Name: ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: למדו לזהות פוספורילציות מרובות בחלבונים לא תקינים מהותיים באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית. שיטה זו מדגימה זיהוי אתרים ספציפיים בחלבון Tau וקישור לשינויים מבניים ותפקודיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מתקני התמ"ג מומנו על ידי Région Nord, CNRS, מכון פסטר של ליל, הקהילה האירופית (FEDER), משרד המחקר הצרפתי והאוניברסיטה למדעים וטכנולוגיות של ליל. אנו מודים לתמיכה מ-TGE RMN THC (FR-3050, צרפת), FRABio (FR 3688, צרפת) ומתקן הליבה של ליל NMR ו-RPE Health and Biology. המחקר שלנו נתמך על ידי מענקים מ-LabEx (מעבדת מצוינות), DISTALZ (פיתוח אסטרטגיות חדשניות לגישה טרנסדיסציפלינרית למחלת אלצהיימר), EU ITN TASPPI ו-ANR BinAlz.

למחברים אין מה לחשוף.

השתמשנו ספקטרוסקופיה NMR לאפיין דגימות טאו שונות enzymatically. ביטוי רקומביננטי והטיהור המתוארת כאן עבור חלבון טאו אדם באורך מלא יכולים לשמש באופן דומה כדי לייצר מוטצית טאו או תחומי טאו. Isotopically חלבון מועשר נדרשת ספקטרוסקופיה NMR, דבר המחייב ביטוי רקומביננטי. זיהוי של אתרי זירחון דורש הקצאת תהודה ו 15 N, 13 C כפליים חלבון הנקרא. בהתחשב בעלות של איזוטופים, תשואה טובה נדרשת בשלב ביטוי רקומביננטי. גלוקוז הוא הגורם המגביל את התפתחות חיידקים במדיום M9 ולכן ב...

