תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים
15 בספטמבר 2017
בשיטה זו, אנו משתמשים photopolymerization, לחץ על כימיה טכניקות ליצירת דפוסים חלבון או פפטיד על פני השטח של hydrogels פוליאתילן גליקול (PEG), מתן מתאושש אותות ביו לצורך המחקר של תגובות הסלולר במבחנה .
המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא ליצור תבניות מרחביות של חלבונים ביו-אקטיביים מקובעים שניתן להשתמש בהן כדי לחקור תגובות תאיות. שיטה זו מאפשרת לשחזר אותות in-vivo באמצעות אסטרטגיות של חומרי ביו. טכניקה זו מאפשרת חיקוי מדויק של מוטיבים מסוימים של אותות שלא ניתן להשיגם באמצעות שיטות תרבית סטנדרטיות, כגון גורמי גדילה רצפיים, איתות בין תאים ורמזים ביוכימיים ספציפיים למרחב.
פרוטוקול זה הוא בעל חשיבות ביחס לשיטות קיימות כיוון שהוא מספק שיטה פשוטה להתאמת קשיחות התשתית ותבנית החלבונים. בעוד ששיטה זו עשויה לקדם טכנולוגיות של הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, ניתן להחילה גם על מחקר של מערכות אחרות, כגון התפתחות רקמות וגורל של תאי גזע. ראשית, הכין תמיסות מלאי עבור הרכיב העיקרי של ההידרוג'ל, polyethylene glycol diacrylate, עבור הפוטו-איניציאטור, lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate, ועבור חלבון ה-ECM, fibronectin, בתנאים סטריליים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.
בצעו סטריליזציה באמצעות סינון לכל תמיסה באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרון לפני השימוש או לפני אחסון המנות הבודדות. לאחר מכן, עטפו את תמיסת ה-PEG-DA בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מאור. עטפו את תמיסת המלאי של הפוטו-איניציאטור בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מאור ואחסנו את התמיסה שהוכנה בטמפרטורה של 4 °C למשך מספר חודשים.
אם תמיסת המלאי של הפיברונקטין קפואה, יש להפשיר מנה סטרילית על קרח למשך מספר שעות או בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. התחילו בסטריליזציה באוטוקלאב של יריעת פוליאסטר אחת עבור כל תבנית ג'ל. לאחר מכן, השרו שתי שקופיות זכוכית ושלושה ספייסרים פלסטיים עבור כל תבנית ג'ל באתנול 70% למשך שעתיים לפחות.
בנוסף, השרו חמישה תפסים לכל תבנית ג'ל ב-70% ethanol למשך 10 דקות. הניחו את למסליות הזכוכית, המרווחים והתפסים על גיליון אוטוקלאב קטן במנדף לתרביות תאים כדי לאפשר להם להתייבש באוויר במשך מספר שעות. לאחר מכן, הכינו את תבניות ההידרוג'ל על ידי הנחת המרווחים מפלסטיק בעובי 0.5 millimeter מסביב לקצוות של למסלית זכוכית.
הנח את למסליית הזכוכית השנייה מעל, ולאחר מכן הדק את המרווחים זה לצד זה בעזרת תפסים. לבסוף, בצע עיקור של פני השטח של התבנית על ידי הנחתה במנדף והפעלת אור UV למשך 30 דקות לפני השימוש. במחצית תהליך העיקור, הפוך את התבנית כדי להבטיח חשיפה של שני המשטחים.
הכינו את תמיסות הקדמון לג'ל כפי שמתואר בטבלה 1 של פרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר מכן, ערבבו יחד את הנפחים של PEG-DA, פיברונקטין ויוזם פוטוכימי כדי ליצור את ההידרוג'ל. בצעו פיפטור נמרץ של התמיסה כדי להבטיח תמיסה הומוגנית, אך הימנעו מיצירת בועות.
