פרוסה תיקון קלאמפ טכניקת ניתוח הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות
11 בנובמבר 2017
טכניקת מלחציים תיקון פרוסה היא שיטה יעילה עבור ניתוח השינויים הנוצרות על-ידי למידה מאפיינים פנימיים, הפלסטיות של הסינפסות סינאפסות או מעכבות.
היי, שמי דאי מיטסושימה. כאן נראה לכם כיצד ליצור פרוסות מוח בחיות מאומנות על ידי השוואת נתוני מהדק טלאי בחיות לא מאומנות. אנו יכולים לנתח פלסטיות סינפטית הנגרמת על ידי למידה.
היי, שמי הירויוקי קידה. בניסוי זה, חקרנו את המנגנון העצבי של ריצה מוטורית באמצעות מבחן מוט רוטור. מבחן מוט הרוטור נמצא בשימוש נרחב להערכת הקוגניציה המוטורית של מכרסמים.
היתרון בשיטה זו הוא שאנו יכולים לשנות את רמת הגילוי במהלך הבדיקה על ידי הגדלת מהירות המסובב. מבחן מוט רוטור. לפני משימת המנוע, יש להגדיר את מנגנון מוט הרוטור למצב האצה מ-4 עד 40 סל"ד במשך 300 שניות.
חולדות נדרשו לבצע עשרה ניסיונות לכל בדיקה. מרווח הזמן בין הניסיונות היה 30 שניות. במהלך האימון הראשון, חולדות בדרך כלל נופלות מהמוט, אפילו במהירויות נמוכות, ולפעמים הולכות בכיוון הלא נכון.
עם זאת, לאחר אימון חוזר, החולדה יכולה ללכת במהירות גבוהה יותר. על ידי מדידת חביון על המוט, אנו יכולים להעריך את ביצועי הלמידה של החולדה של המיומנות. כאן אנו יכולים לראות את תוצאות בדיקת מוט הרוטור.
כפי שמוצג באיור זה, מספיקים יומיים של אימונים כדי לרכוש את המיומנות המוטורית. בהשוואה לחביון בניסוי הראשון, ניתוח פוסט הוק הראה שיפור משמעותי בניסוי הסופי של ימי האימון. על ידי מדידת חביון על המוט, אנו יכולים להעריך את ביצועי הלמידה של החולדה של המיומנות.
לאחר מכן, נראה לך מבחן הימנעות מעכב. מבחן זה שימושי בניתוח ביצועי למידה הקשרית. מנגנון ההימנעות המעכב מורכב מצדדים בהירים וכהים המופרדים על ידי דלת מלכודת.
במהלך האימון, החולדות ממוקמות באזור המואר וניתן להן זמן קצר להתאקלם בסביבה. ברגע שהדלת נפתחת, החולדות חופשיות להיכנס לאזור החשוך כרצונן. עם הכניסה לאזור החשוך, הדלת נסגרת והחולדות מקבלות שוק חשמלי קל למשך שתי שניות.
לאחר החזרתן לכלובים למשך 30 דקות עם סיום הניסוי, החולדות מוכנסות שוב לאזור המואר של המכשיר. שלושים דקות לאחר ההלם, החולדות המאומנות הראו באופן עקבי חביון ארוך יותר לפני שנכנסו לאזור החשוך. כאן אנו יכולים לראות את תוצאות מבחן ההימנעות המעכבת.
לאחר ההתחשמלות, החולדות למדו להימנע מהאזור החשוך ולהישאר בצד המואר, מה שהן לא היו מעדיפות בדרך כלל. נטייה זו להימנע מהצד האפל מצביעה על רכישת זיכרונות הקשריים. פרוסות מוח לאחר אימון.
לפני החתך, אנו מקררים את כל המספריים, ההמוסטטים והכוסות בקרח כתוש. כאן תוכלו לראות את ההכנה שלנו לדיסקציה. יש לבצע דיסקציה של המוח במהירות האפשרית.
לאחר הרדמה עמוקה זו, מניחים את החולדה במגש רדוד עם קרח כתוש ומבצעים חתך לפתיחת חלל הבטן. לאחר חתך הסרעפת, נעשה חתך רוחבי נוסף. כדי לפתוח את חלל בית החזה, יש לסגור את הסחוס החופי באמצעות המוסטט.
לאחר חשיפת הלב מוחדרת מחט נירוסטה בגודל 18 בחלק האחורי של החדר השמאלי. קצה המחט, צריך להיות גלוי דרך דופן אבי העורקים. לאחר חיתוך האפרכסת הימנית, מתחיל זלוף.
ודא שגם המחט וגם המזרק מתמלאים תחילה במאגר חיתוך קר כקרח. יש להסיר גם את כל בועות האוויר לפני הזילוף. ראשית, חותכים בחלק האחורי של הגולגולת.
