Name: עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: למדו כיצד ליצור עכברים חסרי גנים באמצעות TALENs באמצעות מיקרו-הזרקה לתאי ביצה מופרים והעברה לאמהות אומנות. שיטה זו מאפשרת שינויים גנטיים מדויקים לחקר תפקוד גנים בביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות למוניקה Tarnowska, קורנליה אלברכט, והאווה Skoczylas לקבלת סיוע טכני מעולה. מחקר זה מומן על ידי CRSI33-125,073 מענק SNF Sinergia לPP.

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).</li>
<li>Johansson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+zoo+of+mice+for+genetic+analyses%3A+a+comprehensive+protocol+for+the+rapid+generation+of+BAC+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice.</a> Genesis. 48, 264-280 (2010).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li>
<li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li>
<li>Meyer, M., de Angelis, M. H., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022-15026 (2010).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+integration+in+rat+and+mouse+embryos+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 29, 64-67 (2011).</li>
<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li>
<li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+production+of+mouse+disease+models+by+embryo+microinjection+of+TALENs+and+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3782-3787 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-Step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genetics. 11, 636-646 (2010).</li>
<li>ZFN, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li>
<li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs%3A+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39, (2011).</li>
<li>Reyon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH+assembly+of+TALENs+for+high-throughput+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 30, 460-465 (2012).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nat. Protoc. 7, 171-192 (2012).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+library+of+TAL+effector+nucleases+spanning+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.</a> Nat. Biotechnol. 31, 251-258 (2013).</li>
<li>Schmid-Burgk, J. L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligation-independent+cloning+technique+for+high-throughput+assembly+of+transcription+activator-like+effector+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes.</a> Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).</li>
<li>Hermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+OPEN+zinc+finger+nucleases+for+direct+gene+targeting+of+the+ROSA26+locus+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Evaluation of OPEN zinc finger nucleases for direct gene targeting of the ROSA26 locus in mouse embryos.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Meyer, M., Ortiz, O., Hrabe de Angelis, M., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+disease+mutations+by+gene+targeting+in+one-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modeling disease mutations by gene targeting in one-cell mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 9354-9359 (2012).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011).</li>
<li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li>
<li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+zinc-finger-nuclease+activity+with+improved+obligate+heterodimeric+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures.</a> Nat. Methods. 8, 74-79 (2011).</li>
<li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWefers%2C+B+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22">Current Protocols in Mouse Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Wefers, B., Wurst, W., Kühn, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWefers%2C+B+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22">Current Protocols in Mouse Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Haueter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+vasectomy-overexpression+of+Prm1-EGFP+fusion+protein+in+elongating+spermatids+causes+dominant+male+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic vasectomy-overexpression of Prm1-EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice.</a> Genesis. 48, 151-160 (2010).</li>
<li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Brown, M. T., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+to+the+ROSA26+locus+directed+by+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases.</a> Nucleic Acids Res. 40, 3741-3752 (2012).</li>
<li>Bultmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+transcriptional+activation+of+silent+oct4+pluripotency+gene+by+combining+designer+TALEs+and+inhibition+of+epigenetic+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5368-5377 (2012).</li>
<li>Valton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+TALE+DNA+binding+domain+sensitivity+to+cytosine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Overcoming TALE DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation.</a> J. Biol. Chem. 287, 38427-38432 (2012).</li>
<li>Cradick, T. J., Ambrosini, G., Iseli, C., Bucher, P., McCaffrey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN-Site+searches+genomes+for+zinc+finger+nuclease+target+sites+and+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">ZFN-Site searches genomes for zinc finger nuclease target sites and off-target sites.</a> BMC Bioinform. 12, (2011).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li>
<li>Byers, S. L., Payson, S. J., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+ten+inbred+mouse+strains+following+assisted+reproductive+technologies+%28ARTs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs).</a> Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superovulation+strategies+for+6+commonly+used+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Animal+Sci%22%5BJournal%5D)">Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains.</a> J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22International+Society+for+Transgenic+Technologies.+Advanced+protocols+for+animal+transgenesis+%3A+an+ISTT+manual%22">International Society for Transgenic Technologies. Advanced protocols for animal transgenesis : an ISTT manual</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-Guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים מתחרים.

