הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר את ההליכים הנדרשים לדור מוצלח של עכברים מהונדסים גנטית על ידי הזרקת מיקרו של ביציות. פרוטוקול זה יכול לסייע לחוקרים ולצוות הטכני המעורבים בתחום היווצרות העכברים, אך גם במיקוד גנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא מסתמכת על הזרקה ישירה של ביציות עכברים, הן לאינטגרציה אקראית, אך גם למיקוד גנים, מה שמאפשר יצירת עכברים מהונדסים גנטית תוך שישה שבועות בלבד.

להכנת RNA מנחה יחיד, לאחר בחירת שני רצפי המטרה הרצויים והכנת פריימרים על פי פרוטוקול הטקסט, סינתזה תבנית DNA ליניארית על ידי דילול הפלסמיד PX330 ל-10 ננוגרם למיקרוליטר במים נטולי נוקלאז. מכינים תערובת מאסטר, מוסיפים את הפולימראז בסוף ושומרים על קרח. לאחר מכן מערבבים ומפצלים את התמיסה לשמונה צינורות PCR.

הוסף מיקרוליטר אחד של PXR330 לכל שפופרת, והפעל את התוכנית הבאה. לאחר מכן, השתמש בערכת טיהור PCR, סעפת ומקור ואקום לטיהור מוצר ה-PCR. הוסף חמישה נפחים של מאגר כריכה לנפח אחד של דגימת ה-PCR וערבב.

הנח את עמוד הסיבוב של קרום הסיליקון על הסעפת. כדי לקשור DNA, יש למרוח את כל שמונה הדגימות על העמודה, בוואקום. כדי לשטוף את הדגימה, הוסף 0.75 מיליליטר מאגר כביסה לעמוד ולשאוב אבק.

לאחר מכן, צנטריפוגה את העמודה ב-12,000 פעמים G למשך 60 שניות כדי לחסל שאריות אתנול. הנח את העמוד בצינור מיקרו צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר, ואז, כדי לחסל את ה- DNA, הוסף 30 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז למרכז הממברנה. תן לעמודה לעמוד דקה אחת ולצנטריפוגה אותה, 12, 000 פעמים G למשך 60 שניות.

לאחר מכן השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ריכוז ה-DNA. כדי לבצע שעתוק במבחנה באמצעות ערכת סינתזת RNA t7, הכינו את תערובת המאסטר ודגרו את התגובה בתרמו-סייקלר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. הוסף 28 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ושני מיקרוליטר של DNAse אחד, ודגר את התגובה למשך 15 דקות נוספות.

כדי לטהר את ה-RNA, ממיסים את האבקה הכלולה בעמודת הספין המסופקת ו-650 מיקרוליטר של מאגר מיקרו הזרקה נטול נוקלאז. הסר בזהירות את כל בועות האוויר, כסה את הצינור והרטיב את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 15 דקות. הסר את המכסה הכחול בתחתית והנח את העמוד בצינור של שני מיליליטר.

ואז צנטריפוגה את הצינור ב 750 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. לאחר מכן הניחו את העמוד בצינור טרי של 1.5 מיליליטר ומרחו 50 מיקרוליטר מתמיסת ה- RNA טיפה חכמה למרכז, מבלי לגעת בקיר העמוד. לאחר מכן, סובב את העמודה ב 750 פעמים G למשך שתי דקות.

למדוד את ריכוז הרנ"א ולהעריך את איכות הרנ"א על פי פרוטוקול הטקסט. באמצעות מאגר הזרקת מיקרו נטול נוקלאז, יש לדלל את המארז של תשעה mRNA ל-50 ננוגרם למיקרוליטר ואת ה-sgRNAs ל-12.5 ננוגרם למיקרוליטר לניסויי נוקאאוט של גנים. מוסיפים את תבנית התורם בריכוז של 200 ננוגרם למיקרוליטר, לעריכת גנום המבוססת על תיקון ישיר הומולוגיה ושומרים אותה על קרח.

השתמש בחתיכת הפה של השואב, כדי לשטוף את הביציות בארבע טיפות טריות של חומצות אמינו קזאין. ומעבירים אותם לטיפה אחרונה של מדיום שמונה קזום, מכוסה בשמן מינרלי. כדי לבצע הזרקה גרעינית פרו לאינטגרציה אקראית, תחת מיקרוסקופ הסטריאו, השתמש בחתיכת הפה של השואב כדי להפוך כ-50 ביצים לטיפה של מדיום m2, מכוסה בשמן מינרלי שישמש כתא ההזרקה.