העבירו בעזרת פפטה את תמיסת הפרקורסור של הג'ל בזהירות בין שתי זכוכיתות של תבנית הג'ל. לאחר מכן, הניחו את התבנית תחת אור UV וחשפו אותה למשך דקה אחת עד שתי דקות ליצירת ההידרוג'ל. לאחר שהג'ל התגבש, הסירו את תפסני המשרד והסירו בעדינות את זכוכית העליונה על ידי הפעלת לחץ נגדי על שני המרווחים הצדדיים.
לאחר מכן, השתמשו במנקב ביופסיה (biopsy punch) בגודל המתאים כדי לחתוך את דגימות ההידרוג'ל. נקבו מספר הידרוג'לים ממלבן הג'ל כדי שישמשו כחזרות וכדגימות בקרה. עקרו את מסכת הפוטו-ליתוגרפיה על ידי השריה ב-70% ethanol למשך 10 דקות.
לאחר מכן, הנחו למסכת הצילום להתייבש באוויר בתוך מנדף לתרביות תאים. בשלב הבא, טפטפו בעזרת פיפטה 1 עד 2 µL לסנטימטר רבוע של תמיסת חלבון מתיתול (thiolated protein) על פני השטח של כל הידרוג'ל שגולח לצורך דפוס פני שטח. חשוב לפרוס את תמיסת החלבון באופן אחיד על פני השטח של ההידרוג'ל כדי להבטיח קיבוע חלבון אחיד.
הניחו בזהירות את מסיכת הצילום על פני ההידרוג'ל. לחצו בעדינות על המסיכה כדי להסיר בועות אוויר שנוצרו בין המסיכה לפני ההידרוג'ל. לאחר מכן, הניחו את ההידרוג'ל תחת תאור UV וחשפו אותו לסבב שני של אור UV למשך 30 עד 60 שניות.
שטפו את ההידרוג'לים ב-PBS כדי להסיר מינים שלא הגיבו, והניחו כל הידרוג'ל בתוך פלטת בארות כך שפני השטח של התבנית פונים כלפי מעלה. לאחר מכן, שטפו את הג'לים למשך לילה ב-PBS בטמפרטורה של 4 °C. הסירו את ה-PBS מהבארות, ולאחר מכן הוסיפו 250 µL של basal EGM2 לכל בארה והדגרימו את הג'לים למשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C.
במהלך הדגירה, יש לעכל באמצעות טריפסין פלטה של HUVECs כמעט מלאה (near-confluent) למתלה של תאים בודדים תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות. לאחר מכן, יש לסבב את מתלה התאים בצנטריפוגה ולהסיר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant). יש לערבב מחדש את משקע התאים עם מצע EGM2 בסיסי ללא גורמי גדילה מוספים, ולהעביר חלק ממתלה התאים לתא מדידה (hemocytometer).
ספרו את התאים כדי לקבוע את הריכוז. לאחר מכן, סבבו את הפלטה המכילה את ההידרוג'לים ב-300 x G למשך שלוש דקות, כדי להבטיח שההידרוג'לים נמצאים בתחתית הבאר ואינם צפים. קריטי שההידרוג'לים לא יצופו בתוך הבארים.
הצפת הידרוג'לים תגביל את הצלחתה של זריעת התאים ותגרום לבעיות בדימוי של ההידרוג'ל. טפטפו באיטיות באמצעות פיפט 75,000 תאים לכל סנטימטר רבוע למרכז של כל משטח הידרוג'ל, כדי לא להפר את הג'לים. לאחר מכן, הכניסו את הפלטה למדגרת תרביות תאים בטמפרטורה של 37 °C.
במשך מספר ימים, הוצא את הצלחת באופן תקופתי כדי לצפות בנדידת התאים בתגובה לתבנית החלבון. החלף 50% מהמדיום מדי יומיים עד שלושה. בעת יצירת ההידרוגלים, ניתן להשתמש בריכוזים שונים של PEG-diacrylate מקדימים כדי להשיג את קשיחות התשתית הרצויה.