גישות עריכת מעצב מונע nuclease הגנום הרחיבו באופן משמעותי את מגוון מינים ניתנים לשינויים ממוקדים של הגנום שלהם 10,12. בעכברים, בתאי גזע עובריים גן המיקוד כבר טכניקה סטנדרטית ליותר משני עשורים; עם זאת, היא הוכיחה קשה להסתגל לתאי גזע עובריים ממינים אחרים מאשר העכבר, למרות שיש כבר כמה הצלחה האחרונה בתאי גזע עובריים חולדה. אפילו עם הזמינות של שיבוטים &quot;ה-off-המדף&quot; ממוקד גן העכבר ES תא הניתנים על ידי קונסורציומים כגון EUCOMM, KOMP, או 3 NorCOMM עריכת הגנום ידי ZFN וTalen מספק דיוק וגמישות בנושא הספקטרום של שינויים שיכולים להיות גבוהים יותר הציג לתוך גנום העכבר. נראות חיות מייסד נושאות מוטציות בתיווך nuclease להיות ניבט קו מאוד 4-6,20,21 המוסמכים, וזה לא תמיד במקרה של מפלצות שמקורם זריקות הבלסטוציסט של תאי גזע עובריים. לפיכך, במקרים מסוים של microinjection desnucleases igner יכול לגרום לדור מהיר יותר באופן משמעותי של קווי עכבר רומן עם שינויי הגנום ממוקדים. הדור המוצלח של עכברים בנוקאאוט על ידי הזרקה של ZFN וTalen תלוי במידה רבה על פעילותם של זוג nuclease המוזרק. TALENs הוכחו יש שיעור הצלחה גבוה במיקוד מגוון רחב של גנים במספר אורגניזמים; עם זאת, מחקרים שנערך לאחרונה מצביעים על כך שTalen מחייב רגיש למתילציה ציטוזין 30,31. לכן, זוגות nuclease שנוצרו זה עתה, למשל TALENs משובטים לתוך וקטורי pCAG-T7, ניתן transfected transiently לקו תא עכבר כגון NIH-3T3 או נוירו -2a, המחקה את מצב הכרומטין של עובר העכבר במידה מסוימת. כאן, פעילות nuclease ניתן להעריך באמצעות assay endonuclease T7 או לעכל הגבלה של המוצר ה-PCR כאמור בסעיף 5 לפני סינתזת ה-mRNA וmicroinjection. אנו ממליצים רצף של האזור הגנומי של עניין בכבודive קו סלולרי וזן העכבר המשמש לניסויי microinjection. בzygotes עכבר, זוגות Talen או ZFN שונים יעבדו בצורה אופטימלית בריכוזים ה-mRNA שונים, ולכן ריכוז העבודה האופטימלי של ה-mRNA nuclease microinjected יצטרך להיקבע באופן ניסיוני. בהתאם לזוג nuclease, נמוך מדי ריכוז יגרום שום מחשוף ואילו גבוהים מדי יכול לגרום הקטלניות עובר. בהתאם לזוג nuclease, יש לנו הצלחה באמצעות ריכוזי mRNA כולל נמוכים כמו 2 ng / μl וגבוה ככל 200 מיקרוגרם / ul. תופעות אלה הן קשות לחיזוי מניסויים בתרבית תאים והריכוז האופטימלי nuclease עבור שתי הישרדות העובר ושיעור שינוי של מוקד היעד צריך להיקבע באופן אמפירי. ZFN מאוד פעיל או Talen יכול לבקע רצף היעד שלהם מעבר לשלב אחד התא של עובר microinjected ובכך לגרום דפוסים מורכבים של mutagenesisפסיפס ד במקימים. אנו ואחרים 4 הבחנו שלושה או יותר אללים מוטציה מובחנים במייסד יחיד (איור 5 ג). לכן, כאשר הקמת קו עכבר חדש ממייסדים אלה, צאצאים צריכים להיות מוקרנים בזהירות על ידי רצף לנוכחות של המוטציה החיובית מאז מבחני עיכול לספק ראיות היחידה שמוטציה לא מוגדרת היא הווה. אחת הביקורות שהושמע נגד לעתים קרובות מערכות ZFN וTalen היא האפשרות כי nucleases אלה הם גם מסוגל ביקוע רצפי הווה במקום אחר בגנום הדומים לאתרי היעד. כגון השפעות מחוץ היעד כבר נצפו עם ריאגנטים דור מוקדם באמצעות תחום FokI homodimeric, ומבני heterodimer נועדו להקל על תופעות מחוץ יעד 25. ניתן לחזות באתרים מחוץ היעד פוטנציאליים במידה מסוימת בסיליקו 32,33 והוקרנו על ידי PCR וסדר. O יתרון ברורו באמצעות ZFNs וTALENs ליצירת עכברים ולא שורות תאים הוא האפשרות של הסרת ממוטציות היעד לא צמודות לשינוי הגנום רצוי על ידי ביצוע כמה הכלאות לאחור לזן פראי סוג של בחירה. לניתוח של מספר רב של עכברי מייסד, רצף עמוק של הדור הבא של מוצרי ה-PCR שנוצרו מהלוקוס ממוקד nuclease וסיליקו חזו מחוץ יעד לוקוסים עשויים להציע קריאת נתונים איכותיות וכמותית חלופה למבחני העיכול של מוצרי ה-PCR. טכניקות רבייה בסיוע מתוארות בפרוטוקול זה מותאמות לזני עכבר סטנדרטיים המשמשים לניסויי microinjection כגון C57BL/6J או B6D2F1. עכברים של מקורות שונים, כגון זני outbred, יכולים בעיקרון לשמש לגישות עריכת הגנום ועשויים לספק רקע גנטי מתאים יותר לשאלות מחקר ספציפיות. הביצועים של טכניקות רבייה בסיוע כגון superovulation יכולים להיות predicted למספר הזנים 34-36 אבל עשוי לדרוש אופטימיזציה נוספת לזנים סטנדרטיים על מנת לקבל מספר מספיק של עוברים לmicroinjection nuclease. חוץ מZFN וTalen, nucleases המעצב החדש כגון מערכת CRISPR/Cas9 מודרך RNA 9,37,38 יש עכשיו כבר הציג עבור יישומי עריכת הגנום. כל השיטות לmicroinjection וניתוח של בעלי החיים מייסד המתוארים כאן תקפות גם לCRISPR/Cas9 ומצבים עתידיים של עריכת הגנום.