אחד האתגרים העיקריים של שירותי בריאות במאה ה -21 הם מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD). טאו הוא חלבון הקשורים-microtubule שמגר microtubule היווצרות (MT). טאו מעורב באותה מידה בכמה הפרעות ניווניות, tauopathies שנקרא, מתוכם את הטוב ביותר הידוע הוא לספירה. בהפרעות אלה, אגרגטים עצמיים טאו בחוטי סליל לזווג (PHFs) והוא נמצא שונה על שאריות רבות על ידי שינויי posttranslational (PTMs) כגון זרחון 1. זירחון של חלבון טאו הוא מעורב בשני הסדרת תפקודו הפיזיולוגי של ייצוב MT ואובדן פתולוגית של פונקציה המאפיינת נוירונים לספירה. יתר על כן, חלבון טאו, כאשר משולבים PHFs בנוירונים חולה, ללא יוצא מן הכלל הוא hyperphosphorylated 2. בניגוד טאו רגיל המכיל 2-3 קבוצות פוספט, את טאו hyperphosphorylated ב PHFs מכיל 5 עד 9 phosphatקבוצות דואר 3. Hyperphosphorylation של טאו תואמת הן לעלייה של stoichiometry בכמה אתרים כדי זירחון של אתרים נוספים שנקראים אתרי פתולוגית של זירחון. עם זאת, קיימת חפיפה בין AD ודפוסים מבוגרים נורמלים של זירחון, למרות הבדלים כמותיים ברמה 4. איך פונקצית השפעה ספציפית אירועי זירחון לבין תפקוד לקוי של טאו נותר ברובה לא ידוע. אנו שואפים לפענח תקנת טאו ידי PTMs ברמה המולקולרית. כדי להעמיק את ההבנה של ההיבטים המולקולריים של טאו, אנחנו צריכים להתמודד עם אתגרים טכניים. ראשית, טאו הוא חלבון סדר מהותי (IDP) כאשר מבודדים בתמיסה. חלבונים כאלה חסרי מבנה תלת ממדי מוגדר היטב גם במצב רגיל וגם דורשים שיטות biophysical בפרט ללמוד תפקידם (ים) ו תכונות מבניות. טאו היא פרדיגמה עבור המעמד ההולך וגדל של עקורים, נמצא לעתים קרובות קשורפתולוגיות כגון מחלות ניווניות, ומכאן גברת העניין כדי להבין את הפרמטרים המולקולריים שבבסיס תפקידיהם. שנית, אפיון של זירחון טאו הוא אתגר אנליטי, עם 80 אתרי זירחון פוטנציאל לאורך הרצף של איזופורם טאו 441 חומצות אמיניות הארוכה. מספר הנוגדנים פותח כנגד אפיטופים פוספורילציה של טאו ומשמש לצורך זיהוי של טאו פתולוגי בנוירונים או רקמת המוח. אירועי זירחון יכולים להתקיים ב -20 אתרים לפחות על כוונת של קינאזות מכוונת פרולין, רובם בסמיכות בתוך אזור פרולין העשיר. טיבה האיכותי (אילו אתרים?) וכמוני (מה ורכב?) אפיון קשה אפילו על ידי טכניקות MS האחרונות 5. ספקטרוסקופיה NMR יכול לשמש כדי לחקור חלבונים סדר כי הם מערכות דינמיות מאוד היוו של הרכבים של conformers. ספקטרוסקופיה NMR ברזולוציה גבוהה הייתה applied לחקור הן המבנה והתפקוד של חלבון טאו. בנוסף, את המורכבות של פרופיל זירחון של טאו הובילו לפיתוח של כלים מולקולריים ושיטות אנליטיות חדשות באמצעות NMR לזיהוי אתרי זירחון 6 - 8. תמ&quot;ג כשיטת אנליטיים מאפשר זיהוי של אתרי זירחון טאו באופן גלובלי, ויזואליזציה של כל השינויים באתר יחיד בניסוי יחיד, וכימות של היקף ההתאגדות פוספט. נקודה זו חיונית שכן למרות שמחקרים זירחון על טאו בשפע בספרות, רובם בוצעו עם נוגדנים, משאיר מידה רבה של אי-ודאות לגבי הפרופיל המלא של זרחון ובכך את ההשפעה האמיתית של אירועי זירחון פרט. קינאזות רקומביננטי כולל PKA, 3β קינאז גליקוגן-synthase (Gsk3β), A 2 / cyclin קינאז Cyclin התלוי (CDK2 / CycA), קינאז תלוי-ציקלין 5 (CDK5) / מעשה p25<html> חלבון ivator, קינאז התאי מוסדרת-אות 2 (ERK2) ו microtubule-זיקה-ויסות קינאז (MARK), אשר ניכר פעילות זירחון כלפי טאו, ניתן להכין בצורה פעילה. בנוסף, מוטציות טאו המאפשרות יצירת isoforms חלבון טאו ספציפי עם דפוסי זירחון היטב מאופיינים משמשות לפענח את קוד זירחון של טאו. ספקטרוסקופיה NMR מכן נעשה שימוש כדי לאפיין דגימות טאו שונה enzymatically 6 - 8. למרות במבחנה זירחון של טאו הוא יותר מאתגר מאשר-זירחון פסאודו כגון על ידי מוטציה של הנבחרת שירו / Thr לחומצה גלוטמית (Glu) שאריות, גישה זו יש לגופו. ואכן, לא פרמטרי ההשפעה ולא אינטראקציה המבניות של זירחון ניתן חיקה תמיד על ידי חומצות גלוטמית. דוגמה לכך היא המוטיב בתורו נצפה סביב phosphoserine 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205), אשר אינו משוחזר עם Glu מוטציות 9. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; כאן, הכנת טאו שכותרתו isotopically לחקירות NMR יתואר ראשון. חלבון טאו פוספורילציה ידי ERK2 הוא שונה באתרים רבים מתוארים באתרי פתולוגית של זירחון, ובכך מייצג מודל מעניין של טאו hyperphosphorylated. פרוטוקול מפורט של טאו בזירחון במבחנה על ידי קינאז ERK2 רקומביננטי מוצג. ERK2 מופעל על ידי זירחון על ידי קינאז חלבון מופעל mitogen / קינאז ERK (MEK) 10 - 12. בנוסף ההכנה שונה, שכותרתו isotopically חלבון טאו, אסטרטגית NMR המשמשת לזיהוי של PTMs מתוארת.