העבירו את תא ההזרקה למיקרוסקופ הפוך והזריקו לביציות המופרות כמה פיקוליטר מתערובת ההזרקה. הפרונוקלאוס יתנפח אם ההזרקה תצליח. בצע הזרקה ציטופלזמית למיקוד גנים, השתמש בפיה כדי להעביר כ-50 ביציות לטיפה של קזום A, המכיל חמישה מיקרוגרם למיליליטר ציטוכלזין B ודגר את הביצים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך חמש דקות.

העבירו את הביציות לתא ההזרקה, ואז, בלחץ נמוך מאוד, הזריקו כמה פיקוליטר מתערובת ההזרקה לציטופלזמה. שימוש בלחץ הקיזוז של המיקרו-מזרק האוטומטי במידת האפשר. לאחר ההזרקה, השתמש בפיה כדי להעביר את הביציות בחזרה לטיפה של חומצות קזואמינו.

שמור אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עד שהם נטענים להשתלה מחדש בצינור הביצית של הנקבות ההרות המדומה. לאחר הרדמת עכבר סתום על פי פרוטוקול הטקסט, לביצוע השתלה מחדש בתנאים סטריליים, יש לחשוף את דרכי הרבייה באמצעות אזמל לחתך באורך סנטימטר אחד במקביל לקו האמצע הגבי. לאחר מכן, בעזרת מספריים, חותכים את השריר ומשתמשים במלקחיים כדי לתפוס את כרית השומן.

משוך בעדינות את השחלה החוצה, עד שצינור הביצית והרחם המחוברים אליה נראים בבירור. לאחר מכן השתמש בכלי clamp כדי לתקן את כרית השומן. מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, השתמש בזוג מספריים מיקרו כדי לבצע חתך בדופן צינור הביצית, כמה מילימטרים במעלה הזרם של האמפולה.

כמו כן, תחת מיקרוסקופ הסטריאו, טען 25 ביצים מוזרקות מיקרו לתוך נימי הזכוכית המחוברים לפיה. לאחר מכן, הכנס את נימי הזכוכית לתוך צינור הביצית והוציא את הביצים עד שנראית בועת אוויר בתוך האמפולה. כדי להבטיח שההשתלה מחדש הצליחה, עליך לבדוק את נוכחות בועת האוויר באמפולה, מה שמבטיח שכל הביציות נפלטו במיקום הנכון ואף אחת מהן לא נשארה בנימי הזכוכית.

הסר בעדינות את נימי הזכוכית והנח את דרכי הרבייה בחזרה לבטן. לאחר מכן השתמש בשלושה תפרים כירורגיים אפסיים שאינם נספגים כדי לתפור את החתך ולאחר מכן, השתמש בקליפסים לפצע כדי לסגור את העור. הניחו את העכבר על מחצלת חמה כדי למנוע היפותרמיה, והזריקו משכך כאבים תת עורי.

עקוב אחר העכבר עד להתאוששות מלאה. לבסוף, בצע הקלדה וריצוף גנום על פי פרוטוקול הטקסט. איור זה מציג ג'לים אנליטיים המדגימים את איכות טיהור הטרנסגן, וסינתזת ה-sgRNA שהם קריטיים ליצירת עכברים מהונדסים גנטית בהצלחה

מוצג כאן, קריאה טיפוסית של מפגש מיקרו הזרקה לאינטגרציה אקראית. פריימר הגנוטיפ צריך לשבת על הטרנסגן וצריך להיות מתוכנן ליצור מקטע של 200 עד 800 זוגות בסיסים. בקריאה זו למיקוד גנים, הפריימרים שנבחרו להכלאה עם ה-DNA הגנומי מחוץ לאזור נכרתו בסופו של דבר על ידי שני החבר'ה.

אסטרטגיה זו מאפשרת זיהוי ישיר של מייסדים הטרוזיגוטיים והומוזיגוטיים. כפי שמוצג כאן, כאשר כל שלב בפרוטוקול מותאם, אחוז הגור הטרנסגני אמור להגיע ל-10% עד 25% עבור אינטגרציה אקראית, וזה נמוך במקצת בהשוואה ליכולת של רכיבי ה-CRISPR לערוך את גנום העכבר. באמצעות CRISPR למיקוד גנים, מספר המייסדים בדרך כלל גבוה יותר, ונע בין 25% ל-100%לא נדיר להשיג צאצא שלם שהוא הומוזיגוט בהצלחה כאשר הוא נערך באמצעות CRISPR.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחומים כמו מדעי המוח או סרטן למשל, להשתמש במודלים חדשים של מסכות כדי לגלות מנגנונים פתולוגיים ובסופו של דבר לתרגם זאת לאסטרטגיות טיפוליות.