Name: הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: למדו את שיטת המיקרו-הזרקה ליצירת עכברים מותאמים גנטית דרך הזרקה ישירה לביציות. פרוטוקול זה מסייע לחוקרים בתחום הגנטיקה וההנדסה הגנטית לייצר מודלים חדשים במהירות וביעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים לצוות של מתקן החיות (BRC) על תמיכתם המתמשכת. עבודה זו מומנה על ידי המועצה הלאומית למחקר רפואי רפואי ומועצת המחקר האוסטרלית.

<ol><li>Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+function+of+tau+mediates+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer%27s+disease+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models.</a> Cell. 142 (3), 387-397 (2010).</li>
<li>Ittner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+phosphorylation+of+tau+inhibits+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer%27s+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice.</a> Science. 354 (6314), 904-908 (2016).</li>
<li>Marantz Henig, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarantz+Henig%2C+R+%22The+Monk+in+the+Garden%22">The Monk in the Garden</a>. , Mariner books. (2000).</li>
<li>Jaenisch, R., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+virus+40+DNA+sequences+in+DNA+of+healthy+adult+mice+derived+from+preimplantation+blastocysts+injected+with+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).</li>
<li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li>
<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li>
<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li>
<li>Carbery, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 451-459 (2010).</li>
<li>Sung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).</li>
<li>Jinek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Kang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+precise+genetic+modifications+into+human+3PN+embryos+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assist+Reprod+Genet%22%5BJournal%5D)">Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing.</a> J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).</li>
<li>Liang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+in+human+tripronuclear+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.</a> Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).</li>
<li>Ittner, L. M., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronuclear+injection+for+the+production+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Pronuclear injection for the production of transgenic mice.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>CRISPR DESIGN. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://crispr.mit.edu">http://crispr.mit.edu</a> (2017).</li>
<li>Integrated DNA Technologies. Resuspension Calculator. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/">https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/</a> (2017).</li>
<li>BioTools at UMass Medical School. Primer3: WWW primer tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi">http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi</a> (2017).</li>
<li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+differences+in+the+efficiency+of+transgenic+mouse+production%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production.</a> Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).</li>
<li>Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+superovulation+efficiency%2C+aneuploidy+rates%2C+and+sister+chromatid+cohesion+in+mice+aged+up+to+15+months%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months.</a> Biol Reprod. 86 (2), 49(2012).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-superovulation+for+the+CRISPR-Cas9-mediated+production+of+gene-knockout%2C+single-amino-acid-substituted%2C+and+floxed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice.</a> Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), e35538(2012).</li>
<li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).</li>
<li>Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+procedure+for+genotyping+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Res. 29 (17), E88(2001).</li>
<li>Yoshimi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ssODN-mediated+knock-in+with+CRISPR-Cas+for+large+genomic+regions+in+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes.</a> Nat Commun. 7, 10431(2016).</li>
<li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+via+CRISPR%2FCas9+mediated+homology-independent+targeted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-71 (1999).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+mutation+at+the+known+collagenase+cleavage+site+in+mouse+type+I+collagen+impairs+tissue+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling.</a> J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).</li>
<li>Ke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+suppression+of+A315T+mutant+human+TDP-43+expression+improves+functional+deficits+in+a+novel+inducible+transgenic+mouse+model+of+FTLD-TDP+and+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS.</a> Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).</li>
<li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+functional+transgenic+mice+by+DNA+pronuclear+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Pol%22%5BJournal%5D)">Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection.</a> Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nat Methods. 12 (6), 479(2015).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+globin+messenger+RNA+by+the+mouse+ovum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum.</a> Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).</li>
<li>Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+transfer+into+mouse+ova+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection.</a> Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).</li>
<li>Biggers, J. D., Summers, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+a+culture+medium%3A+making+informed+choices%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Choosing a culture medium: making informed choices.</a> Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+transfer+through+the+wall+of+the+fallopian+tube+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice.</a> Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).</li>
<li>Truett, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Delerue, F., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="https://www.omicsgroup.org/journals/cloning-transgenesis-abstract.php?abstract_id=50992">Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects.</a> Clon. Transgen. 4, (2015).</li>
</ol>

