ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

המטרה הכוללת של תוכנת ניתוח תמונה זו היא ניתוח מקביל של דינמיקת בליטה וריכוז חלבון יחסי לאורך כל הפילופוד. שיטה זו יכולה באמת לעזור לנו להבין שאלות מפתח בביולוגיה של התא, במיוחד החלבונים הבודדים המעורבים בהרחבה ונסיגה של פילופודיה. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שאלגוריתם מעקב הצורה האדפטיבי המסופק, מאפשר הערכה כמותית של דינמיקת בליטה ולוקליזציה של חלבון שנפתר מרחבית.

כדי להתחיל, תרבית נוירונים, תאי HeLa או COS, במדיום משלים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר שמגיעים למפגש של 40%, יש להעביר את התאים עם המבנים לבחירה, באמצעות מגיב טרנסבקציה לפי הוראות היצרן. שמור את התאים המועברים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 15 עד 18 שעות.

לאחר הדגירה, מלאו את תאי תרבית התאים עד 90% במדיום מחומם מראש של 37 מעלות צלזיוס, המכיל 20 מילי-HEPES מולארי, כדי להפחית שינויים ב-pH ובאוסמולריות עקב אידוי במהלך רכישת התמונה. כדי לאטום את המכסה, יש למרוח שכבה דקה של שומן ואקום בחלק הפנימי של המכסה וללחוץ עליו בעדינות על תא התרבות המכיל את התאים המועברים. אולי החלק החשוב ביותר לניתוח תמונה הוא איכות התמונה.

דבר אחד שעלינו לדאוג לו הוא יחס האות לרעש, שצריך להיות יותר מארבעה ואנחנו יכולים להבטיח שעל ידי התאמת זמן החשיפה של המצלמה ועוצמת הלייזר וכוח המעקב אחר קצב הפריימים צריך להיות יותר מהרץ אחד. רכוש את התמונות באמצעות מיקרוסקופ עם מטרה של 60x או 100x וללא כיפוף פיקסלים. השתמש בקצבי רכישה של לא פחות מהרץ אחד כדי לעקוב אחר דינמיקה פילופודית.

כדי למזער חפצים שאינם ממוקדים, תמונה פילופודית קרוב לקרום הבזיליקום. כדי להבטיח מעקב חלק, התאם את זמן החשיפה של המצלמה ואת עוצמת הלייזר כך שיחס האות לרעש יהיה גדול מארבע. לאחר השלמת הפעולה, התחל ברכישת התמונה.

לאחר עיבוד מקדים של תמונה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, טען את התמונות על ידי הורדת התיקיה הדחוסה המכילה את כל הקבצים הדרושים לניתוח תמונה. פתח והעתק קבצים לתיקיית העבודה. לאחר ההתקנה, הפעל את ממשק המשתמש הגרפי על ידי פתיחת הקובץ בשם, filopodiaAnalysisM3.fig.

טען את קבצי ה-TIFF השמורים של המחסנית עבור חלבונים בודדים בממשק המשתמש הגרפי או בממשק המשתמש הגרפי. באמצעות הכפתורים 1B עבור חלבון A, 1C עבור חלבון B ואופציונלי, 1D עבור חלבון C.צור תמונה מונחת של התא מתעלות החלבון על ידי לחיצה על 1A. לאחר מכן, לחץ על 2A, כדי להקצות את המסגרת הראשונה ולחץ על 2B, כדי להקצות את המסגרת האחרונה לניתוח.

לחלופין, חתוך את אזור העניין או החזר ההשקעה, המכיל את הפילופודיום המעניין באמצעות כפתור 2H. סובב את התמונה באמצעות כפתור 2I, או מחק אזורים לא רצויים באמצעות כלי הציור ביד חופשית, 2J. הזז את המחוון, 2C עבור כל פריים לבקרת איכות וכדי לבדוק אם הפילופודיום נשאר גלוי בבירור לאורך כל הסרט.