כפי שמוצג כאן, תמיסת 20%PEG-DA תואמת לקשיות של מעל 100 kilopascals. חשוב לשקול גם את ריכוז הפוטו-איניצ'יטור (photo initiator) ואת זמן החשיפה ל-UV, שכן עלייה בכל אחד מהמשתנים הללו תפחית את הביואקטיביות של המולקולות המחוברות, המיוצגת כאן על ידי הביואקטיביות של ליזוזום. מזעור החשיפה ל-UV במהלך היווצרות ההידרוג'ל הוא קריטי לשמירה על קבוצות פונקציונליות של אקרילט חופשי לצורך תגובות קיבוע של חלבונים בהמשך.
הידרוג'לים שנחשפו לאור UV למשך יותר משתי דקות אינם מסוגלים ליצור תבניות של חלבונים מקובעים המופיעות באדום. בנוסף, ככל שחשיפת תבנית החלבון ל-UV גוברת, יותר חלבונים מגיבים למשטח. כאשר הם מוכנים כראוי, ניתן לתרבת תאים על מצעי הידרוג'ל בעלי תבנית זו כדי להשפיע על התנהגותם.
כאן, תאים אנדותלייים נזרעו באופן אחיד על פני הידרוג'לים של PEG בעלי תבנית VEGF. יומיים לאחר הזריעה, נצפתה נדידה של התאים האנדותלייים לעבר האזורים המרחביים של ההידרוג'ל שהכילו VEGF מקובע. לאחר פיתוח פרוטוקול זה, חוקרים יוכלו להשתמש בו כדי לקבע כל חלבון או פפטיד במטרה לחקור פלטפורמות ביו-אקטיביות חדשות למערכות תאים in-vitro.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור למזער את ריכוז הפוטו-איניצייטור ואת זמן החשיפה ל-UV כדי לשמור על הפעילות הביולוגית של המולקולות המקובעות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן דפוס החלבונים והפפטידים הביו-אקטיביים על גבי הידרוג'לים של PEG, זריעת תאים באופן אחיד על גבי הידרוג'לים ותצפית על תגובת התאים הנובעת מכך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מתודולוגיה זו רותמת פוטו-פולימריזציה וכימיית קליק כדי ליצור תבניות של חלבונים ביו-אקטיביים מקובעים על גבי הידרוגלים של פוליאתילן גליקול (PEG). תבניות אלו חיוניות לחקר תגובות תאיות in vitro, תוך שהן מחקות באופן יעיל אותות in-vivo.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה תאית
- הנדסת רקמות
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- שיטות תרבית סטנדרטיות נכשלות לעיתים קרובות בשחזור סיגנלינג מורכב in-vivo.
- שיטה זו מאפשרת רמזים ביוכימיים ספציפיים מבחינה מרחבית.
- היא מספקת גישה פשוטה להתאמת קשיחות התשתית ותבניתיות חלבונים.
- ניתנת ליישום במערכות שונות, כולל התפתחות רקמות וגורל של תאי גזע.
מטרת המחקר
- יצירת תבניות חלבון מרחביות ביו-אקטיביות מקובעות.
- בחינת תגובות תאיות באמצעות אסטרטגיות של חומרי ביומטרי얼.
- שיפור טכנולוגיות של הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסות מלאי עבור PEG diacrylate.
- שימוש ב-lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate כיוזם פוטו-פולימריזציה (photo initiator).
- שילוב של חלבון ה-ECM פיברונקטין (fibronectin) תחת תנאים סטריליים.
- יישום של טכניקות פוטו-פולימריזציה וכימיית קליק (click chemistry).
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של תבניות חלבון מרחביות על גבי הידרוג'לים של PEG.
- הדגמה של יכולת חיקוי של איתות in-vivo.
- סיוע בחקר תגובות תאיות בסביבה מבוקרת.
- יישומים פוטנציאליים במערכות ביולוגיות שונות.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה חדשנית לחקר אינטראקציות תאיות.
- היא משפרת את ההבנה של התפתחות רקמות והתנהגות תאי גזע.
