תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא ליצור דפוסי חלבון מרחביים ביו-אקטיביים משותקים המשמשים לחקר תגובות תאיות. שיטה זו מאפשרת לסכם אותות in-vivo באמצעות אסטרטגיות ביו-חומריות. טכניקה זו מאפשרת חיקוי מדויק של מניעי איתות מסוימים שלא ניתן להשיג בשיטות תרבות סטנדרטיות כגון, גורמי גדילה עוקבים, איתות תאי תאים ורמזים ביוכימיים ספציפיים למרחב.

פרוטוקול זה משמעותי לשיטות הקיימות מכיוון שהוא מספק שיטה פשטנית להתאמת קשיחות המצע ודפוס החלבון. בעוד ששיטה זו יכולה לקדם טכנולוגיות הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, ניתן ליישם אותה גם לחקר מערכות אחרות כגון התפתחות רקמות וגורל תאי גזע. כדי להתחיל, הכינו פתרונות מלאי לרכיב ההידרוג'ל העיקרי, פוליאתילן גליקול דיאקרילט, יוזם הצילום, ליתיום פניל-2, 4, 6-טרימתיל-בנזויל פוספינאט וחלבון ה-ECM, פיברונקטין, בתנאים סטריליים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

מסנן לעקר כל תמיסה באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרון לפני השימוש או האחסון של המנות הבודדות. לאחר מכן, עטפו את תמיסת ה-PEG-DA בנייר כסף כדי להגן עליה מפני אור. עטפו את תמיסת המלאי של יוזם הצילום בנייר כסף כדי להגן עליו מפני אור ואחסנו את התמיסה המוכנה בארבע מעלות צלזיוס עד מספר חודשים.

אם תמיסת מלאי פיברונקטין קפואה, אפשר לאליקוט סטרילי להפשיר על קרח למשך מספר שעות או בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. התחל בחיטוי יריעת פוליאסטר אחת לכל תבנית ג'ל. לאחר מכן, השרו שתי שקופיות זכוכית בשלושה מרווחי פלסטיק לכל תבנית ג'ל באתנול 70% למשך שעתיים לפחות.

בנוסף, יש להשרות חמישה קליפסים קלסר לכל תבנית ג'ל באתנול 70% למשך 10 דקות. הנח את שקופיות הזכוכית, המרווחים ותפסי הקלסר על יריעת חיטוי קטנה במכסה המנוע של תרבית התאים כדי לאפשר להם להתייבש באוויר למשך מספר שעות. לאחר מכן, הכינו את תבניות ההידרוג'ל על ידי הנחת מרווחי הפלסטיק בעובי 0.5 מילימטר סביב קצה מגלשת זכוכית.

הנח את מגלשת הזכוכית השנייה למעלה ולאחר מכן אבטח את המרווחים בחוזקה זה ליד זה בעזרת תפסי קלסר. לבסוף, יש לעקר את התבנית על ידי הנחתה במכסה המנוע והדלקת אור ה-UV למשך 30 דקות לפני השימוש. באמצע תהליך העיקור, הפוך את התבנית כדי לחשוף את שני המשטחים.

צור את פתרונות מבשר הג'ל כמתואר בטבלה הראשונה של פרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, ערבבו יחד את נפחי ה-PEG-DA, הפיברונקטין ויוזם הצילום ליצירת ההידרוג'ל. פיפטו את התמיסה במרץ כדי להבטיח פתרון הומוגני, אך הימנעו מיצירת בועות.

שלח את תמיסת מבשר הג'ל בזהירות בין שתי שקופיות הזכוכית של תבנית הג'ל. לאחר מכן, הניחו את התבנית מתחת לאור UV וחשפו אותה למשך דקה עד שתיים ליצירת ההידרוג'ל. לאחר הג'ל, הסר את תפסי הקלסר והסר בעדינות את מגלשת הזכוכית העליונה על ידי הפעלת לחץ הפוך על שני מרווחי הצד.

לאחר מכן, השתמש באגרוף ביופסיה בגודל מתאים כדי לחתוך את דגימות ההידרוג'ל. נקב מספר הידרוג'לים ממלבן הג'ל כדי לשמש כשכפולים ודגימות בקרה. עקר את מסכת הצילום על ידי השרייתה באתנול 70% למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הניחו למסכת הצילום להתייבש באוויר במכסה המנוע של תרבית תאים. לאחר מכן, פיפטה אחד עד שניים מיקרוליטר לסנטימטר רבוע של תמיסת חלבון תיולטי על פני השטח של כל הידרוג'ל חתוך לדפוס פני השטח. חשוב לפזר את תמיסת החלבון על פני ההידרוג'ל באופן שווה כדי להבטיח קיבוע אחיד של החלבון.

