ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לזהות זרחון מרובה של חלבון לא מסודר באופן מהותי על ידי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית באמצעות חלבון טאו כמקרה מבחן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בוויסות מולקולרי הקשור למחלות, כגון השפעת הזרחן על האינטראקציה של החלבון עם בן זוגו המולקולרי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לזהות זרחון ספציפי לאתר בחלבון לא מסודר ולקשר אותו לשינויים מבניים ותפקודיים.

שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הפונקציה. ניתן ליישם אותו גם על חלבונים אחרים כגון השרידים המופרעים של חלבון ה- DNA מנגיף aPtc היישומים של טכניקה זו משתרעים לכיוון טיפול על ידי פיתוח מעכבי אינטראקציה חלבונית וחלבון. שיטה זו תודגם על ידי קלמנט דניס, קלמנט דספרס, לואיזה בסה וחמידה מרזוגי, תלמידי הדוקטורט מהקבוצה שלנו.

כדי להתחיל, ערבבו בעדינות 50 מיקרוליטר של תאי BL21 מוכשרים עם 100 ננוגרם של DNA פלסמיד, ויוצרים 10 עד 15 מיליון מושבות למיקרוגרם של DNA פלזמה בצינור פלסטיק של 1.5 מיליליטר. לאחר הנחת תערובת התאים על קרח למשך 30 דקות, יש לחשמל אותה בחום למשך 10 שניות בחום של 42 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הנח את הצינור בחזרה על קרח למשך חמש דקות לפני הוספת מיליליטר אחד של טמפרטורת החדר לוריא ברטאני או מדיום LB.

דגרו את תרחיף החיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת תסיסה עדינה. בעזרת מפזר, מורחים 100 מיקרוליטר מתרחיף התאים באופן שווה על צלחת אגר של מדיום LB המכילה 100 מיקרוגרם למיליליטר של אנטיביוטיקה אמפיצילין. דגרו את צלחת הבחירה למשך 15 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, יש להמיס 300 מיליגרם של מדיום מועשר בחנקן 15 ופחמן 13, גרם אחד של חנקן 15 אמוניום כלוריד ושני גרם של פחמן 13 עם תווית גלוקוז ב-10 מיליליטר של מדיום M9. מסנן לעקר את תמיסת האיזוטופ ישירות למדיום M9 באמצעות מסנן 0.2 מיקרון. באמצעות פיפטת פסטר השעו מושבה אחת של חיידקי הפלזמה הרקומביננטית שהפכו מלוח הבחירה ב-20 מיליליטר של מדיום LB, בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.

דגרו את המדיום המחוסן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כשש שעות. מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר או OD600 באמצעות מיליליטר אחד של דילול פי עשרה של תרבית חיידקים בקוביית ספקטרומטר פלסטיק. לאחר מכן, הוסף 20 מיליליטר מתרבית ה-LB הרוויה לליטר אחד של מדיום גידול M9 בתוספת אמפיצילין בבקבוק תרבית מבולבל מזכוכית ארלנמאייר של שני ליטר.

הניחו את בקבוק התרבות בחממה ניתנת לתכנות המוגדרת ל-10 מעלות צלזיוס ו-50 סל"ד. תכנת את החממה לעבור ל-200 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס מוקדם בבוקר למחרת. מדוד את ה-OD600 על מיליליטר אחד של תרבית חיידקים בקוביית ספקטרומטר פלסטיק.

הוסף 400 מיקרוליטר של תמיסת מלאי IPTG טוחנת אחת כאשר ה-OD600 מגיע לערך של כ-1.0 כדי לגרום לביטוי של חלבון טאו רקומביננטי. לאחר הדגירה של תאי החיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות נוספות, אספו אותם על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 5,000 פעמים גרם למשך 20 דקות. הפשירו את כדור התא החיידקי והשעו אותו מחדש ביסודיות ב-45 מיליליטר של מאגר חילופי קטיונים A, בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז 1x DNasel 1.