<table><tbody><tr><td>pET15B ביטוי רקומביננטי T7 פלסמיד</td><td>Novagen</td><td>69257</td><td>שמור על -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>BL21 (DE3) טרנספורמציה מוכשרת E. coli חיידקים</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>C2527I</td><td>שמור על -80 מעלות; C</td></tr><tr><td>מרק LB חיטוי, לנוקס&nbsp;</td><td>DIFCO</td><td>240210</td> משלים ויטמין MEM <td>בינוני לגידול חיידקים</td></tr><tr><td>100x</td><td>Sigma</td><td>58970C</td><td>תוסף גידול חיידקים בינוני</td></tr><tr><td>15N, 13C-ISOGRO אבקה בינונית שלמה</td><td>Sigma</td><td>608297</td><td>תוסף גידול חיידקים בינוני</td></tr><tr><td>15NH4Cl</td><td>סיגמא</td><td></td><td>299251 איזוטופ</td></tr><tr><td>13C6-Glucose</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מעכבי פרוטאז איזוטופים&nbsp;</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td>לשמור על 4 מעלות; </td></tr><tr><td>טבליה C 1 ב-1 מ"ל היא תמיסה פי 40 שניתן לשמור בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>EUROMEDEX</td><td>1307</td><td>שמור על -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>הומוגנייזר (EmulsiFlex-C3)</td> <td>AVESTIN</td><td></td><td>Lysis מתממש ב-4 מעלות; סי</td></tr><tr><td>פירס וסחר; חלבון לא מוכתם MW</td><td>Marker Pierce</td><td>266109</td><td></td></tr><tr><td>קינאז MEK1 אנושי פעיל, GST Tagged</td><td>Sigma</td><td>M8822</td><td>יש לשמור בטמפרטורה של -80 &deg; C</td></tr><tr><td>AKT&Auml; מערכת כרומטוגרפיה טהורה</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>HiTrap SP Sepharose FF (עמודה של 5 מ"ל)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5156-01</td><td>עמודות כרומטוגרפיה להחלפת קטיון</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 התפלת</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5087-01</td><td>עמודת התפלת חלבון</td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-08</td><td>עמודת התפלת חלבון</td></tr><tr><td>Tris D11, 97% D</td><td>Cortecnet</td><td>CD4035P5</td><td>Deuterated NMR buffer</td></tr><tr><td>5 מ"מ מיקרו-צינור סימטרי SHIGEMI D2O (סט של 5 צינורות פנימיים וחיצוניים)&nbsp;</td><td>Euriso-top</td><td>BMS-005B</td><td>NMR Shigemi</td></tr><tr><td>Tubes eVol ערכת מתנע מזרק אלקטרוני</td><td>Cortecnet</td><td>2910000</td><td>Pipetting</td></tr><tr><td>Bruker 900 MHz AvanceIII עם בדיקה קריוגנית תהודה משולשת</td><td>Bruker NMR ספקטרומטר לרכישת נתונים</td><td>Bruker</td><td></td></tr><tr><td>600 MHz Avance עם בדיקה קריוגנית תהודה משולשת</td><td>ספקטרומטר NMR Bruker</td><td></td><td></td> לרכישת נתונים</tr><tr><td>TopSpin 3.1</td><td>Bruker</td><td></td><td>תוכנת רכישה ועיבוד לניסויי NMR</td></tr><tr><td>Sparky 3.114</td><td>UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)</td><td></td> <td>תוכנת ניתוח נתוני NMR</td></tr></tbody></table>

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

אגרגטים של חלבון הטאו העצבי נמצאים בתוך נוירונים של חולי אלצהיימר. התפתחות המחלה מלווה בזרחון מוגבר וחריג של טאו. במהלך החקירה המולקולרית של תפקודי טאו ותפקודים לקויים במחלה, נעשה שימוש בספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) לזיהוי הזרחונים המרובים של טאו. אנו מציגים כאן פרוטוקולים מפורטים של ייצור רקומביננטי של טאו בחיידקים, עם העשרה איזוטופית למחקרי תמ"ג. מתוארים שלבי טיהור המנצלים את יציבות החום והנקודה האיזואלקטרית הגבוהה של Tau. הפרוטוקול לזרחון במבחנה של טאו על ידי ERK2 מופעל רקומביננטי מאפשר יצירת זרחונים מרובים. דגימת החלבון מוכנה לאיסוף נתונים בנושא שלבים אלה. הגדרת הפרמטר להתחלת הקלטה בספקטרומטר נחשבת הבאה. לבסוף, מוסברת האסטרטגיה לזיהוי אתרי זרחון של טאו שונה, המבוססת על נתוני NMR. נדון היתרון של מתודולוגיה זו בהשוואה לטכניקות אחרות המשמשות לזיהוי אתרי זרחון, כגון זיהוי חיסוני או ספקטרומטריית מסה (MS).

