LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בפרוטאומיקה של רובה ציד כדי לאפיין ולכמת תוצרי גלוטמין ואספרגין אנדוגניים בפרוטאומים מורכבים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביוכימיה, כגון ההשפעה של מעבדים ספונטניים ואנטימטיים על התוצר האיזומטרי גלוטאו של גלוטמין ואספרגימה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאיזומרים של גלוטמין מופרדים על עמוד נימי שינוי יוני באורך ארוך, מה שממקסם את היכולת להפריד פפטידים על ידי הנקודות האיזומטיות.

כדי להתחיל בבניית עמודים, יש להשעות 50 מיליגרם של חומר אריזה חלש להחלפת אניונים ב-3.5 מיליליטר של 90% איזופרופנול, במים. התאמה מאובטחת מנקבה לנקבה, מיקרופרל ואום נקבה בקצה אחד של צינור שיא באורך 50 סנטימטר בקוטר פנימי של 200 מיקרומטר. התקן מסך בגודל 1/16 אינץ 'עם נקבוביות מיקרומטר אחד בקצה הצינור בתוך המיקרופרל.

בעזרת משאבת לחץ המוגדרת ל-4, 500 psi, ארוז את חילופי האניונים לתוך הנימים עד שהחומר נראה בחלקו העליון. חבר אגוז נוסף מנקבה לנקבה, מיקרופרלי ונקבה לחלק העליון של הנימים הארוזים בקצה הנגדי כדי לסיים את הרכבת העמוד. שטפו 50 עד 100 מיליגרם טישו עם מי מלח עם פוספט למשך חמש דקות.

חזור על שטיפה זו פעמיים, ולאחר מכן הנח את הרקמה השטופה בצינורות עם מכסי בטיחות. הוסף לכל צינור שווה ערך למשקל אחד של חרוזי נירוסטה, ו-2.5 שווה ערך בנפח של תמיסה מימית של 100 מילי-מולרית של אמוניום אצטט עם 1% נתרן דאוקסיכולאט. הומוגניזציה של הרקמה בעוצמה מקסימלית למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, צנטריפוגה את ההומוגנאט למשך עשר דקות בחום של 10, 000 x g וארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינור של 1.5 מיליליטר. המשיכו להומוגניזציה וצנטריפוגה של גלולת הרקמה, תוך שילוב הסופרנטנטים בכל פעם עד שלא נצפתה גלולה.

כמת את ריכוז החלבון בסופרנטנטים המשולבים עם בדיקת חומצה ביסינצ'ונינית. לאחר מכן, הוסף להומוגנאט תמיסה מולרית אחת של דיתיותרייטול באמוניום אצטט של 100 מילי-מולרית כדי להשיג ריכוז דיתיותרייטול של עשרה מילי-מולרית בדגימה. דגרו את ההומוגנאט באמבט מים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שלושים דקות.

הוסף להומוגנאט תמיסה מולרית אחת של יודואצטמיד ב-100 מילי-מולרי אמוניום אצטט כדי להשיג ריכוז של 20 מילי-מולרי יודואצטמיד בדגימה. דגרו את ההומוגנאט בטמפרטורת החדר בהיעדר אור למשך 45 דקות. לאחר מכן יש לדלל את ההומוגנאט בשני נפחים שווי ערך של תמיסה של עשרה מילי-מולרית של דיתיותרייטול באמוניום אצטט של 100 מילי-מולרי.

דגרו על ההומוגנאט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הוסף להומוגנאט נפח מספיק של טריפסין שונה בדרגת ריצוף ב-100 מילי-מולרי אמוניום אצטט כדי להשיג יחס אנזים חלבון של 1 עד 50 לפי משקל בדגימה. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לעכל את ההומוגנאט.

להרוות את העיכול ב-0.5% ממשקל הדגימה של חומצה פורמית, ולזרז את מלחי הנתרן דאוקסיכולאט. מערבל בעדינות את הדגימות המכילות מלחי SDC ולאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות למשך עשר דקות בטמפרטורה של 12, 000 x גרם וארבע מעלות צלזיוס. שפכו את הסופרנטנט לתוך צינור חדש, והקפידו לא להפריע לכדור מלחי SDC.

ממיסים מחדש את המלחים בתמיסה מימית של 0.5% בנפח של אמוניום הידרוקסיד, מערבולת נמרצת. מצבו מחסנית סופגת C-18 בגרם אחד עם 5 מיליליטר אצטוניטריל, ואחריה חמישה מיליליטר של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית במים. לאחר מכן, טען את הדגימה המעוכלת על המחסנית.

שטפו את הדגימות שלוש עד חמש פעמים עם חמש מנות מיליליטר של 0.1% TFA. לאחר מכן יש לדלל את הפפטידים בחמישה מיליליטר של תמיסה מימית של 75% אצטוניטריל וחומצה פורמית 0.1%. יבש את הנוזל ברכז ואקום.

הוסף לשאריות 200 מיקרוליטר של 75% אצטוניטריל, עם 0.1% חומצה פורמית. מערבל את התערובת למשך עשר דקות לפחות, ולאחר מכן סוניזציה של התערובת למשך 30 דקות לפחות כדי להרכיב מחדש את הפפטידים היבשים. לדלל את הדגימה לפי הצורך, כך שהדגימה המוזרקת תכיל אחד עד שלושה מיקרוגרם חלבון.

חבר את עמוד הנימים LAX למכשיר כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה במיוחד. הכן תמיסות חומצה פורמית 0.1% במים ואצטוניטריל. הגדר את קצב הזרימה ל-0.4 מיקרוליטר לדקה, והגדר ריצת שיפוע של 1,200 דקות.

הגדר את אירועי סריקת ספקטרומטר המסה לרכישת נתונים חלופית, בין ספקטרומטריית מסה מלאה של טרנספורמציה פורייה לספקטרומטריית מסה טנדם של טרנספורמציה פורייה. בצע LERLIC MS/MS כדי להפריד ולאפיין את הפפטידים. השתמש בנתונים המתקבלים ובתוכנה פרוטאומית כדי לבצע חיפוש במסד נתונים של חלבונים.

ייצא את תוצאות החיפוש של מסד הנתונים לתוכנת גיליון אלקטרוני. זהה וחלץ את רשימת הפפטידים ללא עמיד ואת הפפטידים המתאימים שאינם מפורקים. חלץ את כרומטגרמות היונים של כל אחד מהפפטידים הללו עם חמישה חלקים למיליון של סובלנות מסה.

בדוק את כרומטגרמות היונים שחולצו לאשליית שיא כפולה מופרדת של מוצרים איזומריים. באמצעות LERLIC MS/MS, איזופורמים מפוזרים של גלוטמין ואספרגין הופרדו וזוהו מדגימת חלבון בשני זמני שמירה שונים. זוהו שאריות גלוטמין ביניים שעברו שינוי אנזימטי של טרנסאמידציה המציגות יחס גמא אלפא גלוטמיל הפוך.

ה-succinimide intermediate בשאריות אספרגין זוהה גם בשיטה זו. מכיוון שתנאי עיבוד הדגימה החומציים קלות מייצבים את הביניים succinimide. זה מצביע על כך שניתן ליישם את טכניקת LERLIC MS/MS למחקר רחב של פרוטאום של חומרי ביניים של succinimide.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בביוכימיה לאפיין את הפחתת החלבונים בהקשרים החל מארכיאולוגיה ועד למחקר ביו-רפואי.