לאחר מכן בצע חתך לרוחב, ואחריו חתך מרכזי כדי לחשוף את המוח. לאחר הדיסקציה, יש למקם את המוח במאגר קר קרח מבעבע למשך חמש דקות. לפני שתמשיך בדיסקציה, נייר הסינון צריך להיות רטוב באמצעות מאגר קר כקרח.
לאחר מכן, המוח מונח על במת נירוסטה קרה כקרח. זווית שלב החיתוך היא קריטית להבטחת זווית חיתוך נכונה לפרוסת המוח. זווית שגויה עלולה לחתוך את תאי העצב הפירמידליים של המטרה.
לאחר החיתוך, יש להניח טיפה אחת של דבק-על על במת הוויברטון. כדי להבטיח הידבקות הדוקה, יש להסיר את מאגר החיתוך העודף באמצעות פיסת נייר פילטר. באמצעות הוויברטון, ניתן להכין פרוסות מוח דקות שנשמרו במאגר קר כקרח.
אזור המטרה שלנו הוא קליפת המוח המוטורית הראשונית. אפשר לקצץ את אזור מוח המטרה באמצעות מספריים לקשתית. ניתן לייצר את תא הממשק באמצעות מיכל מזון מפלסטיק.
מכסה תא הממשק נחוץ כדי להכיל את הגז. פרוסות נצפות באמצעות מיקרוסקופ אינפרא אדום-DIC. כאן אנו יכולים לראות דוגמה לתאי עצב בשכבה 2/3 בקליפת המוח המוטורית הראשונית.
פיפטות הקלטת טלאים מלאות בתמיסה התוך-תאית המתאימה. הפתרון לניתוח מהדק הנוכחי שונה מניתוח מהדק המתח. תוצאות מייצגות.
טכניקת המהדק הנוכחית שימושית לניתוח תכונות תא מהותיות. לאחר אימון מוט הרוטור, הצלחנו להשיג את נתוני המהדק הנוכחיים מתאי עצב בשכבה 2/3 בקליפת המוח המוטורית הראשונית. פאנל A מציין עקבות אופייניים המושרים על ידי זריקות זרם.
פאנל B מציין את הקשר בין הזרם המוזרק למספר הקוצים. חולדות מאומנות ביום אחד גרמו פחות קפיצות, בעוד שחולדות מאומנות של יומיים גרמו להרבה יותר ספייקים מאשר חולדות לא מאומנות. כפי שניתן לראות בפאנלים התחתונים, חולדות מאומנות ביום אחד הראו פוטנציאל מנוחה נמוך יותר, סף ספייק גבוה יותר והיפרפולריזציה עמוקה יותר.
חולדות מאומנות במשך יומיים הראו פוטנציאל מנוחה גבוה יותר ועמידות לממברנה. טכניקת מהדק המתח שימושית לניתוח הפלסטיות הסינפטית המושרה על ידי למידה. כאן, אנו יכולים לראות נתונים מתאי עצב CA1 לאחר אימון הקשרי.
השגנו זרמים פוסט-סינפטיים זעירים מנוירונים CA1 המושרים על ידי שלפוחיות בודדות של גלוטמט או GABA. לוחות A ו-B מראים עקבות מייצגים של זרם פוסט-סינפטי זעיר. בנוכחות טטרודוטוקסין, EPSCs מיניאטוריים במינוס 16 מילי-וולט ו-IPSCs מיניאטוריים באפס מילי-וולט נמדדו ברצף באותם נוירונים.
פאנל C מציג תרשימים דו-ממדיים של אמפליטודות EPSC מיניאטוריות ו-IPSC מיניאטוריות בחולדות לא מאומנות, מאומנות, לא מזווגות ועוברות. לוח D מציג את התרשימים עבור התדרים המיניאטוריים. כפי שניתן לראות בפאנלים התחתונים, אימונים קונטקסטואליים חיזקו משמעותית הן את הסינפסות המעוררות והן את הסינפסות המעכבות המקדמות מגוון של קלטים סינפטיים לנוירונים.
לסיכום, טכניקת מהדק הזרם שימושית לניתוח שינויים הנגרמים על ידי למידה במאפיין התא. כמו כן, טכניקת מהדק המתח היא כלי רב עוצמה לניתוח פלסטיות הנגרמת על ידי למידה בסינפסות מעוררות ומעכבות. את התוצאות המפורטות של ניתוחים אלה ניתן למצוא בפרסומים הבאים.
סקירה
מאמר זה מדגים את טכניקת ה-slice patch clamp לניתוח שינויים בתכונות סינפטיות ופלסטיות הנגרמים מלמידה. המחקר מתמקד בקוגניציה מוטורית ולמידה קונטקסטואלית בחולדות מאומנות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- ניתוח התנהגותי
רקע
- טכניקת ה-slice patch clamp חיונית לחקר הפונקציה הסינפטית.
