עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור במהירות עכברים חסרי גנים בעזרת נוקלאזות זנב או טלונים מעוצבים. זה מושג על ידי תכנון והרכבה ראשונים של מבני DNA המקודדים זוגות טלונים ספציפיים, המשמשים כתבניות לשעתוק במבחנה ליצירת mRNAs של טאלון. השלבים הבאים של ההליך הם לבודד ציטים של עכברים מופרים, ולאחר מכן להזריק להם את ה-T.השלב האחרון הוא העברה כירורגית של הציטים המוזרקים לאמהות אומנה בהריון.

צאצאי F zero המתקבלים מראים לעתים קרובות מחיקות ספציפיות לאתר של רצפים גנומיים שמובילות לעתים קרובות לאובדן תפקוד גן המטרה. למרות שהשיטה המוצגת כאן יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד הגנים בעכברים, ניתן להתאים את הגישה הבסיסית גם לאורגניזמים מודלים אחרים כמו חולדות ודגים. ראשית, גש לאתר מכוון הנוקלאוטידים של אפקטור TAL באתר.

בחר את תוכנית המטרה TN והדבק ברצף של גן היעד. לפרוטוקול זה. השתמש ב-P-C-A-G-T שבע מבני ביטוי TALEN ובערכת האפקטור של שער הזהב Talen ו-T הזמינים בגן AD.

אם נעשה שימוש במבנים או ערכות הרכבה אחרים עבור הגדרות ההרכבה של Talen עשויות להיות שונות עבור אורך המרווח האופטימלי ומספר רכבי הפנאי הזנב, בחר באפשרות Miller Etal 2011 תחת ההגדרה השתמש בארכיטקטורה מוגדרת מראש. לאחר מכן בחר NN תחת הכרטיסייה תחליף G. התוכנית יוצרת קובץ טקסט עם אתרי יעד פוטנציאליים שנוצרו מרשימה זו.

בחר את הזוג או הזוגות הנדרשים של טאלן והמשך עם מכלול שער הזהב. פרוטוקול זה עובד עם זני עכברי המעבדה הנפוצים ביותר, כולל C 57 BL, 6 J ו-BDF 10 נקבות תורמות סופר ביוץ בגיל ארבעה שבועות באמצעות הזרקה תוך צפקית של חמש יחידות של גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון. 48 שעות לאחר מכן נותנים לנקבות חמש יחידות של גונדוטרופין כוריוני אנושי גם על ידי הזרקה תוך-צפקית מיד לאחר הזדווגות של הזרקת גונדוטרופין כוריוני אנושי, הנקבות אחת לאחת עם זכרים בגיל הרבייה באותו יום, מכינות את אמהות האומנה ההריוניות המדומה. אחרים.

למחרת בבוקר, הקריבו את הנקבות והחזירו את הביציות המופרות על ידי ניתוח ה-ucts. לאחר מכן שחרר את מצמדי הביציות לתוך צלחת תרבית איברים המכילה מיליליטר של M שני מדיום. הסר את כל תאי הקומולוס על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של תמיסת היאלורונידאז בקר 0.1% לצלחת המכילה מצמדי ציטים ב-M שני מדיום.

לאחר מכן השתמש בפיפטה בפה כדי לשטוף את העוברים באמצעות שניים או שלושה שינויים של M 2 medium כדי להסיר את ההיאלורונידאז. המשך טיפול בהיאלורונידאז לעוברים שעדיין לא התנתקו מתאי קומולוס. ניתן לאחסן את העוברים המבודדים ב-M 16, בינוני ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עד להזרקת מיקרו

הכן 100 מיקרוליטר של תמיסת הזרקה המכילה 10 ננוגרם למיקרוליטר מכל זנב. נוקלאז, mRNA, זוג וצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-30,000 גרם לגלולה. כל חלקיקים שעלולים לסתום את מחטי ההזרקה.

לאחר מכן שמור את התערובת על קרח. תכננו להזריק את הביציות בשלב הפרו-גרעיני שלהן בשעות אחר הצהריים המוקדמות. טבלו כ-100 עוברים ב-M שני מדיום מתחת לשכבת שמן מינרלי ועבדו על מיקרוסקופ הפוך ללא אופטיקה של DIC מרסי.

תחת הגדלה של פי 20, בחר ציטים עם פרו-גרעינים מובחנים. מיון הביציות יכול להיעשות באמצעות עומס נימי הזרקה ריק של נימי ההזרקה רגע לפני השימוש בו עם מיקרוליטר אחד עד שניים מתמיסת ההזרקה. לאחר מכן חבר אותו לראש המיקרו-הזרקה.

לאחר מכן שאפו ציט נבחר עם נימי אחיזה ובצעו הזרקה רדודה של ה-mRNA של הנוקלאז לתוך הציטופלזמה. הימנע ממגע עם הפרוגרעינים. יש לשמור על נפח ההזרקה נמוך.

בסימן הראשון של נפיחות ציטופלזמית, משוך את המחט. בדרך כלל, כ-80 עד 90% מהעוברים אמורים לשרוד ללא המשך מיידי. כדי להגדיל את כמות ה-mRNA המוזרק, הפוך את התמיסה למרוכזת יותר לאחר הזרקת מיקרו של הציטים הזמינים.