המחברים מספקים שירותי transgenesis אקדמי בעכברים באמצעות אוניברסיטת ניו סאות &#39;ויילס מארק ויינרייט אנליטית מרכז.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול הדור של עכברים מהונדסים גנטית ידוע להיות מאתגר מבחינה טכנית. עם זאת, הפרוטוקול המוצג כאן היא שיטה אופטימיזציה ופשוט המאפשר אחד לשלוט ולפתור את הטכניקה בזמן שיא. ישנם שני שלבים הכרחיים להשלמת הטכניקה בהצלחה. ראשית, הסינתזה של תבניות DNA לינאריות (לסינתזה של sgRNAs) ניתן להשיג ללא מגנזיום כלורי (MgCl 2 ). עם זאת, מומלץ מאוד להוסיף MgCl 2 באופן שיטתי לתמהיל הראשי כי הכ...

מודלים של בעלי חיים, הן בחולייתנים והן בחסרי חוליות, שימשו כלי עזר לבחינת הפתופיזיולוגיה של מצבים אנושיים כגון מחלת אלצהיימר 1 , 2 . הם גם כלים שלא יסולאו בפז כדי לחפש מחליפי מחלות ובסופו של דבר לפתח אסטרטגיות טיפול חדש בתקווה של תרופה. למרות שלכל מודל יש מגבלות פנימיות, השימוש בבעלי חיים כמודלים מערכתיים שלמים הוא חיוני למחקר ביו-רפואי. הסיבה לכך היא כי הסביבה הפיזיולוגית מטבולית ומורכבת לא ניתן לדמות לחלוטין בתרבית רקמות. עד כה, העכבר נשאר המין היונקים הנפוצים ביותר המשמשים מניפולציה גנטית כי זה כולל מספר יתרונות. תהליכים פיזיולוגיים וגנים הקשורים למחלות הם שמורים מאוד בין עכברים ובני אדם. העכבר היה יונק הראשון יש רצף הגנום המלא שלה (2002), שנה אחת לפני geno האדםלי (2003). מלבד זה עושר של מידע גנטי, העכבר יש יכולות הרבייה טובה, מחזור פיתוח מהיר (6 שבועות מן ההפריה לגמילה), וגודל סביר. כל היתרונות הללו, בשילוב עם אינדיקטורים פיזיולוגיים, כגון צבעי מעיל נפרדים (נדרש לחצות אסטרטגיות), הפכו את העכבר למודל אטרקטיבי עבור מניפולציה גנטית. יש לציין, בגיל מוקדם מאוד של גנטיקה מודרנית, גרגור מנדל התחיל לעבוד על עכברים לפני המעבר צמחים 3 . טכניקות העברת גנים גרמו לדור של העכבר המהונדס הראשון מעל לפני שלושה עשורים 4 , נוצר בתחילה באמצעות משלוח ויראלי. עם זאת, החוקרים הבינו עד מהרה כי אחד האתגרים העיקריים של transgenesis העכבר היה חוסר היכולת לשלוט על גורלו של ה- DNA אקסוגני. בגלל המסירה ויראלי של transgenes לתוך הביציות העכבר הביא עותקים מרובים משולבים באופן אקראי לתוך הגנום, possibilitY של הקמת קווים מהונדסים שלאחר מכן היה מוגבל. מגבלה אחת כזו היתה להתגבר כאשר גורדון et al. שנוצר קו העכבר מהונדס הראשון על ידי microinjection 5 , 6 . זה התחיל את העידן של טכנולוגיית DNA רקומביננטי, ואת הפרמטרים המשפיעים על התוצאה של הפגישה microinjection נחקרו באופן נרחב 7 . למרות microinjection אינו מאפשר שליטה על אתר האינטגרציה של transgene (אשר בסופו של דבר תוצאות רמות ביטוי ספציפי עבור כל עכבר מייסד), היתרון העיקרי של microinjection pronuclear נשאר היווצרות של concatemers ( כלומר, מערכים של עותקים מרובים של transgene, מקושר בסדרה) לפני שילוב גנומי 5 . מאפיין זה שימש במשך השנים להקים אלפי שורות עכבר מהונדס כי overexpress גן עניין. מאז, transgenesis, אשינוי מלאכותי של הגנום של האורגניזם, נעשה שימוש נרחב כדי לזהות את התפקיד של גנים בודדים בהתרחשות של מחלות. הישג מפתח נוסף על מניפולציה של הגנום העכבר הגיע כאשר מריו Capecchi בהצלחה שיבשו גן אחד בעכבר, פתיחת עידן של הגן מיקוד 8 . עם זאת, החסרונות העיקריים שהגיחו במהירות ממיקוד גנים המבוסס על תאי גזע ES, כולל האתגרים של תאי ES מתורבתים, מידת השתנות מסוימת של קימברליות ואורך התהליך ( כלומר, 12-18 חודשים, מינימום, כדי להשיג את העכבר) . לאחרונה, ההתקדמות בטכנולוגיות חדשות, כגון אנדונואלאסים מהונדסים ( למשל, נוקלאזות אצבע אבץ (ZFN), גרעיני אפקט מניע כמו activator (TALEN), וקבוצות חוזרות ונשנות של פליינדרומיס מקובצים בקביעות (CRISPR / Cas9) התפתחו כשיטות חלופיות להאיץ את תהליך המיקוד הגנטי ב- micE 9 , 10 . אלה endonucleases יכול בקלות להיות מוזרק לתוך ביציות העכבר על ידי microinjection, המאפשר לדור של עכברים ממוקד תוך פחות מ 6 שבועות. מאז הדו&quot;ח הראשון על השימוש CRISPR עבור עריכת הגנום 11 , מערכת חיסונית חיידקית אדפטיבית זו החליפה ZFN ו TALEN בשל היתרונות הרבים שלה, כולל את הקלות של סינתזה ואת היכולת למקד לוקוסים מרובים בבת אחת (המכונה &quot;ריבוב&quot; &quot;). CRISPR שימש לראשונה עבור מיקוד גנים בעכברים 12 ומאז הוחל על מינים אינספור, מן הצמחים לבני אדם 13 , 14 . עד כה, אין דיווח על מין אחד עמיד לעריכת הגנום CRISPR. שני השלבים המגבילים העיקריים של הדור של עכברים מהונדסים הם הזרקה של ביציות ואת ההשתלה מחדששל הביציות האלה לתוך נקבות מדומות בהיריון. למרות טכניקה זו תוארה על ידינו 15 ועוד 16 , שיפורים טכניים האחרונות עכבר embryology וטכניקות העברת הגן יש מהפכה בתהליך של יצירת עכברים מהונדסים גנטית. שיפורים אלה יתוארו כאן.

