Name: ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: למדו כיצד לנתח דינמיקת חלבונים בזיזי פילופודיה באמצעות תוכנת מעקב חצי-אוטומטית. השיטה מאפשרת כימות מקבילי של דינמיקת הזיזים וריכוז החלבון לאורך כל אורך הפילופודיה בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים במימון של DFG (EXC-1003 ל- MG).

1. תרבות התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות HeLa או תאים COS ב Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) המכיל 4.5 גרם / L גלוקוז D, L-alanine-L- גלוטמין dypptide, pyruvate, 10% בסרום שור עוברית, ו 10 יחידות / מ&quot;ל ​​של פניצילין / סטרפטומיצין. תרבות נוירונים בתרבות התקשורת ללא L- גלוטמין, חומצה גלוטמית או חומצה אספרטית, בתוספת 0.5 מ&quot;מ L-alanine-L- גלוטמין dipeptide, נטול תוסף נוירונים חינם ו -10 יחידות / מ&quot;ל ​​של פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 40% confluency הוא הגיע, transfect תאים עם בונה של בחירה באמצעות מגיב transfection לפי הוראות היצרן. שמור תאים transfected בחממה ב 37 ° C ו 5% CO 2 עבור 15-18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית את השינויים pH ו osmolarity (עקב אידוי) במהלך רכישת התמונה, למלא את תא התרבות תאים (לפני הדמיה) עד 90% עם 37 ° C מראש חימם בינוני המכיל 20 מ&quot;מ -4 (2-hydroxyethyl) -1 -Ppiperethethanesulfonic חומצה (HEPES). לאטוםהמכסה, להחיל שכבה דקה של שומן ואקום על החלק הפנימי של המכסה בעדינות לחץ על החדר התרבות המכיל את התאים transfected. </li></ol> 2. רכישת תמונה הערה: אורך filopodia משתנה מ 2-10 מיקרומטר 13 . Filopodia לגדול במהירות ממוצעת של 0.05-0.1 מיקרומטר / ים 13 , 14 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ עם מטרה 60X או 100X ולא binning פיקסל (כאן, מיקרוסקופ דיסק מסתובב confocal). השתמש בשיעורי רכישה גבוהים מ 1 הרץ (הרץ) כדי לעקוב אחר הדינמיקה filopodial. כדי למזער out-of- להתמקד חפצים, filopodia התמונה קרוב לממברנה הבסיסית ( כלומר משטח המצע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח מעקב חלקה, להתאים את זמן החשיפה של המצלמה ועוצמת לייזר כך יחס אות לרעש (SNR) גדול יותר מאשר 4. הימנע הרוויה של ערוצים בודדים ( כלומר פיקסל ערכים של255 עבור תמונות 8 סיביות ו 65,535 עבור 16 סיביות תמונות), כמו זה ימנע ניתוח התמונה הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע דימום, רק להשתמש בתגיות הקרינה תואם קווי לייזר מסננים של המיקרוסקופ (לפרטים ראה התייחסות 15 ). </li></ol> 3. עיבוד תמונה מראש הערה: השתמש בתוכנת ImageJ או בתוכנה זמינה אחרת כדי לעבד מראש תמונות 16 , 17 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המדגם נע, נכון להיסחף לרוחב באמצעות תוכנה זמינה ( למשל https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) לפני הניתוח. לא לכלול סרטים עם סחף צירית (כלומר תנועה בכיוון z). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקע נכון ( כלומר, ערכים אפורים של אזורים מחוץ לתא), הלבנה ( כלומר הפסד מתמשך אם עוצמת הקרינה עקב פגיעה בחלבונים הקרינה) ו-שוקת דימום אפשרי ( כלומר האות משפעת אחתאו בדיקה של שני ערוצים) באמצעות תוכנה זמינה ( למשל http://imagej.net/Category:Plugins ו 16 , 17 ). הערה: עוצמות הקרינה של ערוצים בודדים אינם משתנים על ידי התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח את ניתוח התמונה הבאים, לשמור סרטים המתאימים ערוצי חלבון מסוים בקנה מידה אפור כמו &quot;.tiff&quot; בפורמט קובץ מוערמים בתיקייה עבודה. הערה: המידות ( כלומר , גודל, אורך) של ערימות חייב להיות זהה עבור כל הערוצים. </li></ol> 4. ניתוח תמונה - שלב 1: טען תמונות הערה: התוכנה המתוארת כאן נכתבה ב- Matlab (המכונה תוכנת תכנות) ותפעל רק עם תוכנית זו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד את התיקיה zip המכיל את כל הקבצים הדרושים לניתוח תמונות מהאתר הבא: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwהם /. לפתוח ולהעתיק קבצים לתוך תיקיית העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתקנה, לפתוח את תוכנת התכנות ולהפעיל &#39;filopodiaAnalysisM3.fig&#39;. חלון GUI # 1 יפתח כפי שמוצג באיור 2 א . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הקבצים הנפתחים &quot;tiff&quot; המתאימים לחלבון מסוים של עניין בחלון GUI מס &#39;1 באמצעות הכפתורים &lt;1b&gt; לחלבון A, &lt;1c&gt; לחלבון B, &lt;1d&gt; לחלבון C. ראה איור 2 וטבלה 1 לפרטים. הערה: חלבון מוצג בחלון GUI # 1 משמש כערוץ הפניה לניתוח הסופי של הראיומטריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תמונה על גבי תא של חלבונים על ידי לחיצה על &lt;1a&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &lt;a&gt; כדי להקצות את המסגרת הראשונה ואת &lt;2b&gt; למסגרת האחרונה המשמשת לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לחתוך את האזור של ריבית (ההחזר על ההשקעה) המכיל את הפילופודיום של עניין באמצעות לחצן &lt;2h&gt;, לסובב את התמונה uלחצן &#39;שירה&#39; &lt;2i&gt; או מחק אזורים לא רצויים באמצעות כלי הציור החינמי &lt;2j&gt;. הערה: כדי לייעל את ניתוח התמונה, מומלץ לבודד את ההחזר על ההשקעה ( כלומר , לחתוך, לסובב, למחוק) יחד עם השלבים מראש אחרים (חיסור רקע, תיקונים אקונומיקה, וכו &#39;) באמצעות ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזיז את המחוון &lt;2c&gt; עבור כל מסגרת עבור בקרת איכות ולבדוק אם הפילופודיום נשאר גלוי בבירור לאורך כל הסרט. </li></ol> 5. ניתוח תמונה - שלב 2: יצירת מעקב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור &lt;3a&gt; בחלון GUI # 1 כדי לפתוח את חלון GUI # 2 (ראה איור 2 ב ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור &lt;4&gt; בחלון GUI # 2 כדי ליצור את המסכה של גוף התא על גבי (שנוצר בחלון GUI # 1 לאחר לחיצה על &lt;a&gt;&gt;). התוכנית גם יוצרת את הגבול של המסכה, שם הקמור גוף מיושם כדי לקבל את נקודות הקודקוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליCk כפתור &lt;5&gt;; יופיע סמן. השתמש הסמן כדי לבחור את הבסיס (שממנו משם המרחק של קצה פילופודיאלי נמדדת) ואחריו קצה filopodia במסגרת שבו הוא מופיע לראשונה. לשם כך, הזז את המחוון בחלון מס &#39;2). הערה: כדי למזער שגיאות בפלט הנתונים, הנח את נקודת הבסיס אנכית מתחת לעצה הגופנית לאורך הציר. מיצוב נקודת הבסיס במקומות אחרים ( כגון מעבר רוחבי) עשוי להציג הטיה כיוונית בערכי הקרינה בתוך גוף התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את אורך הסף (מעל אשר filopodia יהיה להתכופף) באמצעות &lt;6c&gt;. הערה: אורך זה מוגדר כמרחק בין נקודת הבסיס (נבחר באמצעות &lt;5&gt;) וגבול גוף התא ( כלומר האזור שממנו מתחיל הפילופודיה). המרחק נמדד בפיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את מספר המקטעים המשמשים כדי להשוות את הצורה של filopodia בתיבה &lt;6a&gt;. הערה:המספר המרבי של מקטעים תלוי באורך המקסימלי שמגיע על ידי פילופודיום, אבל גם איך פילופודיום מתכופף. אל תבחר מספר מקטעים גדולים ממספר הפיקסלים בין הבסיס לקצה ( כלומר , אורך הסף). בחירת פלחים נוספים מאורך הסף המוגדר בשלב 5.4. ( כלומר מספר פיקסלים בין הבסיס ואת קצה) תביא overestimation של אורך של פילופודיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את רוחב הסריקה, הפועל כסורק אופקי למיקום הצמתים, ב &lt;6b&gt;. הערה: צמתים אלה משמשים את התוכנית כדי להתאים את הקו שהצטרף הבסיס ואת קצה עם הגוף של פילופודיום ( כלומר כדי ליצור את עמוד השדרה). כנקודת התחלה, לשים ערך בפיקסלים שווה אורך המרבי מוכפל גורם <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/55653/55653eq1.jpg" /> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את רדיוס הסריקה (בפיקסלים) בתיבה &lt;6d&gt;. השתמש בערך שהוא כ 50% יותר מאשר obשימש בין העקירה עצה בין מסגרת. הערה: שימוש ברדיוס סריקה גדול מאוד עלול לתפוס נקודות גוף קמור לא רצויות במסגרות שבהן אין עצה פילופודיאלית אמיתית ( למשל, מחוץ לתנועת המטוס או ל- SNR נמוך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את זווית ההטיה בתיבה &lt;6e&gt;. הערה: סף הזווית נקבע על ידי הזווית המקסימלית של פילופודיום הוא כיפוף במהלך הניתוח כולו. הגדרת סף הזווית מסייעת התוכנה כדי למנוע מעקב של מבנים לא רצויים גדל בצד של filopodia כאשר filopodia מתכופף לעבר הגוף התא. התוכנית פועלת באופן אמין עבור filopodia עם זווית הטיה פחות מ 45 מעלות מן הציר האנכי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל במעקב, לחץ על הלחצן &#39;מעקב וניתוח&#39; בחלון GUI # 2. לחץ על התיבה &#39;היסטוריה עקבות&#39; בחלון GUI # 2 כדי לשמור את פרוטוקול המעקב כולו לעיון בעתיד. הערה: לאחר השלמת הליך המעקב, מאוחסן אורך הפילופודיום בכל מסגרתאת הסדין בשם &#39;length_vel&#39; של &#39;dynamics.xlsx&#39; עבור הפניות בעתיד. כמו כן, כל שאר פרמטרים המעקב מאוחסנים בגיליון בשם &quot;פרמטרים&quot; של &quot;dynamics.xlsx&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, אם filopodia אינו מזוהה באופן אוטומטי בכל המסגרות, בצע את השלבים הבאים כדי לתקן ידנית עבור זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקר את המסגרת המתאימה באמצעות המחוון בחלון מס &#39;2 ובחר ידנית את קצה הפילופודיום. הערה: מסגרות, כאשר נקודות גוף קמור לא מזוהים יוצגו על ידי אזור כחול בחלון המעקב של חלון GUI # 2. זה חובה לבדוק את &quot;ההיסטוריה עקבות&quot; כפתור לפני תוכנית המעקב היה ביוזמת גישה קואורדינטות קדוטיים באותה מסגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את נקודות ההתייחסות (בסיס ואחריו טיפ) באמצעות &lt;6f&gt; ב- GUI Window # 2. ציין את הפרמטרים האחרים כגון &#39;אורך הסריקה&#39;, &#39;מדידה מדויקת לאחר&#39; ו&#39;זווית כיפוף מרבית &#39;; עבור מסגרת כפי שמתואר צעדים 5.4-5.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלחצן &lt;6i&gt; כדי לשמור את הפרמטרים החדשים (ספציפיים למסגרת אחת). יש לחזור על השלבים עבור כל המסגרות המצוינות על ידי האזור הכחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום, אתחל מחדש את תהליך המעקב באמצעות &lt;7&gt;. הערה: תיקון זה יכול לשמש גם אם התוכנית פתאום עובר מ filopodial אחד למשנהו בתוך סרט. כחלופה, שקול חיתוך סרטים המכילים filopodia מרובים. </li></ol></li></ol> 6. ניתוח תמונה - שלב 3: ניתוח חלבון זמן ספטיו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניתוח ספציו-טמפורלי, בחר את התיבה המיוצגת על ידי &lt;8b&gt; ולאחר מכן את ערוץ החלבון המעניין (&lt;8c&gt; ו / או &lt;8d&gt; ו / או &lt;8e&gt;). הערה: חובה לבחור פרוטאין לפני ניתוח רטיומטרי (&lt;9a&gt;, &lt;9b&gt; ו / או &lt;9c&gt;) מאחר וחלבון A משמש כנקודת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &lt;8a&gt;כדי ליזום מעקב חלבון לאורך אורך filopodial באמצעות עקבות שנוצר בשלב 5.9. </li></ol> 7. ניתוח תמונה - שלב 4: יחס חלבון ניתוח מטרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את תיבת הסימון &lt;9b&gt; או &lt;9c&gt; ולחץ על הכפתור &lt;9a&gt; כדי לקבל את החלקה הרטיומטרית הזמנית-ספקטורלית. הערה: כדי למנוע מצג שווא של ריכוז חלבון יחסי, התמונה ratiometric אינו מזויפים כמו X / Y אבל כמו יומן (X / Y). לשימוש עתידי, העלילה ratiometric מיוצא קבצי &quot;. PNG&quot; ו &quot;.fig&quot; פורמט, ונתונים מגרש גולמי מאוחסן בתוך &quot;dynamics.xlsx&quot; הקובץ. </li></ol> 8. ניתוח תמונה - שלב 5: ניתוח עצה פילופודיאלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את תיבת הסימון &lt;8f&gt; וציין את אורך הטיפ ואת אורך הסף מהבסיס באמצעות &lt;8g&gt; ו- &lt;h&gt;. לחץ על הלחצן &lt;push&gt; כדי לשמור את הנתונים לקובץ &#39;dynamics.xlsx&#39;. לחץ על &lt;ניתוח חלבון אינטנסיבות&gt; כדי ליצור אתעקבות של עוצמות חלבון של קצה פילופודיאלי לשמור על ניתוח ratiometric. הערה: אורך העצה קובע את מספר הפיקסלים בקצה המשמש לניתוח. התוכנה תחזיר את הערך הממוצע בעוצמה של פיקסלים בקצה מעל כל מסגרת. אורך הסף קובע את המרחק המינימלי מהבסיס לקצה שמעליה מתחיל הפילופודיום (קצה פילופודיאלי) לגדול (וכאשר התוכנית מתחילה לעקוב אחר עוצמת העוצמה של הטיפ). אז אורך קצה צריך להיות קטן יותר מאשר אורך הסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על היחס הרצוי כדי לנתח באמצעות &lt;9d&gt; או &lt;9e&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור ההשוואה &lt;9a&gt; כדי ליצור את הנתונים ratiometric. </li></ol>

