Protocol עבור הבחנה של תאים גזעיים Pluripotent Indoced האדם לתוך תרבויות מעורבות של נוירונים וגליה עבור בדיקה נוירוטוקסיות

המטרה הכוללת של הליך זה היא להבדיל תאי גזע עצביים שמקורם במושבות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתרביות מעורבות של תאי עצב ותאי גליה. דגם זה מתאים לבדיקת רעילות לתרופות וכימיקלים. ניתן ליישם מודל מבחנה זה להערכת הפרעות כימיות של מסלולי איתות המופעלים במהלך תהליך התמיינות עצבית וגליה.

היתרון העיקרי של מערכת זו הוא שימוש במודל אנושי הנגזר מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים המייצגים אלטרנטיבה לתאי סרטן בשימוש מסורתי ותרביות ראשוניות של בעלי חיים ומאפשר לחקור רעילות עצבית באוכלוסייה מעורבת של תאי עצב ותאי גליה. ההליך יודגם על ידי פרנצ'סקה פיסטולטו, הפוסט-דוקטורנטית שלנו, וקרולינה נונס, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. התחל במעבר מושבות ה-hiPSC.

עבודה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בהגדלה של ארבע X בארון זרימה למינרית, השתמש במזרק מיליליטר אחד עם מחט בגודל 30. חותכים את מושבות תאי הגזע לריבועים של כ -200 מיקרון על 200 מיקרון. כריתת המושבות דורשת מיומנויות ידניות טובות כדי להשיג שברים בגודל שווה.

השימוש בכלי חיתוך זמינים מסחרית יכול לעזור. לאחר מכן השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לנתק את שברי המושבה משטח הכלי על ידי פיפטינג עדין של המדיום שמתחתיו כדי להרים את החלקים. העבירו כ-100 שברי מושבה לצלחת 60 מילימטר מצופה DMEM F12 מוסמכת מלאה בארבעה מיליליטר של מדיום hiPSC שלם.

לאחר מכן דגרו את המנה החדשה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. בצע שינוי מדיום כולל מדי יום ובדוק את המורפולוגיה של המושבות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בהגדלות X ו-10X. ביום האפס של הליך ההתמיינות, רענן את מדיום ה-hiPSC על ידי הוספת שלושה מיליליטר מדיום לכל צלחת פטרי של 60 מילימטר.

לאחר מכן חותכים ומנתקים את שברי 200 המיקרון כמו קודם. פיפטה את השברים המנותקים והמדיום לתוך צינור של 15 מיליליטר. שוטפים את המנה בשני מיליליטר מדיום hiPSC שלם ושחזרו את כל השברים.

ואז צנטריפוגה ב 112 פעמים G למשך דקה אחת. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשעו בעדינות את השברים בחמישה מיליליטר של מדיום hiPSC EB שלם. צלחת את הנפח המלא בצלחת תרבית רקמות חיבור נמוכה במיוחד של 60 מילימטר.

דוגרים את המנה למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת בדקו את התאים במיקרוסקופ הפוך. היום שבו גופים עובריים אחד צריכים להיראות מעוגלים ונבדלים זה מזה כפי שניתן לראות כאן.

לאחר מכן פיפטה את הגופים העובריים והמדיום מהצלחת והעבירו לצינור של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של הגופים העובריים ב-112 פעמים G למשך דקה אחת. ביום השני שאפו תמיסת ציפוי מטריצה סטנדרטית מכלי 60 מילימטר שהוכנה בעבר והוסיפו למנה חמישה מיליליטר של מדיום אינדוקציה נוירו-אפיתל שלם, או NRI.

עובדים תחת המיקרוסקופ הסטריאוסקופי בהגדלה של ארבע X ובאמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר, אוספים כ-50 גופים עובריים צפים ומעבירים לצלחת מצופה אחת. לאחר מכן דגרו את המנה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני. למחרת, היום השלישי של הליך ההתמיינות, בדוק את הצלחת מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 כדי לוודא שכל הגופים העובריים מחוברים.