איור 3 א מציג שיא ספיג גדול ב 280 ננומטר שנצפו במהלך שיפוע elution. שיא זה מתאים חלבון טאו מטוהרים כפי שניתן לראות על ג&#39;ל acrylamide מעל הכרומתוגרמה. איור 3 ב מציג לשיא ספיגה מופרד היטב ב 280 ננומטר שיא של מוליכות, להבטיח כי desalting של החלבון הוא יעיל. איור 4 מראה ג&#39;ל משמרת חלבון נצפתה על ידי SDS-PAGE ניתוח 16 מאפיין של זרחון חלבון המרובה (להשוות מסלולים 2 ו -3). איור 6 מציג סדרה של פרוטון (1 H) ספקטרום...

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי זרחונים מרובים של חלבון לא מסודר באופן מהותי על ידי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), תוך שימוש בחלבון טאו כמקרה מבחן. טאו רקומביננטי מועשר איזוטופית ושונה במבחנה על ידי קינאז לפני איסוף הנתונים וניתוחם.

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לזהות זרחון מרובה של חלבון לא מסודר באופן מהותי על ידי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית באמצעות חלבון טאו כמקרה מבחן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בוויסות מולקולרי הקשור למחלות, כגון השפעת הזרחן על האינטראקציה של החלבון עם בן זוגו המולקולרי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לזהות זרחון ספציפי לאתר בחלבון לא מסודר ולקשר אותו לשינויים מבניים ותפקודיים.שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הפונקציה. ניתן ליישם אותו גם על חלבונים אחרים כגון השרידים המופרעים של חלבון ה- DNA מנגיף aPtc היישומים של טכניקה זו משתרעים לכיוון טיפול על ידי פיתוח מעכבי אינטראקציה חלבונית וחלבון. שיטה זו תודגם על ידי קלמנט דניס, קלמנט דספרס, לואיזה בסה וחמידה מרזוגי, תלמידי הדוקטורט מהקבוצה שלנו.כדי להתחיל, ערבבו בעדינות 50 מיקרוליטר של תאי BL21 מוכשרים עם 100 ננוגרם של DNA פלסמיד, ויוצרים 10 עד 15 מיליון מושבות למיקרוגרם של DNA פלזמה בצינור פלסטיק של 1.5 מיליליטר. לאחר הנחת תערובת התאים על קרח למשך 30 דקות, יש לחשמל אותה בחום למשך 10 שניות בחום של 42 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הנח את הצינור בחזרה על קרח למשך חמש דקות לפני הוספת מיליליטר אחד של טמפרטורת החדר לוריא ברטאני או מדיום LB.דגרו את תרחיף החיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת תסיסה עדינה. בעזרת מפזר, מורחים 100 מיקרוליטר מתרחיף התאים באופן שווה על צלחת אגר של מדיום LB המכילה 100 מיקרוגרם למיליליטר של אנטיביוטיקה אמפיצילין. דגרו את צלחת הבחירה למשך 15 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, יש להמיס 300 מיליגרם של מדיום מועשר בחנקן 15 ופחמן 13, גרם אחד של חנקן 15 אמוניום כלוריד ושני גרם של פחמן 13 עם תווית גלוקוז ב-10 מיליליטר של מדיום M9. מסנן לעקר את תמיסת האיזוטופ ישירות למדיום M9 באמצעות מסנן 0.2 מיקרון. באמצעות פיפטת פסטר השעו מושבה אחת של חיידקי הפלזמה הרקומביננטית שהפכו מלוח הבחירה ב-20 מיליליטר של מדיום LB, בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.דגרו את המדיום המחוסן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כשש שעות. מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר או OD600 באמצעות מיליליטר אחד של דילול פי עשרה של תרבית חיידקים בקוביית ספקטרומטר פלסטיק. לאחר מכן, הוסף 20 מיליליטר מתרבית ה-LB הרוויה לליטר אחד של מדיום גידול M9 בתוספת אמפיצילין בבקבוק תרבית מבולבל מזכוכית ארלנמאייר של שני ליטר.