העבירו אותם למדיה M 16 באמצעות פיפטה בפה. דגרו על העוברים למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן העבירו את אלה ששרדו לאמהות אומנה בהריון.

יום לפני המיקרו-הזרקה לגרום להריון מדומה ב-CD בן שלושה עד שישה חודשים, עכברה נקבה אחת על ידי הזדווגותן לזכרים מגזרים. למחרת בבוקר בחרו נקבות עם פקק חובה שקוף לשימוש כמקבלי עוברים. נקבות שאינן בשימוש יחזרו ממצב ההריון המדומיין שלהן תוך שלושה שבועות וניתן יהיה לעשות בהן שימוש חוזר לאחר מכן.

מקם נקבת אומנה מורדמת על משטח חם על בטנה. לאחר מכן יש לחטא את אזור החתך על ידי ריסוס באתנול 70%. סרקו את השיער הרטוב הרחק ממקום החתך המתוכנן.

כעת חותכים את חלל הצפק במספריים ומחצינים את קרן הרחם. לשם כך. משוך את כרית השומן המחוברת לשחלה ושיתק את איברי הרבייה בעזרת מהדק בולדוג.

כמו כן, הקפידו לשמור על לחות האיברים עם תמיסת נתרן כלורי מחוממת של 0.9%. בשלב זה, מיין 12 עד 20 עוברים ברי קיימא והעמיס אותם לתוך נימי זכוכית דקים. בעזרת פיפטת הפה שאבו תחילה בועת אוויר קטנה, ולאחר מכן שאפו את העוברים באמצעות מלקחיים עדינים.

אחוז בעדינות ב-UCT ממש במעלה הזרם של המגבר וצור חור קטן בקיר ה-UCT באמצעות מחט בגודל 30. הכנס את הנימים הטעונים לתוך החור ופוצץ בעדינות את העוברים החוצה לתוך המגבר עד שתראה שבועת האוויר נעקרה מהנימים. ואז הסר את הנימים.

החלף מיד את איברי הרבייה בחזרה לחלל הגוף וסגור את חלל הצפק בתפר יחיד. לאחר מכן, סגור את העור באמצעות קליפס פצע אחד או שניים של תשעה מילימטרים. החזירו את החיה לכלוב הביתי שלה והשגיחו עליה עד שההרדמה תפוג.

לאחר מכן שיכנו את הנקבות בקבוצות חברתיות יציבות של שניים עד שלושה עכברים כדי למזער את הלחץ בשלושת הימים הראשונים שלאחר הניתוח, הקפידו לספק משכך כאבים כמו DEF Falcon במי השתייה עבור כל ארבה בגנום העכבר המכוון לנוקלאזות מעצבים. בדיקה מבוססת PCR נועדה לזהות בעלי חיים מייסדים הנושאים אלל מוטנטי רצוי. בדוגמה הראשונה, מייסדים שמקורם במיקרו-הזרקה של זוג נוקלאז זנב.

התמקדות באזור הציפוי של גן חלבון הפריון של העכבר נותחה על ידי עיכול אנדונוקלאז T 7 של מוצר PCR. בדיקת העיכול של T 7 Endonuclease מסתמכת על היווצרות דופלקסים הטרו בין גדילי DNA של מוצרי PCR הנוצרים מאללים מוטנטיים ופראיים. מוטגנזה הנגרמת על ידי טאלון באזור הגנומי הממוקד של מייסדים בודדים התגלתה על ידי הופעתם של 250 ו-110 מוצרי עיכול ארוכים בזוגות בסיסים בנוסף למוצר ה-PCR באורך מלא.

לחלופין, מוצרי PCR יכולים להיות נתונים לתקציר הגבלה אם אתר הגבלת אבחון מתאים ממוקם באזור המרווח של זוג הנוקלאז המעצב. בדוגמה השנייה, ZFN מכוונת לאתר הגבלה של XPO אחד הממוקם בתוך המבוא, אחד ממיקומי העכבר Rosa 26. כאן רצועות לא מעוכלות מצביעות על נוכחות של מוטציות.

סימן הכוכבית, היעדר תוצרים מעוכלים כלשהם מרמז בבירור על מייסד הנושא מוטציות בשני האללים של הגן הממוקד. שיבוט וריצוף של מוצרי PCR לא מעוכלים אלה מגלים כי עכברים מייסדים יכולים להכיל שני שינויים מובהקים או יותר של האלל הממוקד. היעדר רצפים מסוג פרא מעיד על אבלציה מוחלטת של גן המטרה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב את עיצוב נוקלאז הזנב, הרכבת הזנב, מבני נוקלאז, וכיצד להשתמש בהם כדי ליצור עכברים מוטנטיים על ידי מיקרו-הזרקה ישירה של אוזיד. ניתן להתאים שיטה זו לעבודה עם סוגים אחרים של נוקלאזות מעצבים, כגון אבץ, גרעיני אצבעות או CAS nine crispr. זה יכול גם להקל על שינוי הגנום על ידי רקומבינציה הומולוגית באמצעות הזרקה משותפת בו זמנית של הנוקלאז ותבנית מיקוד הגנים המתאימה.