<table><tbody><tr><td>מיקרופיפטה 0.1-2.5 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000016</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטה 2 - 20 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000040</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטה 20 - 200 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000067</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטה 100 - 1,000 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000083</td><td></td></tr><tr><td>סמן משקל מולקולרי&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33025</td><td>HyperLadder 1 kb</td></tr><tr><td>סמן משקל מולקולרי&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33056</td><td>HyperLadder 100 bp</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93296</td><td>10x - מדולל ל-1x</td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>SYBR כתם ג'ל בטוח</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR (Qiaquick)</td>מערכת ואקום <td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>(סעפת)</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>מאגר מיקרו-הזרקה ללא נוקלאז'&nbsp;</td>מסנן מיקרוצנטריפוגה <td>Millipore</td><td>MR-095-10F</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 mRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS9MRNA</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR מבטא פלסמיד (px330)</td> <td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T7 ערכת RNA מהירה בתפוקה גבוהה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E2050S</td><td></td></tr><tr><td>עמודות ספין לטיהור RNA (NucAway)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ssOligos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO STANDARD</td><td></td></tr><tr><td>תורם פלסמיד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>KSOMaa מדיום תרבית עובר</td><td>Zenith Biotech&nbsp;</td>שמן מינרלי <td>ZEKS-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zenith Biotech&nbsp;</td><td>ZSCO-100</td><td></td></tr><tr><td>M2 בינוני</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>ציטוכלזין B</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>שופר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-נימי זכוכית</td><td>מכשיר סאטר</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>Applichem</td><td>A3830.0100</td><td></td></tr><tr><td>דומונט #5 מלקחיים</td><td>כלים מדעיים&nbsp;</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לאיריס</td><td>כלים מדעיים&nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>מהדק כלי</td> כלים <td>מדעיים עדינים &nbsp;</td><td>18374-43</td><td></td></tr><tr><td>קליפס פצעים&nbsp;</td><td>כלים מדעיים&nbsp;</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>אפליקציות קליפים&nbsp;</td><td>כלים מדעיים&nbsp;</td><td>12018-12</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מספריים&nbsp;</td><td>כלים מדעיים&nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>כלים מדעיים עדינים של</td> <td>Cauterizer</td>&nbsp;<td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>תפרים כירורגיים לא נספגים (אתילון 3-0)</td> <td>אתיקון</td><td>1691H</td><td></td></tr><tr><td>5% CO2 חממה</td><td>MG Scientific</td><td>Galaxy 14S</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6321 000.515</td><td></td></tr><tr><td>הגדרת אלקטרופורזה</td><td>BioRad</td><td>1640300</td><td></td></tr><tr><td>UV Transilluminator</td><td>BioRad</td><td>1708110EDU</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6334000069</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאוסקופי</td><td>אולימפוס</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>2x מיקרומניפולטורים</td><td>Eppendorf</td><td>5188000.012</td><td></td></tr><tr><td>ביציות מניפולטור</td><td>Eppendorf</td><td>5176000.025</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק (Femtojet)</td><td>Eppendorf</td><td>5247000.013</td><td></td></tr><tr><td>עכברים C57BL/6J זן</td><td>Australian BioResources</td><td>C57BL/6JAusb&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך microinjection של ביציות