הניחו את בקבוק התרבות בחממה ניתנת לתכנות המוגדרת ל-10 מעלות צלזיוס ו-50 סל"ד. תכנת את החממה לעבור ל-200 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס מוקדם בבוקר למחרת. מדוד את ה-OD600 על מיליליטר אחד של תרבית חיידקים בקוביית ספקטרומטר פלסטיק.הוסף 400 מיקרוליטר של תמיסת מלאי IPTG טוחנת אחת כאשר ה-OD600 מגיע לערך של כ-1.0 כדי לגרום לביטוי של חלבון טאו רקומביננטי. לאחר הדגירה של תאי החיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות נוספות, אספו אותם על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 5,000 פעמים גרם למשך 20 דקות. הפשירו את כדור התא החיידקי והשעו אותו מחדש ביסודיות ב-45 מיליליטר של מאגר חילופי קטיונים A, בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז 1x DNasel 1.לשבש את תאי החיידקים באמצעות הומוגנייזר בלחץ גבוה ב-20,000 PSI, יש צורך בשלושה עד ארבעה מעברים כדי לשבש את התאים כראוי. צנטריפוגה את התאים המופרעים ב-20,000 פעמים גרם למשך 40 דקות כדי להסיר את החומר הבלתי מסיס. מחממים את תמצית תאי החיידק למשך 15 דקות בחום של 75 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים.משקעים לבנים ייצפו לאחר מספר דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את התמצית המחוממת ב-15,000 פעמים גרם למשך 20 דקות ושמרו על הסופרנטנט המכיל את חלבון הטאו היציב בחום. לאחר מכן, בצע כרומטוגרפיה של חילופי קטיון על שרף CEX חזק ארוז כעמודת מיטה של 5 מיליליטר באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבונית מהירה.הגדר את קצב הזרימה על 2.5 מיליליטר לדקה ואזן את העמודה במאגר CEX A. לאחר מכן, טען את תמצית הטאו המחוממת של 60 עד 70 מיליליטר באמצעות משאבת דגימה, אסוף את הזרימה לניתוח כדי לוודא שחלבון הטאו נקשר ביעילות לשרף. שטפו את השרף עם מאגר CEX A עד שהספיגה ב-280 ננומטר תחזור לערך הבסיסי.תכנת את ה-FPLC עם שיפוע של עד 25% מאגר CEX B בנפחי 10 עמודות כדי להגיע ל-250 מילי-מולרי נתרן כלורי. עקוב אחר זה עם מאגר 50% CEX B בחמישה נפחי עמודות כדי להגיע לנתרן כלורי של 500 מילי-מולרי. לבסוף, הגדל את השיפוע ל-100% מאגר CEX B בשני נפחי עמודות כדי להגיע לנתרן כלורי מולארי אחד.אסוף שברים של 1.5 מיליליטר במהלך שלבי הפליטה. לאחר מכן, בצע חילופי מאגר ב-tau המכיל שברים מאוגדים. איזון עמוד התפלה עם מצע ארוז שרף G25 בנפח 53 מיליליטר במאגר אמוניום ביקרבונט 15 מילי-מולרי באמצעות מערכת FPLC.הגדר את קצב הזרימה לחמישה מיליליטר לדקה והזריק את דגימת הטאו על העמודה באמצעות לולאת הזרקה של חמישה מיליליטר. אסוף את השברים המתאימים לשיא הספיגה ב -280 ננומטר. אסוף את כל שברי הטאו לפני הקצאת הדגימה לצינורות.בחר צינורות אלה כך שנפח התמיסה יהיה קטן בהשוואה לנפח הצינור. לאחר מכן, נקבו חורים במכסי הצינור באמצעות מחט לפני הקפאת דגימות הטאו במינוס 80 מעלות צלזיוס לליופיליזציה מאוחרת יותר. מסיס ארבעה מיליגרם של חנקן 15 מועשר בפחמן 15 ופחמן 13 טאו זרחני ב-400 מיקרוליטר של מאגר NMR.