עכברים הם ללא ספק הפלטפורמה הפופולרית ביותר ליצירת מודלים של בעלי חיים מהונדסים. ארגז הכלים תכליתיים להנדסה גנטית של עובר עכבר 1-3 הורחב לאחרונה על ידי גישות עריכת הגנום מבוססות על nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFN) 4-6, nucleases שעתוק כמו activator-מפעיל (Talen) 7,8, וחוזר התקבצו interspaced באופן קבוע הקצר palindromic (CRISPR) / מערכת (CAS) 9 הקשורים CRISPR 9. ZFN ותפקוד Talen כזוגות של שני תחומים מותאמים במיוחד המבוסס על חלבון קושר DNA (מערכים של חלבוני אצבע אבץ וחזור משתנה di-שאריות (RVDs), בהתאמה), שכל אחד מהם מצמידים את endonuclease FokI 10-12. לעומת זאת, את הספציפיות של מחשוף ה-DNA בתיווך Cas9 מסופקת על ידי transactivating RNAs CRISPR (crRNA וtracrRNA, אשר יכול גם להיות משולב לתוך מולקולת RNA chimeric בודדת RNA מדריך כינה) 11 הפועלים בקומפלקס עםחלבון CRISPR. TALENs עם רצף מוגדר של RVDs ניתן לבנות במהירות על ידי הנסיינים בודדים עם שפע של אסטרטגיות הרכבה לבחירה 13-17. CRISPR/Cas9 מבטיח דור עתיר עבודה אפילו פחות מnucleases המעצב, לעומת זאת את הספציפיות של מדריך RNA-DNA מחייב עדיין לא נפתרו לחלוטין 18,19. דור של ZFNs המותאם אישית עד כה היה מוגבל למעבדות אקדמיות ומקצועיות לספקים מסחריים כגון Sangamo Biosciences ושירות Sigma CompoZr. באופן כללי, הגנום עריכה עם nucleases מעצב מטרתו החדרת הפסקות גדיל כפולים (DSB) בלוקוסים הגנומי מוגדרים, אשר לאחר מכן למשוך סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) או רקומבינציה הומולוגית מנגנונים 10,12 (HR) תיקון DNA. תיקון תיווך NHEJ של DSB לעתים קרובות תוצאות במבוא של הוספות ומחיקות בסמיכות לאתר של תיקון. תיקון ג וכך NHEJניתן לנצל ללדפוק את הפונקציה של גן מטרה על ידי החדרת מוטציה מסגרת משמרת בתוך 4,7,9 רצף מקודד חלבוני גנים. לחלופין, תוספת או החלפה של מידע גנטי מוגדרים יכולה להיות מושגת על ידי מתן תורם DNA ביחד עם nucleases המעצב. תורם ה-DNA מורכב מרצפי DNA-נועד חוקר מוקף אזורים של הומולוגיה עם מוקד היעד, ובכך משמשים כתבנית לתיקון DSB על ידי משאבי אנוש. פלסמידים שני 5,6,20 וoligonucleotides חד גדילי 8,9,21 שימשו בהצלחה כתורמים. לא NHEJ-ולא עריכת הגנום בתיווך משאבי אנוש דורש את ההקדמה של סמן לבחירה לתוך הגנום של עובר העכבר, מה שהופך את האסטרטגיות האלה גם מתאימות במיוחד ליצירת שינויים קטנים ברצף נוקליאוטידים מבלי להפריע הארכיטקטורה הגנטית בכללותה. בפרוטוקול זה אנו מתארים את כל הליכים החיוניים לעריכת הגנום בעובר עכבר באמצעות TALENs. אלה כוללים 1) זיהוי של אתר יעד Talen 22, 2) הבנייה של TALENs ידי שיבוט שער זהב 13, 3) סינתזה במבחנה של Talen-mRNA, 4) microinjection של Talen mRNA לביציות מופרות עכבר, 5) ניתוחים לעוברים , וניתוח של mutagenesis-Induced Talen בבעלי חיים מייסד 6). אנו מתמקדים בmicroinjection Talen mRNA והקרנה של מייסדים להוספות / מחיקות-Induced NHEJ. לשם כך יש לנו שנוצרו מבני Talen bifunctional המאפשרים גם ביטוי בתאי יונקים כאשר transfected כפלסמידים ובסינתזת מבחנה של Talen mRNA עבור microinjection לעוברי עכבר. מבנים אלה מהווים את עמוד השדרה לסיפור קטוע 23 התמזגו FokI heterodimeric תחומים 24,25 לעריכת הגנום אופטימלית בתאי יונקים. פרוטוקול זה גם יכול להיות מאומץ לmicroinjection של nucleases מעצב האחר, או לזריקות בשילוב של nucleases המעצבומבנים תורמים (עיצוב של תורמי DNA תואר בפרסומים טכניים מעולים על ידי Wefers et al. 26,27). הצהרה אתית כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות של משרד וטרינרית Cantonal של קנטון ציריך.