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

השימוש בעכברים מהונדסים גנטית תרם באופן משמעותי למחקרים על תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים בתהליכי vivo . הזרקת pronuclear של ביטוי דנ&quot;א בונה לתוך ביציות מופרות נשאר הטכניקה הנפוצה ביותר לייצר עכברים מהונדס overexpression. עם כניסתה של טכנולוגיית CRISPR עבור מיקוד גנים, הזרקת pronuclear לתוך ביציות מופרות הורחב לדור של שני נוקאאוט ועכברים נוקין. עבודה זו מתארת ​​את הכנת ה- DNA להזרקה ואת הדור של מדריכים CRISPR עבור מיקוד גנים, עם דגש מיוחד על בקרת איכות. ההליכים הגנוטיפיים הדרושים לזיהוי המייסדים הפוטנציאליים הם קריטיים. אסטרטגיות גנוטיפינג חדשניות המנצלות את יכולות ה&quot;רב-ריבוב &quot;של CRISPR מוצגות כאן. הליכים כירורגיים מתוארים גם. יחד, השלבים של הפרוטוקול יאפשר את הדור של genעכברים מותאמים באופן מהותי עבור הקמתם הבאים של מושבות עכבר עבור שפע של תחומי מחקר, כולל אימונולוגיה, מדעי המוח, סרטן, פיזיולוגיה, פיתוח, ועוד.

להלן, זרימות עבודה עבור microinjection במקרה של אינטגרציה אקראית CRISPR בתיווך גנים מיקוד מתוארים ( איור 1 ). <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" /> איור 1: זרימת עבודה אופיינית עבור הדור של עכברים מהונדסים גנטית. עבור אינטגרציה אקראית, transgene מטוהרים...

Microinjection של ביציות העכבר משמש בדרך כלל עבור transgenesis קלאסי ( כלומר, שילוב אקראי של transgenes) ו CRISPR בתיווך גישור המיקוד. פרוטוקול זה סוקר את ההתפתחויות האחרונות microinjection, עם דגש מיוחד על בקרת איכות אסטרטגיות genotyping.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לתאר את ההליכים הנדרשים ליצירה מוצלחת של עכברים שעברו שינוי גנטי באמצעות מיקרו-הזרקה של ציותות. פרוטוקול זה יכול לסייע לחוקרים ולצוותים טכניים העוסקים הן בתחום יצירת העכברים והן במיקוד גנים (gene targeting). היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מתבססת על הזרקה ישירה לציותות של עכברים, הן עבור שילוב אקראי והן עבור מיקוד גנים, מה שמאפשר יצירה של עכברים שעברו שינוי גנטי תוך ששה שבועות בלבד.להכנת RNA מדריך יחיד, לאחר בחירת שתי רצפי המטרה הרצויים והכנת פריימרים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, סנתזו תבנית DNA ליניארית על ידי דילול של פלסמיד PX330 לריכוז של 10 nanograms per microliter במים נקיים מנוקלאז.הוסיפו מיקרוליטר אחד של PXR330 לכל מבחנה, והריצו את התוכנית הבאה. לאחר מכן, השתמשו בערכת טיהור PCR, במניפולטור (manifold) ובמקור ואקום כדי לטהר את תוצר ה-PCR. הוסיפו חמישה נפחים של תמיסת קישור (binding buffer) לנפח אחד של דגימת ה-PCR וערבבו.הנח את עמודת הספין עם ממбраסת הסיליקון על המניפולד. כדי לקשור את ה-DNA, העבר את כל שמונת הדגימות לעמודה, תחת ואקום. כדי לשטוף את הדגימה, הוסף לעמודה 0.75 milliliters של בופר שטיפה ובצע ואקום.לאחר מכן, סבבו את העמודה בצנטריפוגה במהירות של 12,000 ×g למשך 60 שניות כדי להסיר את שאריות האתנול. העבירו את העמודה למבחנה נקייה מסוג micro ce