<ol><li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).</li>
<li>Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+in+dendritic+spines%3A+a+form+of+regulated+plasticity+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses.</a> Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).</li>
<li>Galic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+recruitment+of+the+curvature-sensitive+protein+ArhGAP44+to+nanoscale+membrane+deformations+limits+exploratory+filopodia+initiation+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons.</a> Elife. 3, e03116(2014).</li>
<li>Hotulainen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+mechanisms+of+actin+polymerization+and+depolymerization+during+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis.</a> J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).</li>
<li>Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+buckling+of+actin+inside+filopodia+generates+traction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Helical buckling of actin inside filopodia generates traction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+characterization+of+cell+shape+changes+during+amoeboid+motility+by+skeletonization%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization.</a> BMC Syst Biol. 4, 33(2010).</li>
<li>Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+shape+analysis+of+neuroanatomical+structures+based+on+medial+models%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Image+Anal%22%5BJournal%5D)">Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models.</a> Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).</li>
<li>Blum, H. A transformation for extracting new descriptors of shape. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+H+%22Models+for+the+Perception+of+Speech+and+Visual+Form%3A+Proceedings+of+a+Symposium%22">Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium</a>. Wathen-Dunn, W. , MIT Press. Cambridge, MA. 362-380 (1967).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Machacek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+Rho+GTPase+activities+during+cell+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion.</a> Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+filopodial+length+and+spatially+resolved+protein+concentration+via+adaptive+shape+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).</li>
<li>Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+growth+cone+filopodial+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of growth cone filopodial extension.</a> J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).</li>
<li>Mogilner, A., Rubinstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+filopodial+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The physics of filopodial protrusion.</a> Biophys J. 89 (2), 782-795 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="https://imagescience.org/meijering/publications/download/bio2004.pdf">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATtrack%3A+A+MATLAB-Based+Quantitative+Image+Analysis+Platform+for+Investigating+Real-Time+Photo-Converted+Fluorescent+Signals+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells.</a> PLoS One. 10 (10), e0140209(2015).</li>
<li>Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+3-kinase+A+associates+with+F-actin+and+dendritic+spines+via+its+N+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus.</a> J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).</li>
<li>Korobova, F., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+synaptic+actin+cytoskeleton+in+hippocampal+neurons+reveals+a+mechanism+of+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).</li>
<li>Cheadle, L., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+synaptogenic+protein+Farp1+links+postsynaptic+cytoskeletal+dynamics+and+transsynaptic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization.</a> J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).</li>
<li>Tarnok, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tool+for+the+quantitative+analysis+of+dendritic+filopodial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility.</a> Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).</li>
<li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-dynamics%3A+automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).</li>
<li>Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuronGrowth%2C+a+software+for+automatic+quantification+of+neurite+and+filopodial+dynamics+from+time-lapse+sequences+of+digital+images%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images.</a> Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).</li>
<li>Costantino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+quantification+of+filopodial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Semi-automated quantification of filopodial dynamics.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 165-173 (2008).</li>
<li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FiloDetect%3A+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Syst Biol. 7, 66(2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט למעקב דינמיקה הצמיחה filopodial וניתוח של ריכוזי חלבון יחסית מבנים דינמיים אלה באמצעות אלגוריתם קמור האל. באמצעות התוכנה, עד 3 ערוצים ניתן להשוות זוג חכם בריצה אחת, לפיה הריכוזים היחסיים של שני ערוצים ( כלומר חלבונים) נקבע במהלך מחזור הרחבה / השבת ומאוחסן קבצי תמונה ונתונים בתיקיות נפרדות. בנוסף לפעולות שגרתיות, התוכנה מספקת גם מספר פרמטרים שניתן לשנות כדי לייעל את הניתוח עבור הניסוי בהתאמה. תיאור מפורט של שינויים אלה, כמו גם פתרון בעיות ניתן...