לשבש את תאי החיידקים באמצעות הומוגנייזר בלחץ גבוה ב-20,000 PSI, יש צורך בשלושה עד ארבעה מעברים כדי לשבש את התאים כראוי. צנטריפוגה את התאים המופרעים ב-20,000 פעמים גרם למשך 40 דקות כדי להסיר את החומר הבלתי מסיס. מחממים את תמצית תאי החיידק למשך 15 דקות בחום של 75 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים.

משקעים לבנים ייצפו לאחר מספר דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את התמצית המחוממת ב-15,000 פעמים גרם למשך 20 דקות ושמרו על הסופרנטנט המכיל את חלבון הטאו היציב בחום. לאחר מכן, בצע כרומטוגרפיה של חילופי קטיון על שרף CEX חזק ארוז כעמודת מיטה של 5 מיליליטר באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבונית מהירה.

הגדר את קצב הזרימה על 2.5 מיליליטר לדקה ואזן את העמודה במאגר CEX A. לאחר מכן, טען את תמצית הטאו המחוממת של 60 עד 70 מיליליטר באמצעות משאבת דגימה, אסוף את הזרימה לניתוח כדי לוודא שחלבון הטאו נקשר ביעילות לשרף. שטפו את השרף עם מאגר CEX A עד שהספיגה ב-280 ננומטר תחזור לערך הבסיסי.

תכנת את ה-FPLC עם שיפוע של עד 25% מאגר CEX B בנפחי 10 עמודות כדי להגיע ל-250 מילי-מולרי נתרן כלורי. עקוב אחר זה עם מאגר 50% CEX B בחמישה נפחי עמודות כדי להגיע לנתרן כלורי של 500 מילי-מולרי. לבסוף, הגדל את השיפוע ל-100% מאגר CEX B בשני נפחי עמודות כדי להגיע לנתרן כלורי מולארי אחד.

אסוף שברים של 1.5 מיליליטר במהלך שלבי הפליטה. לאחר מכן, בצע חילופי מאגר ב-tau המכיל שברים מאוגדים. איזון עמוד התפלה עם מצע ארוז שרף G25 בנפח 53 מיליליטר במאגר אמוניום ביקרבונט 15 מילי-מולרי באמצעות מערכת FPLC.

הגדר את קצב הזרימה לחמישה מיליליטר לדקה והזריק את דגימת הטאו על העמודה באמצעות לולאת הזרקה של חמישה מיליליטר. אסוף את השברים המתאימים לשיא הספיגה ב -280 ננומטר. אסוף את כל שברי הטאו לפני הקצאת הדגימה לצינורות.

בחר צינורות אלה כך שנפח התמיסה יהיה קטן בהשוואה לנפח הצינור. לאחר מכן, נקבו חורים במכסי הצינור באמצעות מחט לפני הקפאת דגימות הטאו במינוס 80 מעלות צלזיוס לליופיליזציה מאוחרת יותר. מסיס ארבעה מיליגרם של חנקן 15 מועשר בפחמן 15 ופחמן 13 טאו זרחני ב-400 מיקרוליטר של מאגר NMR.

הוסף חמישה אחוזים תחמוצת דאוטריום לנעילת שדה של ספקטרומטר ה-NMR ו-TMSP מילי-מולרי אחד כהתייחסות לאות NMR פנימי. כמו כן, הוסף 10 מיקרוליטר מתמיסת מלאי 40 EK של קוקטייל מעכב פרוטאז שלם. העבירו את הדגימה בצינור NMR של חמישה מיליליטר באמצעות מזרק אלקטרוני עם מחט ארוכה או באמצעות פיפטה פסטר.

סגור את צינור ה-NMR באמצעות הבוכנה. הסר את כל בועות האוויר הכלואות בין הבוכנה לנוזל על ידי הזזת הבוכנה. הנח את צינור ה-NMR בספינר.