- ניתן להעריך את הקוגניציה המוטורית באמצעות מבחן מוט הרוטור.
- למידה קונטקסטואלית מוערכת באמצעות מבחני הימנעות מעכבים.
- הבנת הפלסטיות הסינפטית היא חיונית לתובנות על מנגנוני למידה.
מטרת המחקר
- לנתח פלסטיות סינפטית הנגרמת מלמידה בחולדות.
- להשוות תכונות סינפטיות בין בעלי חיים מאומנים ולא מאומנים.
- לחקור את הנוירומכניזם של ריצה מוטורית.
שיטות בשימוש
- מבחן מוט הרוטור להערכת רכישת מיומנות מוטורית.
- מבחן הימנעות מעכבים לניתוח זיכרון קונטקסטואלית.
- הכנת פרוסות מוח והקלטות patch clamp.
- טכניקות קליפת זרם ומתח כדי לנתח פעילות סינפטית.
תוצאות עיקריות
- שני ימי אימון שיפרו משמעותית את ביצועי המיומנות המוטורית.
- חולדות מאומנות הפגינו תכונות סינפטיות משופרות בהשוואה לחולדות לא מאומנות.
- נתוני קליפת זרם הראו עלייה בפעילות הספייקים בחולדות מאומנות.
- תוצאות קליפת מתח הצביעו על שינויים בזרמים סינפטיים פוסט-מיניאטוריים.
מסקנות
- המחקר מאשר את יעילותה של טכניקת ה-slice patch clamp.
- אימון משפר הן מיומנויות מוטוריות והן פלסטיות סינפטית.
- ממצאים אלה תורמים להבנת הבסיס העצבי של למידה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The slice patch clamp technique enables direct measurement of learning-induced changes in neuronal excitability and synaptic strength, providing mechanistic insights into neural circuit adaptation. This approach supports target validation in neuroscience drug discovery by linking behavioral phenotypes to cellular and synaptic phenotypes. It enhances predictive confidence in early discovery by de-risking hypotheses about compound effects on plasticity-related pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring changes in resting membrane potential, spike threshold, and membrane resistance in trained versus untrained neurons.
- Scientific Value: Clarifies pathway involvement by demonstrating learning-induced increases in spiking activity in layer II/III pyramidal neurons of motor cortex.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by quantifying synaptic plasticity at both excitatory and inhibitory synapses in hippocampal CA1 neurons following contextual learning.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (acute brain slices) for downstream assessment of compound effects on intrinsic and synaptic neuronal properties.
- Scientific Value: Enables assay standardization through sequential recording of mEPSCs and mIPSCs from the same neuron, reducing variability in synaptic strength measurements.
- Scientific Value: Provides quantitative outputs (amplitude, frequency of postsynaptic currents) that support reliable compound evaluation in phenotypic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant system utility by modeling learning-induced plasticity in motor cortex and hippocampus, regions relevant to cognitive and motor disorders.
- Scientific Value: Ensures translational continuity from behavioral training (rotor rod, inhibitory avoidance) to cellular readouts, supporting mechanism-based target validation.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by identifying compounds that normalize learning-induced hyperactivity or synaptic imbalance.
Pipeline & Workflow Integration
The technique integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, particularly for targets modulating neuronal excitability or synaptic transmission.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by comparing neuronal properties between behaviorally trained and naive animals to validate target engagement.
- Screening: Delivers assay readiness via stable, reproducible whole-cell patch clamp recordings in acute slices, enabling dose-response analysis of test compounds.
- Analytics: Generates key readouts including spike count, resting potential, membrane resistance, and mEPSC/mIPSC amplitude/frequency to quantify neuronal and synaptic responses.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking learning-induced synaptic changes to potential biomarkers of circuit dysfunction in neuropsychiatric disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable electrophysiology platform applicable across brain regions (e.g., sensory cortex, amygdala) and learning paradigms, maximizing asset utilization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how learning alters neuronal and synaptic function.
- Operational Value: Promotes standardization through defined slice preparation, perfusion, and recording protocols that enhance reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct electrophysiological evidence of target-mediated effects on plasticity pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds that reverse pathological plasticity without disrupting baseline function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, brain slicing, and behavioral neuroscience to ensure data quality and interpretation.
- Dependent on instrumentation including vibratomes, patch clamp amplifiers, perfusion systems, and infrared-DIC microscopy for successful slice preparation and recording.
- Necessitates cross-team standardization between behavior, histology, and electrophysiology groups to align training paradigms with slice timing and region targeting.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different brain regions or neuron types, such as adjusting slice orientation or intracellular solution composition.
- Limited by the acute nature of brain slices, which restricts longitudinal studies but preserves native circuitry for ex vivo mechanistic analysis.