- מציעה התקדמויות משמעותיות במתודולוגיות של הנדסת רקמות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
שיטה זו מאפשרת בקרה מרחבית מדויקת של רמזים ביוכימיים על גבי הידרוגלים ניתנים לכוונון, ובכך נותנת מענה למגבלה מרכזית בתרביות תאים קונבנציונליות המשמשות לחקר סיגנלינג המונחה על ידי הסביבה המיקרוסקופית. באמצעות הפרדת קשיחות התשתית מדפוסי החלבון, השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליכי תיקוף מטרות ובסריקות פנוטיפיות. הפלטפורמה מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי שחזור של הצגות מטריצה חוץ-תאית ספציפיות לנישה, הרלוונטיות לגורל תאי גזע ולהתפתחות רקמות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות דפוסים חלקיקיים של חלבונים המדמים מוטיבים של איתות קשורי מטריצה.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הניתנת לשחזור לתיקוף פונקציונלי של מטרות, ללא תלות במדרגי ריכוז של גורמים ממיסים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תגובות תאיות כמותיות בעלות רזולוציה מרחבית לפפטידים או חלבונים מקובעים לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות.
- ערך תפעולי: תומך בהכנה ניתנת להרחבה של הידרוגלים בעלי תבניות עבור פלטפורמות סריקה רב-בארים עם הצגה ביוכימית מבוקרת.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: יצירת מערכות הרלוונטיות למחלות על ידי הצגת רמזים ביו-אקטיביים בטווחים של קשיות רלוונטיים פיזיולוגית, במטרה לחקור התמיינות של תאי גזע ומורפוגנזה של רקמות.
- ערך תפעולי: מאפשר ניטור אורך של תגובות תאיות לגירויים דפוסים, ובכך תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי אספקת תתי-מצעים ביו-אקטיביים הניתנים לכיוונון, המגשרים בין בדיקות רדוקציוניסטיות לבין סביבות מורכבות דמויות רקמה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבירור מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד ההשפעות של דפוסים מרחביים של חלבונים על התנהגות תאית.
- סריקה: מספקת סובסטראטים מוכנים לבדיקה עם קיבוע חלבונים עקבי וקשיחות ניתנת לכיוון לסריקה אמינה של תרכובות או פנוטיפים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של תגובות תאית, כגון נדידה, יישור או התמיינות, כמענה לרמזים מרחביים מוגדרים.
- מחקר טרנסלציוני: מקשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לתיקוף פרה-קליני באמצעות סובסטראטים ביו-מימטיים המשקפים את מורכבות המטריצה החוץ-תאית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור דפוס של כל חלבון או פפטיד, ובכך מפחיתה את עלויות הפיתוח מחדש בין פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באינטראקציות בין תאים למטריצה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לייצור הידרוג'לים ולדפוס פוטו-גרפי.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של יעילות המטרה בסביבות מיקרו רלוונטיות מבחינה הקשרית.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מטרות מותאם סיכונים על בסיס תגובות פונקציונליות בנישות ביוכימיות המוגדרות מרחבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפוטוכימיה, טיפול בחומרי ביו-מטריאל וטכניקות סטריליות של תרבית תאים.
- תלוי במקורות אור UV, פוטו-איניציאטורים והכנת חלבונים התואמת לכימיה של thiol-ene.
- מחייב סטנדרטיזציה של עובי ההידרוג'ל, חשיפה ל-UV וריכוז החלבון בין הצוותים השונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור גדלי חלבונים שונים, יעילות התיולציה (thiolation) וחדירות ההידרוג'ל.
- כולל מגבלות מעשיות כגון דנטורציה פוטנציאלית של חלבונים כתוצאה מחשיפה ל-UV ומגבלות דיפוזיה בהידרוג'לים עבים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Preparation of Materials for Hydrogel Synthesis
8:31
Conclusion
6:58
Results: Endothelial Cells Respond to VEGF Patterned Hydrogels
1:57
Preparation of Sterile Glass Slide Molds for Hydrogel Formation
3:04
Hydrogel Formation
4:06
Protein Patterning
5:18
Cell Seeding onto Hydrogels