שליטה ספציו-טמפורלית של חלבונים רגולטוריים אקטין קשורה דינמיקה פילופודיום 1 , 2 . מעקב ריכוז חלבונים בריכוז מרחבי לאורך כל אורך filopodial דרך הזמן ולכן חיוני כדי לקדם את הבנתנו את המנגנונים ביסוד היזום, הארכה, ייצוב או קריסה של מבנים דינמיים אלה 3 , 4 . שלא כמו ניתוח חלבון cytosol, שבו שינויים רבים צורה התא מתרחשים בקנה מידה גדול יותר, filopodia הם מבנים דינמיים מיקרו אשר כל הזמן אבזם 5 וכופף, ובכך מונע ניתוח באמצעות גישה פשוטה כגון קו סריקה. פתרונות תוכנה שונים למעקב אחר הצורה filopodial זמינים 6 , 7 , 8 , 9 . כמו כןIse, תוכנה למעקב ratiometric של הדינמיקה חלבון בתוך הגוף התא פותחה 10 , 11 . כדי לשלב מעקב אוטומטי של הצורה filopodial וניתוח חלבון זמן ספטיו, פיתחנו לאחרונה ניתוח תמונה תוכנה המבוססת על קמור גוף האלגוריתם 12 . שיטת ניתוח חדשנית זו, המופעלת באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI), משלבת לראשונה את ריכוז החלבון היחסי לאורך אורך הגדילה ומהירות הגדילה, ומאפשרת מדידה מדויקת של התפלגות חלבונים מזמניים-טמפורליים ללא תלות בתנועה של אלה מבנים דינמיים 12 . הרעיון מאחורי התוכנה (קוד המקור זמין באופן חופשי, ראה להלן) היא כי אחד הקודקודים של גוף קמור יעלה בקנה אחד עם קצה של פילופודיום ( איור 1 א ). על ידי הסתכלות על מסגרת הבאהR את הקודקוד הקרוב ביותר של גוף קמור, עצה מרגש ניתן לעקוב לאורך כל הסרט. לאחר קצה מזוהה בכל מסגרת, המיקום שלה משמש לצייר ציר על ידי הצטרפות קצה עם נקודת התייחסות בבסיס של פילופודיום ( איור 1 ב ). לבסוף, תוך שימוש בנקודות ראשיות שווה, שתפקידן נקבע על ידי הפיקסל החציוני בעוצמה מקסימלית לאורך הקו האורתוגונלי לציר, משמשות לקביעת עמוד שדרה העוקב אחר הצורה הפילופודיאלית. ניצול של עמוד שדרה זה מסתגל, kymograph מופק כדי לעקוב אחר הצמיחה filopodial ריכוז חלבון עד שלושה ערוצים לאורך אורך filopodial ( איור 1C ). <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> איור 1: עקרון העבודה של תוכנת ניתוח תמונה. ( א ) האלגוריתם שמאחוריהתוכנה. ב Step1 המשתמש מציין את הפניה (בסיס) ואת קודקוד (קצה) של פילופודיום. בשלב 2-1 את עמוד השדרה של פילופודיום מתקבל באמצעות פיקסל חציון עם ערך אינטנסיביות מקסימלית. בשלב 3 את עמוד השדרה משמש פרופיל חלבון מרחבי פרופיל. בשלב 2-2 התוכנה עוקבת באופן אוטומטי את קצה במסגרת הבאה. כל התהליך חוזר. ( ב ) תצלום של אלגוריתם עם פילופודיום אמיתי מציגה אלמנטים חשובים כגון גוף קמורה כי הוא משמש למעקב. ( ג ) סקירה של פרמטרים שניתן למדוד עם האלגוריתם. נתון זה שונה מהתייחסות 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> תוכנת ניתוח התמונה מופעלת ב Matlab (המכונה תוכנה תכנות) באמצעות שימוש גרפיממשק. כדי למקסם את הגמישות והחוסן להגדרה הניסויית, המשתמש יכול להתאים סדרה של פרמטרים למעקב ( למשל זווית כיפוף מותרת ותנועה בין-מסגרתית) וכן לבצע כמה תיקונים לסרטים ( למשל חיתוך, סיבוב, הסרת אובייקטים לא רצויים) ( איור 2 א וטבלה 1) . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> GUI </td><td> לא. </td><td> חובה </td><td colspan="5"> תאור </td><td> שם (ב- GUI) </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1 א </td><td> Y </td><td colspan="5"> טעינת קובץ .tiff מוערמים המייצגים את גוף התא (עם תיבת מסומנת) או ליצור גוף תא superimposed מערוצים </td><td> סלבודי </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1b </td><td> Y </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt; טוען קובץ תמונה מוערם המתאים לחלבון 1 </td><td> חלבון 1 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1 ג </td><td> Y </td><td colspan="5"> טעינת קובץ תמונה מוערם המתאים לחלבון 2 </td><td> חלבון 2 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1 ד </td><td> Y </td><td colspan="5"> טעינת קובץ תמונה מוערם המתאים לחלבון 3 </td><td> חלבון 3 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1e </td><td> N </td><td colspan="5"> איפוס הכל לטעינת קובצי תמונות מוערמים מראש </td><td> אִתחוּל </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 א </td><td> Y </td><td colspan="5"> גלילה בר כדי לקבוע את המסגרת הראשונית לניתוח בחלון GUI # 2 </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 ב </td><td> Y </td><td colspan="5"> גלילה בר כדי לקבוע את המסגרת הסופית לניתוח בחלון GUI # 2 </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 ג </td><td> Y </td><td colspan="5"> סרגל גלילה המייצגמסגרת nt </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 ד </td><td> N </td><td colspan="5"> הערך האפור של הפיקסלים שמתחתיו כל הפיקסלים יוגדרו לאפס </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2e </td><td> N </td><td colspan="5"> הערך האפור של הפיקסלים שמעליהם כל הפיקסלים יוגדרו לערכים מקסימליים </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 ו </td><td> N </td><td colspan="5"> הגדר את ערכי העוצמה של הפיקסלים שצוינו על ידי &lt;2e&gt; &lt;2f&gt; </td><td> מַעֲרֶכֶת </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 גרם </td><td> N </td><td colspan="5"> הפעל את הסרט מותאם-עוצמה </td><td> לְשַׂחֵק </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2h </td><td> N </td><td colspan="5"> חתוך תמונה </td><td> יְבוּל </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2i </td><td> N </td><td colspan="5"> סובב תמונה </td><td> לְסוֹבֵב </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2 </td><td> N </td><td colspan="5">מחק אזורים בכל הערימה </td><td> מחק אזורים </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3 א </td><td> Y </td><td colspan="5"> לחץ כדי לפתוח את &#39;חלון ניתוח&#39; (חלון GUI # 2) </td><td> חלון מעקב </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3 ב </td><td> Y </td><td colspan="5"> הזן את הגודל של פיקסל במיקרונים </td><td> הזן גודל פיקסל </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 4 </td><td> Y </td><td colspan="5"> לחץ כדי ליצור את התמונה גבול / קצה של גוף התא על גבי </td><td> גְבוּל </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 5 </td><td> Y </td><td colspan="5"> לחץ כדי לבחור את הבסיס ואת קצה filopodia </td><td> הפניה </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 א </td><td> Y </td><td colspan="5"> הזן את מספר הפלחים או הצמתים </td><td> לא של מקטעים </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 ב </td><td> Y </td><td colspan="5"> הזן את אורך הסריקה (בניצב לציר) </td><td> רוחב סריקה </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 ג </td><td> Y </td><td colspan="5"> הזן את אורך מעל אשר filopodia מתחיל כיפוף </td><td> דקות מדויקות לאחר </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 ד </td><td> Y </td><td colspan="5"> הזן את הרדיוס של מעגל איתור קצה (כלומר אזור שבו קודקוד יכול להיות מקומי במסגרת הבאה) </td><td> רדיוס של איתור קצה </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6e </td><td> Y </td><td colspan="5"> הזן את הזווית המקסימלית פילופודיום יכול לכופף מן הציר האנכי </td><td> זווית סף </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6F </td><td> N </td><td colspan="5"> הוסף נקודות התייחסות לבסיס ולעצה עבור מסגרת ספציפית זו </td><td> בחר התייחסות </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 גרם </td><td> N </td><td colspan="5"> הזן את אורך מעל אשר filopodia מתחיל כיפוף עבור מסגרת מסוימת </td><td> דקות מדויקות לאחר </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;Td&gt; 6h </td><td> N </td><td colspan="5"> הזן את הרדיוס של מעגל האיתור עבור המסגרת הספציפית הזו </td><td> רדיוס של איתור קצה </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6i </td><td> N </td><td colspan="5"> לאחר הזנת כל הפרמטרים עבור המסגרת הספציפית לחץ כדי לאחסן את הערכים לזיכרון ולקובץ לעיון נוסף </td><td> לְהוֹסִיף </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 </td><td> N </td><td colspan="5"> לחץ כדי למחוק את הפרמטרים באופן ידני עבור אותה מסגרת </td><td> לִמְחוֹק </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6k </td><td> N </td><td colspan="5"> לחץ כדי למחוק את כל הפרמטרים המאוחסנים ידנית באמצעות &#39;לוח תכונות אופציונלי&#39; עבור כל המסגרות </td><td> אִתחוּל </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6l </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק לפני המעקב כדי לאחסן את כל תוצאות המעקב בזיכרון לצורך הפניה בעתיד </td><td> היסטוריה עקבות </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 7 </td><td> Y </td><td colspan="5"> לחץ כדי להתחיל במעקב </td><td> לעקוב ולנתח </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8 א </td><td> N </td><td colspan="5"> לחץ כדי להתחיל מעקב אחר עוצמת ערוץ חלבון </td><td> ניתוח חלבון אינטנסיבות </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8 ב </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק כדי לעקוב אחר עוצמת ערוץ חלבון לאורך אורך filopodial </td><td> פילופודיה שלמה </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8 ג </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק עבור מעקב אחר חלבון התייחסות או חלבון A </td><td> פרוטאין </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8 ד </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק את המעקב אחר החלבון B </td><td> פרוטיין </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8e </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק את המעקב אחר החלבון C </td><td> ProteinC </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8F </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק כדי לעקוב אחר עוצמת החלבון הממוצע ב thעצה </td><td> קצה מוביל </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8g </td><td> N </td><td colspan="5"> הזן את אורך הקצה </td><td> אורך עצה </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8h </td><td> N </td><td colspan="5"> הזן את המרחק המינימלי מבסיס שמעליה מתחיל הקצה להיווצר </td><td> סף </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8i </td><td> N </td><td colspan="5"> לחץ כדי לשמור את התוצאות המוביל ניתוח קצה לקובץ </td><td> לחץ על הכפתור </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9 א </td><td> N </td><td colspan="5"> לחץ כדי להתחיל ניתוח חלבון ratiometric </td><td> לְהַשְׁווֹת </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9b </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק כדי להשוות בין חלבון B לגבי A </td><td> Log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9 ג </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק כדי להשוות חלבון C ביחס A </td><td> Log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;Td&gt; 9d </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק כדי להשוות חלבון B ביחס A בקצה </td><td> Log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9e </td><td> N </td><td colspan="5"> בדוק כדי להשוות חלבון C ביחס A בקצה </td><td> Log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10 א </td><td> N </td><td colspan="5"> בחר מפת צבע אחרת (ברירת מחדל: Jetplot) </td><td> מפת צבע </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10 ב </td><td> N </td><td colspan="5"> ערוך את colormap </td><td> עריכת colormap </td></tr></tbody></table> טבלה 1: סקירה כללית של כל הפונקציות המופיעות ב- GUI Windows # 1 ו- # 2. ברגע שזה נעשה, התוכנית יוצרת גוף קמורה באופן אוטומטי מסלולים קצה לאורך הסרט. פרמטרים שחולצו מהסרט, כגון קימוגרפיה רטיומטרית, מהירות גדילה ואורך פילופודיאליRe מוצג גם מאוחסן בתיקיית העבודה כתמונות וכקובצי נתונים. פרמטרים אחרים כגון החיים filopodial, קצב הצמיחה שיעור נסיגה לאחר מכן ניתן לחלץ ונותח נוספת מקבצי הנתונים המאוחסנים ( איור 2 ב ). <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> איור 2: ממשק משתמש גרפי לשימוש בתוכנת ניתוח התמונות. ( A ) GUI חלון # 1 משמש לטעינה ועיבוד של תמונות. התוכנית יכולה לטעון עד 3 ערוצי חלבון, לפיה 2 ערוצים מושווים זוג חכם. החלון מגיע עם חובה (כחול) תכונות אופציונלי (ירוק) לעיבוד מראש את התמונות לפני המעקב ( B ) GUI חלון # 2 משמש למעקב אחר פילופודיום, כמו גם ספטיו- temporal ו יחס- metric ניתוח חלבון. שוב, תכונות אופציונליות מסומנות בירוק. נתון זה היה modifiEd מתוך התייחסות 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנת המדגם וטיפול בתוכנה. אנו מתחילים עם הוראות מפורטות על תאים culturing ו רכישת סרטים אופטימיזציה עבור ניתוח התמונה. סעיף זה על רכישת נתונים ואחריו תיאור מפורט להפעלת תוכנת ניתוח התמונה. לאורך הפרוטוקול, אנו מציגים צעדים קריטיים ותכונות אופציונליות שיש לקחת בחשבון בעת ​​איסוף ועיבוד נתונים. לבסוף, אנו מנתחים filopodia ממערכות מודל שונים עם תוכנת ניתוח התמונה, לפני הסגירה עם השוואה של התוכנה המתוארת ניתוח התמונה עם תוכניות אחרות הזמינות לכימות filopodial ודיון על מגבלות והכיוון העתידי.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>10% סרום בקר עוברי</td><td>Biochrom AG</td><td>L11-044</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>1% פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Biochrom AG</td><td>12212</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (תמיסת מלאי 1M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Citrine-N1</td><td>Addgene</td><td>54593</td><td></td></tr><tr><td>Labtech</td><td>Thermo</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Thermo</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>מכון הלה לייבניץ DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td><td></td></tr><tr><td>COS 7</td><td>לייבניץ מכון DSMZ</td><td>ACC-60</td><td></td></tr><tr><td>3T3 תאים</td><td>מכון לייבניץ DSMZ</td><td>ACC-59</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td> ניקון מצלמת <td>ליקוי חמה</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>אנדור</td><td>DU888 יחידה אולטרה</td><td></td></tr><tr><td>קונפוקלית</td><td>לייצור</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>פירובט</td><td>ג'יבקו</td><td>31966-021</td><td></td></tr></tbody></table>

