אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים כיצד קשרים סינפטיים בין נוירונים מזוהים מורפולוגית מאופיינים הן מבחינה תפקודית והן מבנית. זה מושג על ידי השגת פרוסות מוח חדות, המותאמות לחקר קשר סינפטי מסוים. לאחר מכן משתמשים בהידוק טלאי כדי לבדוק נוירונים מצומדים סינפטית.

לשם כך, נוירון פוסט-סינפטי פוטנציאלי אינדיבידואלי מתוקן, ולאחר מכן משתמשים בפיפטה שנייה כדי לעורר את הנוירונים הסובבים על מנת לבסס את קיומו של קשר סינפטי. אם לא נראית תגובה, האלקטרודה המגרה מועברת. ברגע שנמצא חיבור, הנוירון הפרה-סינפטי מותאם מחדש במצב סיטונאי.

בעקבות רישומים אלקטרופיזיולוגיים מתאי עצב אלה וסתימות ביוטין בו זמנית, הפרוסה מקובעת, מעובדת לביוטין ומבוצעת שחזור תלת מימד בעזרת מחשב של הנוירונים. בסופו של דבר, השיטה שלנו מכוונת לניתוח כמותי מבני ותפקודי מתואם של מיקרו-מעגלים עצביים. היתרון העיקרי של הקלטות זוגיות מנוירונים מצומדים סינפטית הוא שאנו יכולים לבצע ניתוח מבני ותפקודי מתואם של נוירונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים במעגלי מיקרו עצביים.

אפילו לאחרונה, טכניקות שהוצגו כמו גירוי אופטי של נוירונים אינן מסוגלות עד כה להשיג זאת בפירוט רב כל כך. שיטה זו מאפשרת לחקור את האינטראקציות של עירור ועיכוב של סוגי נוירונים שזוהו מורפולוגית וכיצד הפעילות מווסתת. מי שמדגים את הנהלים להקלטות חיות מחמד יהיה גואן.

הוא פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. לאחר הכנת פרוסות מאזור היעד, אפשר להם לדגור במהלך תקופה זו, משוך את פיפטות התיקון, שאמורות להיות בעלות שוק ארוך ודק. לאחר אבטחת פרוסת מוח עם נבל פלטינה בתא ניסוי, מלאו פיפטה הקלטה בתמיסה פנימית.

הנח את הפיפטה במגבר המקדים והדביק נוירון פוסט-סינפטי משוער במצב תא שלם באמצעות פיפטת תיקון מחפשת בעלת התנגדות של שמונה עד 10 מגה-אוהם מלאה בתמיסה פנימית שבה מלחי אשלגן מוחלפים במלחי נתרן. הפעל יניקה עדינה על פיפטת החיפוש כדי לתקן נוירון פרה-סינפטי פוטנציאלי בתא רופף. תצורה מצורפת.

החזק את פוטנציאל הממברנה מתחת לאטם הרופף בין שלילי 30 לשלילי 60 מילי-וולט במצב מהדק זרם. לאחר מכן הפעל פולסי זרם גדולים של 0.2 עד שני ננו אמפר כדי לעורר פוטנציאל פעולה בתא הפרה-סינפטי הפוטנציאלי. שימו לב לפוטנציאל הפעולה הזה כספיקלט קטן על תגובת המתח.

הגדר את תדר הגירוי ל-0.1 הרץ כדי למנוע התמוטטות של התגובה הפוסט-סינפטית. אם הנוירון הפוסט-סינפטי אינו מגיב לגירוי של תיקון הנוירון הקדם-סינפטי הפוטנציאלי שנבדק, נוירון פרה-סינפטי פוטנציאלי חדש במצב איטום רופף. בדוק עד 30 נוירונים פרה-סינפטיים פוטנציאליים בדרך זו.

המשך השימוש באותה אלקטרודת תיקון חיפוש כל עוד ניתן ליצור אטם עם התנגדות של יותר מ -30 מגה אוהם. אם גירוי במצב איטום רופף מביא ל-EPSP או IPSP עם חביון של פחות מחמש אלפיות השנייה בנוירון הפוסט-סינפטי, הסר את פיפטת החיפוש מהנוירון הקדם-סינפטי באמצעות אלקטרודת תיקון הקלטה מלאה בביוטין המכילה תמיסה פנימית רגילה עם התנגדות של ארבעה עד שמונה מגה אוהם. טלאי את הנוירון הקדם-סינפטי והקלט במצב מהדק זרם תא שלם.

עורר פוטנציאל פעולה על ידי הזרקת זרם בנוירונים הפרה-סינפטיים ורשום את התגובה הפוסט-סינפטית. אחסן את הנתונים במחשב לצורך ניתוח לא מקוון מאוחר יותר. במהלך ההקלטה, ביוטין מתפזר לתוך הנוירון כדי להשיג צביעה מספקת.

