"מ במיליליטר PDL למשך שעתיים. בטמפרטורת החדר מאוחר יותר, הסר את ה- PDL מהצלחת על ידי שאיפה.

לאחר מכן שוטפים את הכלים במים מזוקקים ומשאירים אותם לייבוש. לאחר ייבוש התבשיל, הוסיפו לכלי כמות קטנה של שומן סיליקון בהתאם לארבע הפינות של החלקת הכיסוי. הנח את החלקות הכיסוי על הצלחת כשה-PDMS פונה כלפי מעלה ולחץ אותן בעדינות כלפי מטה כדי לוודא שהן מחוברות.

עכשיו פינצטה עדינה A-P-D-M-S מהמכסה מחליקה ומשאירה את תבנית ה-PDL. לבסוף יש לעקר את הכלים על ידי חשיפתם לקרינת UV למשך שבע דקות. ראשית, נקו את מערך האלקטרודות על ידי שטיפתו מתחת למי ברז ולאחר מכן הפכו אותו לסוניקציה בחומר ניקוי אנזימטי מרוכז.

חזור על שלבים אלה שלוש פעמים. לאחר מכן סוניקציה של ה-MEA במים מזוקקים טהורים שלוש פעמים ולאחר מכן מתחת למכסה המנוע. שטפו את המזרח התיכון במים מזוקקים לפני.

עיקור באור UV למשך 30 דקות. לאחר מכן, הכינו תחילה את הרשת התומכת. יוצקים PDMS לצלחת של 12 או 24 בארות.

לאחר שה-PDMS התקשה, הסר אותו בעזרת מחט. כעת חותכים חורים במרכז הדיסקים ליצירת טבעות, הפועלות כתמיכה בתבנית. כעת הניחו תומך תבנית במרכז ה-MEA וכסו את המשטח החשוף החיצוני של ה-MEA.

תן לזה להתיישב שעתיים בחדר. לאחר מכן שאפו את שטיפת ה-PDL, המשטח החשוף החיצוני של ה-MEA במים מזוקקים, והסר את תמיכת התבנית כך שניתן יהיה לאפשר ל-MEA להתייבש. כעת חבר שבלונה למניפולטור מיקרו מוכן תחת מיקרוסקופ הפוך.

בדוק ויישר את המבנה המעוצב כך שיתאים לאלקטרודות של ה-MEA. לאחר מכן השתמש במניפולטור המיקרו כדי להוריד את השבלונה למשטח MEA. לאחר החיבור, הרם את מניפולטור המיקרום ובמידת הצורך, השתמש בפינצטה כדי להפעיל כמות קטנה של לחץ כדי למנוע מה-PDMS להתנתק.

כעת העבירו את ה- MEA לתא הוואקום למשך 15 דקות. לאחר מכן מרחו טיפה של מיליליטר PDL על השבלונה והחזירו לתא הוואקום למשך שני מחזורים של 20 דקות. תן ל-PDL להתייבש למשך הלילה למחרת.

הסר את השבלונות P DM S מהמדידה באמצעות פינצטה. לבסוף, UV מעקר את המדדים למשך שבע דקות. לאחר מכן הם מוכנים לתאים בהכנת תאי תרבית ומכינים תרחיפים כמו בפרוטוקול הטקסט.

לאחר השעיית מספר התאים הנדרש, צלח אותם במרכז האזור המעוצב ב-MEA או בהחלקת הכיסוי. יש להעמיס MEA בנפחים של 100 מיקרוליטר ותלוש כיסוי. מכיל 1000 מיקרוליטר.

דגרו על תאי הצלחת למשך 40 דקות, ולאחר מכן הוסיפו מדיום ציפוי כדי לשמור על התאים כל ארבעה ימים. הוסף בחזרה מדיום גידול טרי משלים. לאחר היום השישי או השביעי, קשרים עצביים בין המודולים אמורים להתחיל להיווצר בנקודה זו.

מדללים את מדיום התרבות בחומר אנטי מיטוטי למניעת צמיחת יתר של גליה. לאחר ארבעה ימים במבחנה, ניתן לראות שתאי עצב המחוברים בתוך PD DL מקודדים כתמים של 600 מיקרון רבוע לאחר 14 יום. בתרבית, נוירון יצר קשר באופן ספונטני בתוך המודולים ובין המודולים היוצרים רשתות פונקציונליות פעילות.

מעגלים עצביים של 300 מיקרון רבוע נצפו על ידי גודל תכונת ה-PDMS תוך שמירה על אותו ריכוז ציפוי. הדמיית סידן בוצעה באמצעות מטרת מט"ח לפעילות רחבה ברשתות המתורבתות. בין המודולים הירוקים והוורודים נראה מספר גדול יותר של חיבורים בעוד שהמודולים הכחולים והאדומים פחות מחוברים למודולים האחרים.

עלילת רשימה של אירועי הסידן מוצגת לסרט שנרכש ב-30 הרץ עם תמונה של מיליון פיקסלים. המודולים הירוקים והוורודים היו מסונכרנים מאוד, בעוד שהמודולים הכחולים והאדומים היו פחותים. אז.רשת מודולרית קליפת המוח המורכבת משלושה מעגלים נפרדים תועדה ב-21 יום במבחנה.

באמצעות MEA נמצא כי מעגלים עצביים במרחק של כ-600 מיקרון זה מזה מחוברים זה לזה. הפעילות האלקטרופיזיולוגית שלהם שוחזרה. באמצעות אלגוריתם זיהוי ספייק תזמון מדויק, תרשים רשימה של חמש דקות של נתונים אלה נוצר עם נתוני אשכול מקודדים בצבע.

זה מספק השוואה של פעילות רשת שלמה ואשכול יחיד ונותן תובנה לגבי סנכרון בתוך אשכול. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין שבלונות PDM ולהשתמש בהן כדי לעצב את ההידבקות של תאים נוירוגליאליים המובילים להקמת רשת מודאלית פונקציונלית.