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

פילופודיה הן בליטות תאיות דינמיות, דמויי אצבע, הקשורות בהעברה ובתקשורת תאית. על מנת להבין טוב יותר את מנגנוני האיתות המורכבים העומדים בבסיס החניכה הגופנית, הארכה וייצוב או נסיגה שלאחר מכן, חשוב לקבוע את פעילות החלבון הזמני-הטמפורלי במבנים דינמיים אלה. כדי לנתח את תפקוד החלבון ב filopodia, פיתחנו לאחרונה אלגוריתם חצי אוטומטי מעקב שמתאים לשינויים צורה filopodial, ובכך מאפשר ניתוח מקבילי של הדינמיקה בליטה וריכוז חלבון יחסית לאורך כל אורך filopodial. כאן, אנו מציגים מפורט שלב אחר שלב פרוטוקול עבור טיפול התא אופטימיזציה, רכישת התמונה וניתוח תוכנה. בנוסף, אנו מספקים הנחיות לשימוש בתכונות אופציונליות במהלך ניתוח תמונות וייצוג נתונים, וכן הנחיות לפתרון בעיות עבור כל השלבים הקריטיים לאורך הדרך. לבסוף, אנו כוללים גם השוואה של דEscribed תוכנת ניתוח תמונה עם תוכניות אחרות הזמינות לכימות filopodia. יחד, הפרוטוקול המוצג מספק מסגרת לניתוח מדויק של הדינמיקה חלבון ב בליטות filopodial באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.

באמצעות תאים COS transfected עם סמן עבור אקטין נימי (F-tractin 18 , אדום) ואת הפניה cytosolic (ירוק), מצאנו אקטין עשיר filopodial בליטות ( איור 3 א , פאנל העליון). סדרות זמן הראו כי filopodia להרחיב במהירות לחזור ( איור 3 א , לוח באמצע). באמצעות תוכנת ניתוח התמונה, אנו עוקבים אחר filopodia הפרט. השוואה של אורך filopodial נמדד על ידי היד לעומת תוכנת ניתוח התמונה הראה...

אנו מציגים פתרון תוכנה למעקב חצי אוטומטי של ריכוז חלבון יחסי לאורך של בליטות תאיות דינמיות.