<table><tbody><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535S או L</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S או L</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma</td><td>S0692-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>נוקלאז בטוח לפלסמיד</td><td></td><td>Epicentre E3101K</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep ספין Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN פלסמיד Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>NucAway עמודות ספין</td><td>Invitrogen</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax Formaldyde עומס צבע</td><td>Invitrogen</td><td>AM8552</td><td></td></tr><tr><td>RNA סמני מילניום</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE מאגר</td><td>Thermo Scientific</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>T7 endonuclease</td><td>NEB</td><td>M0302S או L</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T EasyVector System I</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I כתם ג'ל חומצת גרעין</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>סוסה בהריון&#039; s גונדוטרופין בסרום (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td></td></tr><tr><td>גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG)</td><td>Sigma</td><td>CG5</td><td></td></tr><tr><td>M2 מדיום תרבית עובר</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 מדיום תרבית עובר</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי, נבדק בעובר</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>CentraVet</td><td>Ket 201</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46995</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>ציוד/כלים</חזק</td></tr><tr><td>>מיקרוסקופ הפוך עם אופטיקה Nomarski DIC (לדוגמה Nikon Eclipse TE200)</td><td>יחידות</td> מיקרומניפולטור של Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>(לדוגמה Narishige, NT88NF)</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embryo מחזיק נימים</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>נימי הזרקת עוברים</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>חולץ נימי (למשל Sutter P97)</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge (למשל Narishige MF-900)</td>מספריים לעור <td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Walton</td><td>FST</td><td>14077-10</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>FST</td><td>14041-10</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה כירורגית</td><td>FST</td><td>10140-03</td><td></td></tr><tr><td>מערכת קליפ פצע רפלקס (9 מ"מ)</td><td>FST</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>תפסי פצע רפלקס (9 מ"מ)</td><td>FST</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים של דומונט 5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים מוריה</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים של מוריה</td><td>FST</td><td>11399-80</td><td></td></tr><tr><td>מהדק בולדוג דיטריך</td><td>FST</td><td>18038-45</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J עכברי</td><td>ג'קסון לאבס</td><td>קוד זן 000664</td><td></td></tr><tr><td>עכברי CD-1</td> קוד זן <td>צ'ארלס ריבר</td><td>000664</td><td></td></tr></tbody></table>

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

עכברים הטרנסגניים ביצוע שינויים ספציפי באתר הגנום (נוקאאוט, לדפוק ב) הם בעלי חשיבות חיונית ללנתח מערכות ביולוגיות מורכבות, כמו גם לדוגמנות מחל אנושיות ובדיקת אסטרטגיות טיפוליות. ההתקדמות שחלה באחרונה בשימוש בnucleases המעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs), nucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs), וחוזר palindromic הקצר interspaced באופן קבוע באשכולות (CRISPR) / מערכת (CAS) הקשורים CRISPR 9 לאתר הנדסת הגנום ספציפית לפתוח את האפשרות לבצע שינוי הגנום ממוקד מהיר כמעט בכל מיני מעבדה, ללא הצורך להסתמך על גזע עוברי טכנולוגיית תא (ES). ניסוי עריכת הגנום בדרך כלל מתחיל עם זיהוי של אתרי יעד nuclease מעצב בתוך גן של עניין ואחרי הבנייה של תחומים-DNA מחייבת מותאמים אישית כדי לכוון את פעילות nuclease למוקד גנומית המוגדר על ידי החוקר. פלסמידים nuclease מעצב הם במבחנה &lt;/ Em&gt; עיבד ליצירת ה-mRNA לmicroinjection של ביציות מופרות בעכבר. כאן, אנו מספקים פרוטוקול להשגת שינוי הגנום ממוקד על ידי הזרקה ישירה של Talen mRNA לביציות מופרות בעכבר.