הוסף חמישה אחוזים תחמוצת דאוטריום לנעילת שדה של ספקטרומטר ה-NMR ו-TMSP מילי-מולרי אחד כהתייחסות לאות NMR פנימי. כמו כן, הוסף 10 מיקרוליטר מתמיסת מלאי 40 EK של קוקטייל מעכב פרוטאז שלם. העבירו את הדגימה בצינור NMR של חמישה מיליליטר באמצעות מזרק אלקטרוני עם מחט ארוכה או באמצעות פיפטה פסטר.סגור את צינור ה-NMR באמצעות הבוכנה. הסר את כל בועות האוויר הכלואות בין הבוכנה לנוזל על ידי הזזת הבוכנה. הנח את צינור ה-NMR בספינר.השתמש במד המתאים כדי להתאים את מיקומו האנכי בספינר כך שרוב תמיסת הדגימה תהיה בתוך סליל ה-NMR. לאחר מכן, התחל את זרימת האוויר במכשיר ה-NMR על ידי לחיצה על הרמה בחלון מערכת בקרת המגנט. הנח בזהירות את הספינר עם הצינור בזרימת האוויר בחלק העליון של קדח המגנט.לאחר מכן עצור את זרימת האוויר ותן לצינור לרדת למקומו בתוך ראש הגשושית בתוך המגנט. לאחר מתן אפשרות לדגימה להתאזן ל-25 מעלות צלזיוס, הקלד ATMM בשורת הפקודה כדי לבצע כוונון והתאמה חצי אוטומטיים של ראש הבדיקה כדי לייעל את העברת הכוח. לאחר מכן לחץ על נעילה בחלון מערכת בקרת המגנט כדי להפעיל את נעילת תדר השדה של הספקטרומטר.התחל את הליך ה-shimming כדי לייעל את ההומוגניות של השדה המגנטי במיקום הדגימה על ידי הקלדת TopShim GUI תחילה בשורת הפקודה כדי לפתוח את חלון ה-shim. לאחר מכן לחץ על התחל בחלון ה-shim. בדוק את סטיית התקן הנותרת B0 כדי לוודא שה-shims אופטימליים.לאחר מכן, כייל את הפרמטר P1, שהוא אורך דופק תדר רדיו פרוטון במיקרו-שניות. פרמטר זה הכרחי כדי להשיג סיבוב של 90 מעלות של מגנטיזציה של ספין פרוטון. כוונו לפולס של 360 מעלות באמצעות ספקטרום חד מימדי של פרוטוני מים.כוונן את היסט התדר על ידי הגדרת הפרמטר O1 לתדר מי הפרוטונים בספקטרום החד-ממדי. לבסוף, התחל ברכישת ספקטרום פרוטונים חד מימדי על ידי הקלדת ZG בשורת הפקודה. תוצאה מייצגת של טיהור טאו רקומביננטי מראה שיא ספיגה משמעותי ב-280 ננומטר שנצפה במהלך שיפוע הפליטה.שיא זה מתאים לחלבון טאו מטוהר כפי שניתן לראות בג'ל האקרילאמיד מעל הכרומטוגרמה. הכרומטוגרמה להתפלת הטאו המטוהר הרקומביננטי מראה כי שיא הספיגה ב-280 ננומטר ושיא המוליכות מופרדים היטב ומבטיחים שהתפלת החלבון יעילה לשלב הליופיליזציה. ספקטרום ה-NMR החד-ממדי של חנקן רקומביננטי 15 טאו ב-900 מגה-הרץ מאשר שניתן לזהות אות NMR מדגימת החלבון.יחס אות לרעש טוב מצביע על כך שפרמטרי הרכישה הבסיסיים הוגדרו כהלכה. הספקטרום הדו-ממדי של החלבון הזרחני מראה רזולוציה טובה, התהודה צרה ומופרדת היטב. התהודה באזור הספקטרום המקופס באדום תואמת את השאריות הזרחניות.לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להיות מסוגל לייצר חלבון רקומביננטי עם תיוג קל לבחירה, לטהר את החלבון הזה ולהגדיר את הפרמטר הבסיסי לרכישת נתוני ספקטרום. לאחר שליטה, ניתן לבצע פרוטוקול זה תוך שבועיים אם הוא מאורגן כראוי. אל תשכח שספקטרוסקופיה של NMR משתמשת במגנטים חזקים מאוד שאסור להתקרב אליהם עם חפצים מתכתיים.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי חלבונים אחרים אלה רגישים לליזה של פרוטאז ויש לנקוט במספר אמצעי זהירות כדי למנוע את השפלת הדגימה. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות כמו NMR במצב מוצק כדי לחקור את האגרגטים דמויי העמילואיד שנוצרים לעתים קרובות על ידי חלבונים לא מסודרים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה הכימית לחקור תרכובות פעילות בעלות פוטנציאל סרפטי במערכות מודל מבחנה.