generation-genetically-modified-mice-through-microinjection

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

סרטון זה מתאר הזרקה פרו-גרעינית של וקטורים לנטי-ויראליים לתוך החלל הפריביטלי של עובר עכבר מופרה. וירוס הלנטיוירוס מכיל את הטרנסגן, אשר משולב בגנום של העובר המופרי, ובסופו של דבר מוליד עכברים טרנסגניים.

הזרקת פריביטלין מבוססת וקטור לנטיויראלי: שיטה להמרת הגן המעניין לביציות עכבר חד-תאיות מופרות

nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וnucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs) יכול לשמש כדי לשנות את הגנום של עוברי preimplantation עכבר על ידי מפעילה שני סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית מסלולים (HR). מקדמות אלה לאפשר את הדור המהיר של עכברים עם שינויים גנטיים מדויקים.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול mRNA ספציפי בתיווך siRNA אחרי ניתוח immunofluorescence להעריך הרכבה ציר meiotic וארגון בביציות עכבר. פרוטוקול זה מתאים לדלדול במבחנה של תמלילים והערכה תפקודית של ציר שונה ו / או גורמים הקשורים MTOC בביציות.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר loss- ולהשיג-של שיטת הפונקציה כי הוא ישים לזהות neogenin כמו קולטן בשלב ספציפי שמוביל trophectoderm ותא פנימי בידול המונים עוברי עכברים preimplantation.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקדם אינטגרציה transgene וייצור של מייסד העכברים הטרנסגניים עם יעילות גבוהה על ידי זריקה פשוטה של וקטור במרחב perivitelline של oocyte מופרית lentiviral.

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרו-הזרקה של זיגוטה של CRISPR-Cas9 ודנ"א של תורם כדי לייצר ביעילות קלטות גנים ועכברים פלוקסים.

מיקרו-הזרקה של זיגוטה ליצירת קלטות גנטיות ואללים של פלוקס בעכברים

מוצג פרוטוקול אופטימלי המאפשר דלדול של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר במהלך מטאפאזה I באמצעות לייזר פמטו-שניות כמעט אינפרה-אדום.

אבלציה בלייזר רב-פוטונים של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר

פרוטוקול זה מתאר מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה in vivo לעריכת גנום בתיווך קריספר מוגבלת אזורית באובידוקט העכבר.

מודלים של עכברים מהונדסים בגנום סומטי המשתמשים במיקרו-הזרקה ובאלקטרופורציה של Vivo

היעילות של שיטת עריכת הגנום המשופרת באמצעות אספקת חומצות גרעין ביציות (I-GONAD) דומה למיקרו-הזרקה מסורתית, הדורשת איסוף זיגוטה מנקבות תורמות והעברה לנקבות פסאודו-בהריון. פרוטוקול זה מדגים את יעילותו על ידי החדרת מוטציות הנגרמות על ידי CRISPR/Cas9 ללוקוס ROSA26 בכרומוזום 6.

עריכה גנומית משופרת באמצעות חומצות גרעין ביציות מבוססת טכניקת אלקטרופורציה In Vivo ליצירת עכברי נוקאאוט

למדו את שיטת המיקרו-הזרקה ליצירת עכברים מותאמים גנטית דרך הזרקה ישירה לביציות. פרוטוקול זה מסייע לחוקרים בתחום הגנטיקה וההנדסה הגנטית לייצר מודלים חדשים במהירות וביעילות.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

גלה סרטונים נוספים