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

המטרה הכוללת של תוכנת ניתוח תמונה זו היא ניתוח מקביל של דינמיקת בליטה וריכוז חלבון יחסי לאורך כל הפילופוד. שיטה זו יכולה באמת לעזור לנו להבין שאלות מפתח בביולוגיה של התא, במיוחד החלבונים הבודדים המעורבים בהרחבה ונסיגה של פילופודיה. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שאלגוריתם מעקב הצורה האדפטיבי המסופק, מאפשר הערכה כמותית של דינמיקת בליטה ולוקליזציה של חלבון שנפתר מרחבית.כדי להתחיל, תרבית נוירונים, תאי HeLa או COS, במדיום משלים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר שמגיעים למפגש של 40%, יש להעביר את התאים עם המבנים לבחירה, באמצעות מגיב טרנסבקציה לפי הוראות היצרן. שמור את התאים המועברים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 15 עד 18 שעות.לאחר הדגירה, מלאו את תאי תרבית התאים עד 90% במדיום מחומם מראש של 37 מעלות צלזיוס, המכיל 20 מילי-HEPES מולארי, כדי להפחית שינויים ב-pH ובאוסמולריות עקב אידוי במהלך רכישת התמונה. כדי לאטום את המכסה, יש למרוח שכבה דקה של שומן ואקום בחלק הפנימי של המכסה וללחוץ עליו בעדינות על תא התרבות המכיל את התאים המועברים. אולי החלק החשוב ביותר לניתוח תמונה הוא איכות התמונה.דבר אחד שעלינו לדאוג לו הוא יחס האות לרעש, שצריך להיות יותר מארבעה ואנחנו יכולים להבטיח שעל ידי התאמת זמן החשיפה של המצלמה ועוצמת הלייזר וכוח המעקב אחר קצב הפריימים צריך להיות יותר מהרץ אחד. רכוש את התמונות באמצעות מיקרוסקופ עם מטרה של 60x או 100x וללא כיפוף פיקסלים. השתמש בקצבי רכישה של לא פחות מהרץ אחד כדי לעקוב אחר דינמיקה פילופודית.כדי למזער חפצים שאינם ממוקדים, תמונה פילופודית קרוב לקרום הבזיליקום. כדי להבטיח מעקב חלק, התאם את זמן החשיפה של המצלמה ואת עוצמת הלייזר כך שיחס האות לרעש יהיה גדול מארבע. לאחר השלמת הפעולה, התחל ברכישת התמונה.לאחר עיבוד מקדים של תמונה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט, טען את התמונות על ידי הורדת התיקיה הדחוסה המכילה את כל הקבצים הדרושים לניתוח תמונה. פתח והעתק קבצים לתיקיית העבודה. לאחר ההתקנה, הפעל את ממשק המשתמש הגרפי על ידי פתיחת הקובץ בשם, filopodiaAnalysisM3.fig.טען את קבצי ה-TIFF השמורים של המחסנית עבור חלבונים בודדים בממשק המשתמש הגרפי או בממשק המשתמש הגרפי. באמצעות הכפתורים 1B עבור חלבון A, 1C עבור חלבון B ואופציונלי, 1D עבור חלבון C.צור תמונה מונחת של התא מתעלות החלבון על ידי לחיצה על 1A. לאחר מכן, לחץ על 2A, כדי להקצות את המסגרת הראשונה ולחץ על 2B, כדי להקצות את המסגרת האחרונה לניתוח.לחלופין, חתוך את אזור העניין או החזר ההשקעה, המכיל את הפילופודיום המעניין באמצעות כפתור 2H. סובב את התמונה באמצעות כפתור 2I, או מחק אזורים לא רצויים באמצעות כלי הציור ביד חופשית, 2J. הזז את המחוון, 2C עבור כל פריים לבקרת איכות וכדי לבדוק אם הפילופודיום נשאר גלוי בבירור לאורך כל הסרט.כדי ליצור את המעקב, ראשית, לחץ על כפתור 3A בחלון ה-GUI הראשון, כדי לפתוח את חלון ה-GUI השני. לחץ על כפתור הארבע בחלון השני של ממשק המשתמש הגרפי, כדי ליצור את המסה של גוף התא המונח על גבי חלון ממשק המשתמש הראשון, לאחר לחיצה על 1A. אנו ממליצים להקדיש זמן למיטוב פרמטרים כגון מספר המקטעים, רוחב הסריקה ורדיוס הסריקה עבור ערכת הנתונים הניסיוניים שלך.הזז את המחוון בחלון מספר שתיים, כדי לבדוק היכן הקצה הפילופודי מופיע לראשונה. לאחר מכן, לחץ על כפתור חמש והסמן יופיע. השתמש בסמן כדי לבחור את הבסיס שממנו נמדד המרחק של קצה הפילופוד.ואחריו קצה הפילופודיה במסגרת בה הוא מופיע לראשונה. לאחר מכן, בחר את אורך הסף שמעליו תתכופף הפילופודיה, באמצעות 6C. לאחר מכן, ציין את מספר הקטעים המשמשים לקירוב צורת הפילופודיה בתיבה 6A.ציין את רוחב הסריקה, המשמש כסורק אופקי, כדי למקם את הצמתים ב- 6B. ציין את רדיוס הסריקה בתיבה 6D, השתמש בערך הגדול בכ- 50% מהזזת הקצה בין המסגרות שנצפתה. לאחר מכן, ציין את זווית הכיפוף בתיבה 6E.סמן את מעקב ההיסטוריה של התיבה בחלון השני של ממשק המשתמש הגרפי, כדי לשמור את כל פרוטוקול המעקב לעיון עתידי ולאחר מכן לחץ על כפתור המעקב והניתוח כדי להתחיל במעקב. לניתוח זמני מרחבי, בחר את התיבה המיוצגת על ידי 8B, ואחריה ערוץ החלבון המעניין. לחץ על 8A, כדי להתחיל מעקב אחר חלבון לאורך הפילופוד, תוך שימוש בעקבות שנוצרו קודם לכן.לניתוח חלבון רציומטרי, סמן את התיבה 9B או 9C ולחץ על הכפתור, 9A כדי לקבל את התרשים היחסי הזמני המרחבי. כדי לבצע את ניתוח הקצה הפילופודאלי, סמן את התיבה 8F וציין את אורך הקצה ואורך הסף מהבסיס, באמצעות 8G ו- 8H. לחץ על כפתור הלחיצה, כדי לשמור את הנתונים בקובץ אקסל בשם dynamics.xlsx.לאחר מכן, לחץ על ניתוח עוצמות החלבון כדי ליצור עקבות של עוצמות החלבון של הקצה הפילופודי ולשמור לניתוח רציומטרי. לחץ על היחס הרצוי לניתוח, באמצעות 9D או 9E. לבסוף, לחץ על כפתור ההשוואה, 9A כדי ליצור את נתוני היחס.הניתוח של תאי COS שהועברו עם סמן לאקטין חוטי באדום, והתייחסות ציטוזולית בירוק חושפים בליטות פילופודיות עשירות באקטין. סדרת זמן מראה בליטות פילופודיות עשירות באקטינים מתרחבות ונסוגות במהירות. באמצעות תוכנת ניתוח התמונה, אותרו הפילופודיות הבודדות.תוכנת ניתוח תמונה עוקבת באופן אמין אחר הרחבה פילופודית, בנוסף לשיעורי הצמיחה והנסיגה של פילופודיה בודדת, כימיגרפים מתארים גם ריכוז של אקטין מנורמל להתייחסות הציטוזולית. אם משתמשים בה כראוי, טכניקה זו מאפשרת ניתוח כמותי של דינמיקת בליטה וריכוז חלבון שנפתר מרחבית לאורך הפילופודיה. כאשר מנסים את ההליך, חשוב לזכור את מהירות הרכישה ולשמור על יחס האות לרעש גדול מארבע, תוך לא להרוות תמונות בודדות.