nuclear-magnetic-resonance-spectroscopy-for-identification-multiple

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מדגים את השימוש בטכניקות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) כדי לזהות זרחונים מרובים בחלבון. הזרחן של חלבון בחומצת אמינו ספציפית גורם להסרת ההגנה של מימן אמיד השכן, אשר יוצר את ההבדל הספקטרלי.

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית לזיהוי זרחונים מרובים בחלבונים

אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור והאפיון של קומפלקסי חלבוני צמח. אנו מראים כי על ידי immunoprecipitating חלבון יחיד בתוך מתחם, כדי שנוכל לזהות לאחר translational השינויים שלה והשותפים באינטראקציה שלה.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

מבחני תחרות פפטיד נמצאים בשימוש נרחב במגוון של ניסויים מולקולריים וחיסונית. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת עבור המבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ואת הליכי אימות הקשורים, אשר עשוי להיות שימושי כדי למצוא אתרי זרחן ספציפיים.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

מבנים של חלבון סופרא מולקולרית הרכבות ברזולוציה אטומית הם רלוונטיות גבוהה בשל התפקידים מכריע שלהם במגוון רחב של תופעות ביולוגיות. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה על הרכבות לא מסיסים, הבלתי גבישי החלבון macromolecular על-ידי קסם-זווית ספינינג ספקטרוסקופיה של מצב מוצק תהודה מגנטית גרעינית (MAS SSNMR).

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) מופעל בשלב G2 של מחזור התא, מסדיר משעולים הסלולר רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להצפנה assay קינאז במבחנה עם Cdk1, אשר מאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 להקמת מטרות תאיות של קינאז חשוב.

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

מוצג פרוטוקול ליישום ספקטרוסקופיית NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית לזיהוי אינטראקציות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות חלשות וחולפות בחלבונים בעלי אי-סדר מהותי.

שיפור הרפיה פאראמגנטית לאיתור ואפיון אסוציאציות עצמיות של חלבונים לא מסודרים במהותם

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנת דגימה וניתוח נתונים לכימות זרחון חלבונים באמצעות מבחן משיכה משופר של מולקולה בודדת כלפי מטה (SiMPull).

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעשרת פוספטזות פוספופרוטאין אנדוגניות והחלבונים המתקשרים ביניהן מתאים ורקמות וזיהוי וכימות שלהם על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) יכולה לאפיין דינמיקה מבנית של חלבונים באופן ספציפי לשאריות. אנו מספקים פרוטוקול מעשי להקלטת NMR 15N R1 ו- R2 הרפיה ו {1H}-15N אפקט Overhauser הטרוגרעיני (hetNOE), רגיש לפיקושניות לציר הזמן של ננו-שניות.

NMR 15N ניסויי הרפיה לחקר דינמיקה מבנית של פיקו-שנייה עד ננו-שניות של חלבונים

למדו לזהות פוספורילציות מרובות בחלבונים לא תקינים מהותיים באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית. שיטה זו מדגימה זיהוי אתרים ספציפיים בחלבון Tau וקישור לשינויים מבניים ותפקודיים.

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

גלה סרטונים נוספים