הניחו בזהירות את מסכת הצילום על פני ההידרוג'ל. יש ללחוץ בעדינות כלפי מטה על המסכה כדי להסיר בועות שנוצרות בין המסכה למשטח ההידרוג'ל. לאחר מכן, הנח את ההידרוג'ל מתחת לאור ה-UV וחשוף אותו לסיבוב שני של אור UV למשך 30 עד 60 שניות.

שטפו את ההידרוג'לים עם PBS כדי להסיר מינים שלא הגיבו והניחו כל הידרוג'ל בתוך צלחת הבאר כך שמשטח התבנית פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, שטפו את הג'לים למשך הלילה ב-PBS בארבע מעלות צלזיוס. הסר PBS מבארות, לאחר מכן, הוסף 250 מיקרוליטר EGM2 בסיסי לכל באר ודגר את הג'לים למשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

במהלך הדגירה, טריפסין מעכל צלחת של HUVECs כמעט מתכנסים לתרחיף תא בודד באמצעות טכניקות סטנדרטיות. לאחר מכן, סובב את תרחיף התא והסר בזהירות את הסופרנטנט. השעו מחדש את גלולת התא ואת ה-EGM2 הבסיסי ללא גורמי גדילה נוספים והוסיפו חלק מתרחיף התא להמוציטומטר.

ספרו את התאים כדי לקבוע את הריכוז. לאחר מכן, סובב את הצלחת המכילה הידרוג'לים ב -300 x G למשך שלוש דקות, כדי להבטיח שההידרוג'לים ממוקמים בתחתית הבאר ואינם צפים. זה קריטי שהידרוג'לים לא יצופו בתוך הבארות.

הידרוג'לים צפים יגבילו את ההצלחה בזריעת תאים ויגרמו לבעיות בהדמיית הידרוג'ל. פיפטה לאט 75, 000 תאים לסנטימטר בריבוע על מרכז כל משטח הידרוג'ל כדי לא להפריע לג'לים. לאחר מכן, הנח את הצלחת באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

במשך מספר ימים, הסר מעת לעת את המנה כדי לצפות בנדידת התאים בתגובה לדפוס החלבון. החליפו 50% מהמדיה כל יומיים-שלושה. בעת יצירת ההידרוג'לים, ניתן להשתמש בריכוזים שונים של PEG-diacrylate כדי להניב את קשיחות המצע הרצויה.

מוצג כאן, תמיסת PEG-DA של 20% מתאמת עם קשיחות של למעלה מ-100 קילופסקל. חשוב גם לקחת בחשבון גם את ריכוז יוזם הצילום וגם את זמן החשיפה ל-UV מכיוון שעלייה בכל אחד מהמשתנים תפחית את הפעילות הביולוגית של מולקולות מחוברות, המיוצגת כאן על ידי הפעילות הביולוגית של הליזוזום. מזעור החשיפה ל-UV במהלך היווצרות הידרוג'ל הוא קריטי לשמירה על קבוצות פונקציונליות אקרילט חופשיות לתגובות קיבוע חלבון לאחר מכן.

הידרוג'לים שנחשפים לאור UV במשך יותר משתי דקות אינם מסוגלים ליצור דפוסי חלבון משותקים המוצגים באדום. בנוסף, ככל שחשיפת ה-UV לדפוס החלבון עולה, יותר חלבונים מגיבים לפני השטח. כאשר מכינים אותם נכון, ניתן לתרבת תאים על מצעי הידרוג'ל מעוצבים אלה כדי לתמרן את התנהגותם.

כאן, תאי אנדותל נזרעו באופן אחיד על פני השטח של הידרוג'ל PEG בתבנית VEGF. יומיים לאחר הזריעה נצפו תאי האנדותל נודדים לעבר האזורים המרחביים של ההידרוג'ל שהכילו את ה-VEGF המשותק. בעקבות פיתוח פרוטוקול זה, חוקרים יכולים להשתמש בו כדי לשתק כל חלבון או פפטיד על מנת לחקור פלטפורמות ביו-אקטיביות חדשות למערכות תאים במבחנה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למזער את ריכוז יוזם הצילום ואת זמן החשיפה ל-UV כדי לשמור על פעילות ביולוגית של מולקולות משותקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעצב חלבונים ופפטידים ביו-אקטיביים על הידרוג'לים של PEG, תאי זרעים באופן אחיד על הידרוג'לים ולהתבונן בתגובת התאים כתוצאה מכך.