השתמש במד המתאים כדי להתאים את מיקומו האנכי בספינר כך שרוב תמיסת הדגימה תהיה בתוך סליל ה-NMR. לאחר מכן, התחל את זרימת האוויר במכשיר ה-NMR על ידי לחיצה על הרמה בחלון מערכת בקרת המגנט. הנח בזהירות את הספינר עם הצינור בזרימת האוויר בחלק העליון של קדח המגנט.

לאחר מכן עצור את זרימת האוויר ותן לצינור לרדת למקומו בתוך ראש הגשושית בתוך המגנט. לאחר מתן אפשרות לדגימה להתאזן ל-25 מעלות צלזיוס, הקלד ATMM בשורת הפקודה כדי לבצע כוונון והתאמה חצי אוטומטיים של ראש הבדיקה כדי לייעל את העברת הכוח. לאחר מכן לחץ על נעילה בחלון מערכת בקרת המגנט כדי להפעיל את נעילת תדר השדה של הספקטרומטר.

התחל את הליך ה-shimming כדי לייעל את ההומוגניות של השדה המגנטי במיקום הדגימה על ידי הקלדת TopShim GUI תחילה בשורת הפקודה כדי לפתוח את חלון ה-shim. לאחר מכן לחץ על התחל בחלון ה-shim. בדוק את סטיית התקן הנותרת B0 כדי לוודא שה-shims אופטימליים.

לאחר מכן, כייל את הפרמטר P1, שהוא אורך דופק תדר רדיו פרוטון במיקרו-שניות. פרמטר זה הכרחי כדי להשיג סיבוב של 90 מעלות של מגנטיזציה של ספין פרוטון. כוונו לפולס של 360 מעלות באמצעות ספקטרום חד מימדי של פרוטוני מים.

כוונן את היסט התדר על ידי הגדרת הפרמטר O1 לתדר מי הפרוטונים בספקטרום החד-ממדי. לבסוף, התחל ברכישת ספקטרום פרוטונים חד מימדי על ידי הקלדת ZG בשורת הפקודה. תוצאה מייצגת של טיהור טאו רקומביננטי מראה שיא ספיגה משמעותי ב-280 ננומטר שנצפה במהלך שיפוע הפליטה.

שיא זה מתאים לחלבון טאו מטוהר כפי שניתן לראות בג'ל האקרילאמיד מעל הכרומטוגרמה. הכרומטוגרמה להתפלת הטאו המטוהר הרקומביננטי מראה כי שיא הספיגה ב-280 ננומטר ושיא המוליכות מופרדים היטב ומבטיחים שהתפלת החלבון יעילה לשלב הליופיליזציה. ספקטרום ה-NMR החד-ממדי של חנקן רקומביננטי 15 טאו ב-900 מגה-הרץ מאשר שניתן לזהות אות NMR מדגימת החלבון.

יחס אות לרעש טוב מצביע על כך שפרמטרי הרכישה הבסיסיים הוגדרו כהלכה. הספקטרום הדו-ממדי של החלבון הזרחני מראה רזולוציה טובה, התהודה צרה ומופרדת היטב. התהודה באזור הספקטרום המקופס באדום תואמת את השאריות הזרחניות.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להיות מסוגל לייצר חלבון רקומביננטי עם תיוג קל לבחירה, לטהר את החלבון הזה ולהגדיר את הפרמטר הבסיסי לרכישת נתוני ספקטרום. לאחר שליטה, ניתן לבצע פרוטוקול זה תוך שבועיים אם הוא מאורגן כראוי. אל תשכח שספקטרוסקופיה של NMR משתמשת במגנטים חזקים מאוד שאסור להתקרב אליהם עם חפצים מתכתיים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי חלבונים אחרים אלה רגישים לליזה של פרוטאז ויש לנקוט במספר אמצעי זהירות כדי למנוע את השפלת הדגימה. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות כמו NMR במצב מוצק כדי לחקור את האגרגטים דמויי העמילואיד שנוצרים לעתים קרובות על ידי חלבונים לא מסודרים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה הכימית לחקור תרכובות פעילות בעלות פוטנציאל סרפטי במערכות מודל מבחנה.