אנו נבנו פלסמידים יעד תואמים את ההרכבה גולדן GateTALEN פורסמה על ידי צ&#39;רמאק et al. 13 המאפשרים ביטוי של TALENs בתאי יונקים, כמו גם סינתזת ה-mRNA במבחנה מאמרגן הפאג T7 (תרשים 1C). פלסמידים אלה נושאים תחומים heterodimeric FokI (מוטציות ELD או KKR) אשר הוכחו כדי להפחית את ההשפעות מחוץ היעד ביחס לhomodimers FokI וכדי לשפר את פעילות מחשוף בהשוואה לדור הראשון FokI heterodimers 25,29. תגובת הרכבה שער זהב # 1 # 2 הם בדרך כלל יעיל מאוד וכל לבן מושבה, כאשר נותח על ידי המושבה PCR, מציגה את הדפוס הצפוי למספר המסוים של RVDs המשובט (איורים 1B ו 1D). ניתוח של ג&#39;ל במבחנה mRNA מסונתז (איור 2) צריך לחשוף להקה להבחין יחידה עם כתם קטן או לא עבור כל מדגם ניתח. לא צריך להיות שינוי בגודל ברור בין דגימות L1/R1 וL2/R2, L3/R3, אשר מציין polyadenylation המוצלח. בעלי חיים מייסד יכולים להיות מוקרנים ל- Induced NHEJ אללים מוטציה באמצעות גנוטיפ PCR ואחריו גם עיכול endonuclease T7 (איור 3) או לעכל הגבלה באמצעות אנזים המסלק את הרצף מהסוג בר בתוך אזור spacer של צמד nuclease (איור 4). Assay endonuclease T7 הוא ישים לכל סוג של מוטציה ללא התחשבות ברצף הגנומי הספציפי בתוך אזור spacer של צמד nuclease הזריק; עם זאת, הוא מזהה חוסר התאמה רק בין גדילי דנ&quot;א במוצרי ה-PCR heteroduplex. לפיכך, במקרה הנדיר שמייסד נושא שני אללים מוטציה זהה, מוצרי ה-PCR לא מראים שום דפוס עיכול T7. הבחנה כזו היא, לעומת זאת, תמיד אפשרית כאשר אתר הגבלה ספציפי ממוקם בתוך אזור spacer nuclease שיבוטל על ידי NHEJמושרה הוספות / מחיקות (איור 5). הנה, להקות מעוכלים להעיד על הנוכחות של מוטציות, והעדר כל מוצרים מתעכלים מצביע בצורה חזקה מייסד נושא מוטציות בשני אללים של הגן הממוקד (מסומן בכוכביות באיור 4). <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> איור 1. שיבוט שער זהב של RVDs Talen לתוך וקטורי pCAG-T7-יעד heterodimeric.) אסיפה של מערכי RVD לוקטורי pFUS. כאן מוצגת דוגמא לזוג Talen עם מערכים לסיפור אישיים הכוללים 15 RVDs ו17 RVDs, בהתאמה (עבור מערכים לסיפור ארוכים יותר מ21 RVDs, שלוש אסיפות pFUS-RVDs נדרשות, לא מוצגות). חצים מצביעים על פריימרים לpFUS ספציפי PCR תגובות המושבה. מוצרי B) PCRמוגבר של מכלולי pFUS נכונים בדרך כלל יופיע להקה מקבילה לאורך המשולב של כל משובט RVDs (למשל סביב 1.1 kb ל10 RVDs) וC &quot;הסולם&quot; של להקות פחות בולטות קטנות יותר בשל האופי חוזר ונשנה של מערכי RVD.) הרכבה סופית של מערכי pFUS-RVD ופלסמיד המכיל חוזר האחרון (PLR) לוקטורי ביטוי heterodimeric Talen עם גרסאות FokIELD וFokIKKR, בהתאמה. עמוד השדרה Talen (המבואר כN ו-C) דומה לארכיטקטורה שפורסמה על ידי מילר ואח&#39;. 23 אמרגן CAG (אלמנט משפר מוקדם CMV / עוף ביתא אקטין) מבטיח רמות ביטוי גבוה בתאי יונקים transfected, בעוד אמרגן הפאג T7 מאפשר ב סינתזת המבחנה mRNA (להשתמש SACI לינאריזציה של הווקטור במורד הזרם של קודון STOP nuclease). ד) המושבה PCR באמצעות פריימרים מסומנים על ידי חצים בC) מאפשר זיהוי של TALENs התאסף בצורה נכונה. מלא lengtמוצרי h-PCR הם לעתים קרובות פחות בולטים בזמן &quot;אפקט הסולם&quot; מייצג אינדיקטור חזק של הרכבה מוצלחת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> איור 2. . בקרת איכות nuclease mRNA בסינתזת מבחנה באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose mRNAs ZFN מוצג כדוגמא (L, עזב ZFN; R, ZFN מימין). דוגמאות L1/R1 להראות mRNA לפני polyadenylation, דגימות מופע L2/R2 polyadenylated mRNA וL3/R3 להראות mRNA polyadenylated מטוהר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img<html> alt = &quot;איור 3&quot; עבור: תוכן width = &quot;6in&quot; עבור: רוחב src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg&quot; = &quot;600&quot; /&gt; איור 3. דוגמא של assay endonuclease T7 המשמש לזיהוי של בעלי חיים מייסד נושאים מוטציות הנגרם nuclease של מוקד היעד. א) זוג Talen נועד לבקע בתוך אזור הקידוד של גן חלבון פריון העכבר (Prnp, רצף יעד Talen יכול להיות מסופק על פי דרישה). מוצר ה-PCR מופק באמצעות פריימר קדימה (F) ממוקם 110 נ&quot;ב במעלה הזרם ופריימר הפוכה (R) 250 נ&quot;ב במורד הזרם של אתר המחשוף Talen. ב &#39;) המוצר ה-PCR הוא נתון בהמשך לheteroduplex היווצרות ועיכול endonuclease T7. C) mutagenesis-Induced Talen בתוך אזור גנומי הממוקד של מייסדים אחת מתגלה על ידי הנוכחות של מוצר ה-PCR באורך מלא עם מוצרי עיכול של 250 ו110 bps.50930/50930fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> איור 4. דוגמא לתקציר הגבלה של מוצרי ה-PCR משמשים לזיהוי של בעלי חיים מייסד נושאים מוטציות הנגרם nuclease של מוקד היעד. ספציפי ZFN למוקד היעד 29 העכבר Rosa26 אתר הגבלת XbaI בתוך אינטרון 1. מייסדים) הוקרנו על ידי genotyping-PCR באמצעות פריימר קדימה (F) ממוקם 500 נ&quot;ב במעלה הזרם ופריימר הפוכה (R) 250 נ&quot;ב במורד הזרם של אתר המחשוף. ב &#39;) עיכול של מוצרי ה-PCR עם XbaI מגלה דפוסי עיכול מצביעים על עכברים עם מוטציות דו allelic (מסומנים בכוכביות), מונו -Allelic מוטציות (להקות מעוכלות והבלתי מעוכלים, למשל בעלי חיים 2)סידור ועכברי WT (עיכול שלם, למשל בעלי החיים 21). C) של עכברים עם שינויים דו allelic פוטנציאל מראה עד 3 (בעלי חיים 24 הוספות / מחיקות) מובחנות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של פריימר </td><td> רצף 5 &#39;ל 3&#39; </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr><tr><td> TAL_Seq_5-1 </td><td> catcgcgcaatgcactgac </td></tr></tbody></table> טבלת 1. רצפים של צבעי יסוד המשמש לPCRs מושבה ורצף בתוך מכלול שער זהב Talenפרוטוקול. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פלסמיד / אוסף </td><td> תורם </td><td> Addgene מזהה </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שער זהב Talen וטל Effector ערכת 2.0 </td><td> מעבדה Voytas </td><td> 1000000024 </td><td> מכיל את כל פלסמידים הדרושים להרכבת שער זהב Talen </td></tr><tr><td> וקטורי יעד pCAG-T7-Talen -KKR/ELD </td><td> מעבדה פלזר </td><td> 40,131, 40132 </td><td> Add-on פלסמידים לביטוי Talen בתאי יונקים ובסינתזת ה-mRNA במבחנה </td></tr></tbody></table> טבלה 2. ניתן להשיג פלסמידים ואוספי פלסמיד הנדרשים להרכבת שער זהב Talen מAddgene <a href="http://www.addgene.org">(www.addgene.org).</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> באינטרנטמשאב </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> http://tale-nt.cac.cornell.edu </td><td> עיצוב של Talen; תחזית מחוץ יעד Talen </td></tr><tr><td> http://zifit.partners.org/ZiFiT/ </td><td> עיצוב של Talen, OPEN ZFN, קודה ZFN, CRISPR/Cas9 </td></tr><tr><td> http://www.genome-engineering.org </td><td> עיצוב של Talen, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 חיזוי מחוץ היעד </td></tr><tr><td> http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html </td><td> הרכבה של Talen רצפים לאישור תוצאות רצף </td></tr><tr><td> http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html </td><td> עיצוב של ההרכבה מודולרי ZFN </td></tr><tr><td> www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware </td><td> עיצוב של ההרכבה מודולרי ZFN </td></tr></tbody></table> לוח 3. משאבים מקוונים לעיצוב ZFN, Talen, וCRISPR/Cas9. </sטרונג&gt;

nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וnucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs) יכול לשמש כדי לשנות את הגנום של עוברי preimplantation עכבר על ידי מפעילה שני סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית מסלולים (HR). מקדמות אלה לאפשר את הדור המהיר של עכברים עם שינויים גנטיים מדויקים.

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור במהירות עכברים חסרי גנים בעזרת נוקלאזות זנב או טלונים מעוצבים. זה מושג על ידי תכנון והרכבה ראשונים של מבני DNA המקודדים זוגות טלונים ספציפיים, המשמשים כתבניות לשעתוק במבחנה ליצירת mRNAs של טאלון. השלבים הבאים של ההליך הם לבודד ציטים של עכברים מופרים, ולאחר מכן להזריק להם את ה-T.השלב האחרון הוא העברה כירורגית של הציטים המוזרקים לאמהות אומנה בהריון.צאצאי F zero המתקבלים מראים לעתים קרובות מחיקות ספציפיות לאתר של רצפים גנומיים שמובילות לעתים קרובות לאובדן תפקוד גן המטרה. למרות שהשיטה המוצגת כאן יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד הגנים בעכברים, ניתן להתאים את הגישה הבסיסית גם לאורגניזמים מודלים אחרים כמו חולדות ודגים. ראשית, גש לאתר מכוון הנוקלאוטידים של אפקטור TAL באתר.בחר את תוכנית המטרה TN והדבק ברצף של גן היעד. לפרוטוקול זה. השתמש ב-P-C-A-G-T שבע מבני ביטוי TALEN ובערכת האפקטור של שער הזהב Talen ו-T הזמינים בגן AD.אם נעשה שימוש במבנים או ערכות הרכבה אחרים עבור הגדרות ההרכבה של Talen עשויות להיות שונות עבור אורך המרווח האופטימלי ומספר רכבי הפנאי הזנב, בחר באפשרות Miller Etal 2011 תחת ההגדרה השתמש בארכיטקטורה מוגדרת מראש. לאחר מכן בחר NN תחת הכרטיסייה תחליף G. התוכנית יוצרת קובץ טקסט עם אתרי יעד פוטנציאליים שנוצרו מרשימה זו.בחר את הזוג או הזוגות הנדרשים של טאלן והמשך עם מכלול שער הזהב. פרוטוקול זה עובד עם זני עכברי המעבדה הנפוצים ביותר, כולל C 57 BL, 6 J ו-BDF 10 נקבות תורמות סופר ביוץ בגיל ארבעה שבועות באמצעות הזרקה תוך צפקית של חמש יחידות של גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון. 48 שעות לאחר מכן נותנים לנקבות חמש יחידות של גונדוטרופין כוריוני אנושי גם על ידי הזרקה תוך-צפקית מיד לאחר הזדווגות של הזרקת גונדוטרופין כוריוני אנושי, הנקבות אחת לאחת עם זכרים בגיל הרבייה באותו יום, מכינות את אמהות האומנה ההריוניות המדומה. אחרים.למחרת בבוקר, הקריבו את הנקבות והחזירו את הביציות המופרות על ידי ניתוח ה-ucts. לאחר מכן שחרר את מצמדי הביציות לתוך צלחת תרבית איברים המכילה מיליליטר של M שני מדיום. הסר את כל תאי הקומולוס על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של תמיסת היאלורונידאז בקר 0.1% לצלחת המכילה מצמדי ציטים ב-M שני מדיום.לאחר מכן השתמש בפיפטה בפה כדי לשטוף את העוברים באמצעות שניים או שלושה שינויים של M 2 medium כדי להסיר את ההיאלורונידאז. המשך טיפול בהיאלורונידאז לעוברים שעדיין לא התנתקו מתאי קומולוס. ניתן לאחסן את העוברים המבודדים ב-M 16, בינוני ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עד להזרקת מיקרו.הכן 100 מיקרוליטר של תמיסת הזרקה המכילה 10 ננוגרם למיקרוליטר מכל זנב. נוקלאז, mRNA, זוג וצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-30,000 גרם לגלולה. כל חלקיקים שעלולים לסתום את מחטי ההזרקה.לאחר מכן שמור את התערובת על קרח. תכננו להזריק את הביציות בשלב הפרו-גרעיני שלהן בשעות אחר הצהריים המוקדמות. טבלו כ-100 עוברים ב-M שני מדיום מתחת לשכבת שמן מינרלי ועבדו על מיקרוסקופ הפוך ללא אופטיקה של DIC מרסי.תחת הגדלה של פי 20, בחר ציטים עם פרו-גרעינים מובחנים. מיון הביציות יכול להיעשות באמצעות עומס נימי הזרקה ריק של נימי ההזרקה רגע לפני השימוש בו עם מיקרוליטר אחד עד שניים מתמיסת ההזרקה. לאחר מכן חבר אותו לראש המיקרו-הזרקה.