כדי ליצור את המעקב, ראשית, לחץ על כפתור 3A בחלון ה-GUI הראשון, כדי לפתוח את חלון ה-GUI השני. לחץ על כפתור הארבע בחלון השני של ממשק המשתמש הגרפי, כדי ליצור את המסה של גוף התא המונח על גבי חלון ממשק המשתמש הראשון, לאחר לחיצה על 1A. אנו ממליצים להקדיש זמן למיטוב פרמטרים כגון מספר המקטעים, רוחב הסריקה ורדיוס הסריקה עבור ערכת הנתונים הניסיוניים שלך.

הזז את המחוון בחלון מספר שתיים, כדי לבדוק היכן הקצה הפילופודי מופיע לראשונה. לאחר מכן, לחץ על כפתור חמש והסמן יופיע. השתמש בסמן כדי לבחור את הבסיס שממנו נמדד המרחק של קצה הפילופוד.

ואחריו קצה הפילופודיה במסגרת בה הוא מופיע לראשונה. לאחר מכן, בחר את אורך הסף שמעליו תתכופף הפילופודיה, באמצעות 6C. לאחר מכן, ציין את מספר הקטעים המשמשים לקירוב צורת הפילופודיה בתיבה 6A.

ציין את רוחב הסריקה, המשמש כסורק אופקי, כדי למקם את הצמתים ב- 6B. ציין את רדיוס הסריקה בתיבה 6D, השתמש בערך הגדול בכ- 50% מהזזת הקצה בין המסגרות שנצפתה. לאחר מכן, ציין את זווית הכיפוף בתיבה 6E.

סמן את מעקב ההיסטוריה של התיבה בחלון השני של ממשק המשתמש הגרפי, כדי לשמור את כל פרוטוקול המעקב לעיון עתידי ולאחר מכן לחץ על כפתור המעקב והניתוח כדי להתחיל במעקב. לניתוח זמני מרחבי, בחר את התיבה המיוצגת על ידי 8B, ואחריה ערוץ החלבון המעניין. לחץ על 8A, כדי להתחיל מעקב אחר חלבון לאורך הפילופוד, תוך שימוש בעקבות שנוצרו קודם לכן.

לניתוח חלבון רציומטרי, סמן את התיבה 9B או 9C ולחץ על הכפתור, 9A כדי לקבל את התרשים היחסי הזמני המרחבי. כדי לבצע את ניתוח הקצה הפילופודאלי, סמן את התיבה 8F וציין את אורך הקצה ואורך הסף מהבסיס, באמצעות 8G ו- 8H. לחץ על כפתור הלחיצה, כדי לשמור את הנתונים בקובץ אקסל בשם dynamics.xlsx.

לאחר מכן, לחץ על ניתוח עוצמות החלבון כדי ליצור עקבות של עוצמות החלבון של הקצה הפילופודי ולשמור לניתוח רציומטרי. לחץ על היחס הרצוי לניתוח, באמצעות 9D או 9E. לבסוף, לחץ על כפתור ההשוואה, 9A כדי ליצור את נתוני היחס.

הניתוח של תאי COS שהועברו עם סמן לאקטין חוטי באדום, והתייחסות ציטוזולית בירוק חושפים בליטות פילופודיות עשירות באקטין. סדרת זמן מראה בליטות פילופודיות עשירות באקטינים מתרחבות ונסוגות במהירות. באמצעות תוכנת ניתוח התמונה, אותרו הפילופודיות הבודדות.

תוכנת ניתוח תמונה עוקבת באופן אמין אחר הרחבה פילופודית, בנוסף לשיעורי הצמיחה והנסיגה של פילופודיה בודדת, כימיגרפים מתארים גם ריכוז של אקטין מנורמל להתייחסות הציטוזולית. אם משתמשים בה כראוי, טכניקה זו מאפשרת ניתוח כמותי של דינמיקת בליטה וריכוז חלבון שנפתר מרחבית לאורך הפילופודיה. כאשר מנסים את ההליך, חשוב לזכור את מהירות הרכישה ולשמור על יחס האות לרעש גדול מארבע, תוך לא להרוות תמונות בודדות.