לאחר מכן בצע בעדינות שינוי מדיום כולל עם מדיום NRI מלא. החלף את מדיום ה-NRI כל יומיים עד היום השביעי כאשר אגרגטים נוירו-אפיתליאליים דמויי רוזטה אמורים להיות גלויים. ביום השביעי, מצפים צלחת של 96 בארות על ידי פיפטינג של 100 מיקרוליטר של מטריצה סטנדרטית מדוללת במדיום תרבית לכל באר.

ביום השמיני, חתכו את האגרגטים דמויי הרוזטה לשברים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בהגדלה של פי 10 בתנאים סטריליים. שימו לב שהרוזטות נוטות להתנתק בקלות מהצלחת כאשר נוגעים בהן במחט. במקרה זה, יש לפרק חלקית את השושנה המנותקת עם קצה המחט.

אם הרוזטות יישארו מחוברות חלקית, השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להשלים את ניתוק שברי הרוזטה. ייחורי רוזטה דורשים מיומנויות ידניות טובות ודיוק על מנת להימנע מחיתוך נגזרות עצביות. לאחר מכן אוספים את שברי הרוזטה והמדיום שלהם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

שוטפים את המנה בשני מיליליטר מדיום NRI כדי לשחזר את כל השברים. לאחר מכן סובב את שברי הרוזטה ב -112 פעמים G למשך דקה או שתיים. לאחר שאיבת הסופרנטנט, השהה בעדינות את הגלולה במיליליטר אחד של X DPBS שחומם מראש ללא סידן ומגנזיום.

פיפטה בעדינות את שברי הרוזטה למעלה ולמטה כדי לנתק אותם חלקית. לאחר מכן הוסיפו ארבעה מיליליטר של מדיום NRI שלם וספרו את התאים באמצעות טריפן כחול ומונה תאים אוטומטי. לאחר מכן שאב את תמיסת ציפוי המטריצה הסטנדרטית מהלוח של 96 בארות והפקיד את התאים לבארות בצפיפות של כ-15,000 תאים לסנטימטר רבוע במדיום NRI.

דגרו את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. ביום 10, בצע שינוי מדיום כולל באמצעות מדיום התמיינות עצבי מלא. תמונה מייצגת זו מציגה רוזטות לאחר 12 יום במבחנה מוכתמות לנסטין בירוק ובטא שלוש טובולין באדום.

כאן תאים שגודלו במשך 28 יום במבחנה נצבעו לבטא שלוש טובולין באדום ו-NF200 בירוק. תמונה מייצגת זו מציגה תאים עצביים מובחנים מ-NSCs לאחר 21 יום במבחנה צבועים ב-NF200 באדום וגרירה בירוק. כאן תאי גליה מאותה תרבית מוכתמים עבור GFAP באדום.

היסטוגרמה זו משווה כימות של נסטין, MAP שתיים, GFAP, חומצה גמא-אמינו בוטירית, טרנספורטר גלוטמט שלפוחית אחד ותאים חיוביים לטירוזין הידרוקסילאז בנגזרות IMR90 hiPSC ותאים מובחנים מ-NSCs שמקורם ב-IMR90 hiPSC. תמונות ניגודיות פאזה אלה שצולמו באמצעות אובייקט 10X מראות תאי גזע עצביים שעוברים התמיינות במשך 21 יום. על ידי ביצוע נהלים אלה, ניתן לבצע קריאות אחרות כגון PCR כמותי בזמן אמת וניתוח מחדש רב-צדדי על מנת להעריך את הפיזיולוגיה והפנוטיפ של תאי עצב וגליה ולהעריך את השפעת הכימיקלים.

אל תשכח שהעבודה עם תרכובות כימיות עלולה להיות מסוכנת ביותר. לכן יש לנקוט תמיד באמצעי הזהירות הרלוונטיים שלך באמצעות משקפי מגן, כפפות או מסכה מתחת למכסה המנוע, במיוחד בעת ביצוע טיפולים כימיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג אוכלוסייה מעורבת מובחנת של נוירונים ותאי גליה החל מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים המייצגים מודל מתאים, במודל מבחנה, לפיתוח בדיקת נוירוטוקסיות.