a-graphical-user-interface-for-software-assisted-tracking-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מיקרוסקופיה photoactivated הלוקליזציה (PALM) בשילוב עם מעקב מולקולה בודדת מאפשרת התבוננות ישירה וכימות של אינטראקציות החלבון-DNA בתאי חיידקי Escherichia חיים.

לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת כדי לדמיין ולעקוב אחר קולטנים בודדים על פני תאים חיים ובכך לנתח את הניידות הרוחבית של הקולטן, גודל קומפלקסי הקולטנים וכן לדמיין אינטראקציות קולטן-קולטן חולפות. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחלבוני ממברנה אחרים.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

בפרוטוקול וידאו זה אנו עוקבים - במהירות גבוהה ובתלת מימד - אחר ליזוזומים בעלי תווית פלואורסצנטית בתוך תאים חיים, תוך שימוש בשיטת המעקב המסלולי במיקרוסקופ דו-פוטוני שונה.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

אנדוציטוזיס בתיווך קלת'רין, תהליך מהיר ודינמי ביותר שמפנים חלבונים רבים, כולל קולטני איתות. הפרוטוקול המתואר כאן מדמיין ישירות את הקינטיקה של אירועים אנדוציטיים בודדים. זה חיוני להבנת האופן שבו חברי הליבה של המנגנון האנדוציטי מתאמים זה עם זה, וכיצד מטען החלבון משפיע על תהליך זה.

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית

כאן, אנו מציגים עבור חלקיק יחיד מעקב וניתוח תמונות המאפשר הערכה כמותית של דיפוזיה מקדמים, סוגי תנועה וגדלי אשכול של חלקיקים אחד שזוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ פרוטוקול.

עיבוד פרוטוקול עבור הניתוח של פעפוע וגודל האשכול של קולטני ממברנה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונה

3D מיקרוסקופ לוקליזציה יחיד מולקולה מנוצל כדי לחקור את המיקומים מרחבי ומסלולי תנועה של חלבונים המסומנים באנרגיה בתאי בקטריאלי חיים. פרוטוקול ניתוח הנתונים הניסיוני והמידע המתואר להלן קובע את ההתנהגויות התפוצזות הנפוצות של חלבונים ציטוסולמים בהתבסס על מסלולים בעלי מולקולה בודדת.

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

מאמר זה מציג שיטה לניתוח spatiotemporal של נייד, מולקולה אחת Förster העברת אנרגיה תהודה (smFRET) מבוסס בדיקות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה. ערכת הכלים החדשה שפותחה מאפשרת לקבוע עקבות זמן smFRET של בדיקות נעות, כולל היעילות הנכונה של FRET ואת העמדות המולקולריות, כפונקציות של זמן.

ניתוח ספטיוטמפורלי דו-ממדי אוטומטי של בדיקות FRET ניידות בעלות מולקולה אחת

פרוטוקול זה נועד למדוד את הפרמטרים הדינמיים (בליטות, נסיגה, קפלים) של בליטות בקצה של תאים מתפשטים.

מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים

פרוטוקול זה מתאר עיבוד תמונה מבוסס iSCAT וגישת מעקב אחר חלקיקים בודדים, המאפשרת חקירה סימולטנית של המסה המולקולרית וההתנהגות המפוזרת של מקרומולקולות המקיימות אינטראקציה עם ממברנות שומנים. הוראות שלב אחר שלב להכנת דגימה, המרה המונית לניגודיות, רכישת סרטים ועיבוד לאחר עיבוד מסופקות לצד הוראות למניעת מלכודות פוטנציאליות.

מעקב אחר חלקיקים רגישים למסה לאפיון דינמיקת מקרומולקולות הקשורות לממברנה

מאמר זה מספק תיאור מפורט כיצד ליצור דגימות למעקב אחר חלבון יחיד בשכבות דו-שכביות ליפידיות הנתמכות על ידי מוצקים. הוא גם מסביר מיקרוסקופ פלואורסצנציה פשוט עם רגישות למולקולה בודדת וקצב פריימים מהיר. לבסוף, אנו מתארים את ההליך להפקת מסלולי חלבון יחיד.

מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות של ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

למדו כיצד לנתח דינמיקת חלבונים בזיזי פילופודיה באמצעות תוכנת מעקב חצי-אוטומטית. השיטה מאפשרת כימות מקבילי של דינמיקת הזיזים וריכוז החלבון לאורך כל אורך הפילופודיה בזמן אמת.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

גלה סרטונים נוספים