אפשרו לביוטין להתפזר במשך 15 עד 30 דקות לפחות, בהתאם לגודל הנוירון. עבור מיקרו-מעגלים עצביים עם יחס קישוריות גבוה, לא נעשה שימוש באלקטרודת חיפוש. במקום זאת, התחל בתיקון ישיר של נוירון פרה-סינפטי במצב תא שלם.

לאחר מכן באמצעות אלקטרודת תיקון מלאה במדבקת תמיסה פנימית רגילה נוירון פוסט-סינפטי פוטנציאלי גם במצב תא שלם, שני התאים צריכים להיות תחת בקרת מהדק נוכחית. לעורר פוטנציאל פעולה בתא הפרה-סינפטי ולעקוב אחר הנוירון הפוסט-סינפטי הפוטנציאלי לפוטנציאל פוסט-סינפטי. אם תא העצב אינו מראה תגובה לגירוי פרה-סינפטי, השתמשו באלקטרודה חדשה כדי לתקן תא עצב חדש שוב במצב תא שלם.

כאשר נמצא חיבור, המשך בהקלטה כפי שהודגם קודם לכן מבלי לשנות את פיפטת התיקון. לאחר תיקון והרכבה של הפרוסות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, בחנו את תאי העצב המסומנים בביוטין תחת מיקרוסקופ אור. ודא שהאלות האקסונליות והקוצים הדנדריטיים נראים בבירור.

באמצעות מערכת מעקב אחר נוירונים מסחרית, עקוב ידנית אחר הנוירונים או זוגות נוירונים המצומדים סינפטית. הקפד לכלול אפילו בטחונות אקסונליים או דנדריטיים קטנים. השתמש בעקבות כדי להשיג שחזורים עצביים תלת מימדיים, תקן את השחזורים העצביים להתכווצות בכל שלושת הממדים המרחביים בחלק המתאים של תוכנית המעקב.

גורמי תיקון הצטמקות עבור מדיום ההטבעה הם כ-1.1 עבור כיווני x ו-y, וכ-2.1 עבור כיוון Z. זוג תאים בצימוד הדדי המורכב מכוכב קוצני וזינוק מהיר לתוך תא העצב. בשכבה הקורטיקלית ארבע מולאו בביוטין.

במהלך ההקלטה, הנקודות הירוקות מצביעות על מגעים סינפטיים מעוררים משוערים בין הנוירון הקוצני הקדם-סינפטי לבין הנוירון הבין-סינפטי הפוסט-סינפטי. הנקודות הכחולות מצביעות על מגעים סינפטיים מעכבים הדדיים משוערים. תמונות בעוצמה גבוהה של המגעים הסינפטיים מוצגות כאן.

העיגולים הפתוחים הירוקים מראים מגעים מעוררים, והעיגולים הפתוחים הכחולים מראים מגעים מעכבים. שחזור נוירו-צלול של זוג תאים זה המחובר הדדית מוצג כאן. האקסון הבין-נוירוני מוצג בכחול, והסומה והדנדריט שלו מוצגים באדום.

אקסון הנוירונים הקוצניים מוצג בירוק והסומה והדיט שלו בלבן. החלק הפנימי מראה את התאים הדנדריטים של הנוירונים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים. יחד עם המגעים הסינפטיים המשוערים, זוהו קווי מתאר של חבית במיקרוגרפי צילום שדה בהיר בעוצמה נמוכה שנעשו מפרוסת המוח החריפה.

חיבור סינפטי מייצג עם יחס קישוריות נמוך ביותר מוצג כאן. פוטנציאל פעולה פרה-סינפטי בתא פרה-מתכתי בשכבה שש עורר פוטנציאל פוסט-סינפטי מונוס-סינפטי בתא עצב פרמטאלי של שכבה ארבע. ההשהיה המוצגת כאן של יותר משלוש אלפיות השנייה של חיבור טרנס למינרי זה ארוכה בהרבה מההשהיה של אלפית שנייה שנצפתה בחיבורים תוך-למינאריים מקומיים.

שני פוטנציאלי פעולה ב-10 הרץ שהתעוררו בתא הפרה-מתכתי בשכבה שש הפעילו פוטנציאלים פוסט-סינפטיים בנוירון הפרמטאלי של כוכב השכבה הרביעית המוצג כאן. שימו לב להנחיה לטווח הקצר. חשוב לזכור שמצב החיתוך צריך להיות מותאם לחיבור סינפטי נתון, ושבמהלך ההקלטה ההגדרה צריכה להיות יציבה לחלוטין ואז מובטחת הבנת ההקלטה האופטימלית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד משתמשים במדידות האלקטרופיזיולוגיות ובשחזורים המורפולוגיים כדי לקבל תמונה כוללת של התכונות המבניות והתפקודיות של מעגלי מיקרו עצביים בניאו-קורטקס.