לאחר מכן שאפו ציט נבחר עם נימי אחיזה ובצעו הזרקה רדודה של ה-mRNA של הנוקלאז לתוך הציטופלזמה. הימנע ממגע עם הפרוגרעינים. יש לשמור על נפח ההזרקה נמוך.בסימן הראשון של נפיחות ציטופלזמית, משוך את המחט. בדרך כלל, כ-80 עד 90% מהעוברים אמורים לשרוד ללא המשך מיידי. כדי להגדיל את כמות ה-mRNA המוזרק, הפוך את התמיסה למרוכזת יותר לאחר הזרקת מיקרו של הציטים הזמינים.העבירו אותם למדיה M 16 באמצעות פיפטה בפה. דגרו על העוברים למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן העבירו את אלה ששרדו לאמהות אומנה בהריון.יום לפני המיקרו-הזרקה לגרום להריון מדומה ב-CD בן שלושה עד שישה חודשים, עכברה נקבה אחת על ידי הזדווגותן לזכרים מגזרים. למחרת בבוקר בחרו נקבות עם פקק חובה שקוף לשימוש כמקבלי עוברים. נקבות שאינן בשימוש יחזרו ממצב ההריון המדומיין שלהן תוך שלושה שבועות וניתן יהיה לעשות בהן שימוש חוזר לאחר מכן.מקם נקבת אומנה מורדמת על משטח חם על בטנה. לאחר מכן יש לחטא את אזור החתך על ידי ריסוס באתנול 70%. סרקו את השיער הרטוב הרחק ממקום החתך המתוכנן.כעת חותכים את חלל הצפק במספריים ומחצינים את קרן הרחם. לשם כך. משוך את כרית השומן המחוברת לשחלה ושיתק את איברי הרבייה בעזרת מהדק בולדוג.כמו כן, הקפידו לשמור על לחות האיברים עם תמיסת נתרן כלורי מחוממת של 0.9%. בשלב זה, מיין 12 עד 20 עוברים ברי קיימא והעמיס אותם לתוך נימי זכוכית דקים. בעזרת פיפטת הפה שאבו תחילה בועת אוויר קטנה, ולאחר מכן שאפו את העוברים באמצעות מלקחיים עדינים.אחוז בעדינות ב-UCT ממש במעלה הזרם של המגבר וצור חור קטן בקיר ה-UCT באמצעות מחט בגודל 30. הכנס את הנימים הטעונים לתוך החור ופוצץ בעדינות את העוברים החוצה לתוך המגבר עד שתראה שבועת האוויר נעקרה מהנימים. ואז הסר את הנימים.החלף מיד את איברי הרבייה בחזרה לחלל הגוף וסגור את חלל הצפק בתפר יחיד. לאחר מכן, סגור את העור באמצעות קליפס פצע אחד או שניים של תשעה מילימטרים. החזירו את החיה לכלוב הביתי שלה והשגיחו עליה עד שההרדמה תפוג.לאחר מכן שיכנו את הנקבות בקבוצות חברתיות יציבות של שניים עד שלושה עכברים כדי למזער את הלחץ בשלושת הימים הראשונים שלאחר הניתוח, הקפידו לספק משכך כאבים כמו DEF Falcon במי השתייה עבור כל ארבה בגנום העכבר המכוון לנוקלאזות מעצבים. בדיקה מבוססת PCR נועדה לזהות בעלי חיים מייסדים הנושאים אלל מוטנטי רצוי. בדוגמה הראשונה, מייסדים שמקורם במיקרו-הזרקה של זוג נוקלאז זנב.התמקדות באזור הציפוי של גן חלבון הפריון של העכבר נותחה על ידי עיכול אנדונוקלאז T 7 של מוצר PCR. בדיקת העיכול של T 7 Endonuclease מסתמכת על היווצרות דופלקסים הטרו בין גדילי DNA של מוצרי PCR הנוצרים מאללים מוטנטיים ופראיים. מוטגנזה הנגרמת על ידי טאלון באזור הגנומי הממוקד של מייסדים בודדים התגלתה על ידי הופעתם של 250 ו-110 מוצרי עיכול ארוכים בזוגות בסיסים בנוסף למוצר ה-PCR באורך מלא.לחלופין, מוצרי PCR יכולים להיות נתונים לתקציר הגבלה אם אתר הגבלת אבחון מתאים ממוקם באזור המרווח של זוג הנוקלאז המעצב. בדוגמה השנייה, ZFN מכוונת לאתר הגבלה של XPO אחד הממוקם בתוך המבוא, אחד ממיקומי העכבר Rosa 26. כאן רצועות לא מעוכלות מצביעות על נוכחות של מוטציות.סימן הכוכבית, היעדר תוצרים מעוכלים כלשהם מרמז בבירור על מייסד הנושא מוטציות בשני האללים של הגן הממוקד. שיבוט וריצוף של מוצרי PCR לא מעוכלים אלה מגלים כי עכברים מייסדים יכולים להכיל שני שינויים מובהקים או יותר של האלל הממוקד. היעדר רצפים מסוג פרא מעיד על אבלציה מוחלטת של גן המטרה.לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב את עיצוב נוקלאז הזנב, הרכבת הזנב, מבני נוקלאז, וכיצד להשתמש בהם כדי ליצור עכברים מוטנטיים על ידי מיקרו-הזרקה ישירה של אוזיד. ניתן להתאים שיטה זו לעבודה עם סוגים אחרים של נוקלאזות מעצבים, כגון אבץ, גרעיני אצבעות או CAS nine crispr. זה יכול גם להקל על שינוי הגנום על ידי רקומבינציה הומולוגית באמצעות הזרקה משותפת בו זמנית של הנוקלאז ותבנית מיקוד הגנים המתאימה.

mouse-genome-engineering-using-designer-nucleases

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אישית CompoZr אבץ אצבעות nuclease (ZFN) שירות המאפשר עריכת הגנום מדויקת כל אורגניזם או קו תאים על כל מוקד מוגדר על ידי המשתמש. מאמר זה מתאר את תהליך האימות, עיצוב, ייצור ויישום של שירות מותאם אישית ZFN CompoZr.

הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs)

CRISPR/Cas9 היא מערכת חזקה ליצירת שיבוש של גנים ואלמנטים גנטיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירה יעילה של מחיקות גנומיות בשורות תאים של יונקים באמצעות CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

עריכת גנום של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולה להיעשות במהירות וביעילות. מוצג כאן הליך ניסיוני חזק להנדסה גנטית של hPSCs כפי שמודגם על ידי עריכת מיקום נמל המבטחים AAVS1 כדי לבטא EGFP ולהציג עמידות לאנטיביוטיקה.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

Microinjection של ביציות העכבר משמש בדרך כלל עבור transgenesis קלאסי ( כלומר, שילוב אקראי של transgenes) ו CRISPR בתיווך גישור המיקוד. פרוטוקול זה סוקר את ההתפתחויות האחרונות microinjection, עם דגש מיוחד על בקרת איכות אסטרטגיות genotyping.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

CRISPR-Cas היא טכנולוגיה רבת עוצמה להנדס הגנום מורכבים של צמחים ובעלי חיים. כאן, אנחנו פירוט נוהל לעריכת ביעילות הגנום האנושי באמצעות endonucleases רשויות אישורים שונים. אנחנו מדגישים שיקולים חשובים ופרמטרים עיצוב כדי למטב את יעילות העריכה.

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

כאן, אנו מציגים שיטה ששונתה עבור הקפאת הזמנות של עוברי תא אחד, כמו גם פרוטוקול כי זוגות השימוש של עוברים הקפאת להקפיא ואלקטרופורציה עבור הדור היעיל של עכברים מהונדסים גנטית.

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרו-הזרקה של זיגוטה של CRISPR-Cas9 ודנ"א של תורם כדי לייצר ביעילות קלטות גנים ועכברים פלוקסים.

מיקרו-הזרקה של זיגוטה ליצירת קלטות גנטיות ואללים של פלוקס בעכברים

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

היעילות של שיטת עריכת הגנום המשופרת באמצעות אספקת חומצות גרעין ביציות (I-GONAD) דומה למיקרו-הזרקה מסורתית, הדורשת איסוף זיגוטה מנקבות תורמות והעברה לנקבות פסאודו-בהריון. פרוטוקול זה מדגים את יעילותו על ידי החדרת מוטציות הנגרמות על ידי CRISPR/Cas9 ללוקוס ROSA26 בכרומוזום 6.

עריכה גנומית משופרת באמצעות חומצות גרעין ביציות מבוססת טכניקת אלקטרופורציה In Vivo ליצירת עכברי נוקאאוט

גישות ניסויית כדי הנדסת רקמות

למדו כיצד ליצור עכברים חסרי גנים באמצעות TALENs באמצעות מיקרו-הזרקה לתאי ביצה מופרים והעברה לאמהות אומנות. שיטה זו מאפשרת שינויים גנטיים מדויקים לחקר תפקוד גנים בביולוגיה.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

גלה סרטונים נוספים