אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות
10 בינואר 2015
הקלטות מהדק טלאי ומילוי ביוציטין תוך-תאי בו זמנית של נוירונים מצומדים סינפטית בפרוסות מוח חריפות מאפשרים ניתוח מתואם של תכונותיהם המבניות והתפקודיות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את השלבים הטכניים החיוניים של רישום אלקטרופיזיולוגי ממיקרו-מעגלים עצביים והניתוח המורפולוגי שלהם לאחר מכן.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים כיצד קשרים סינפטיים בין נוירונים מזוהים מורפולוגית מאופיינים הן מבחינה תפקודית והן מבנית. זה מושג על ידי השגת פרוסות מוח חדות, המותאמות לחקר קשר סינפטי מסוים. לאחר מכן משתמשים בהידוק טלאי כדי לבדוק נוירונים מצומדים סינפטית.
לשם כך, נוירון פוסט-סינפטי פוטנציאלי אינדיבידואלי מתוקן, ולאחר מכן משתמשים בפיפטה שנייה כדי לעורר את הנוירונים הסובבים על מנת לבסס את קיומו של קשר סינפטי. אם לא נראית תגובה, האלקטרודה המגרה מועברת. ברגע שנמצא חיבור, הנוירון הפרה-סינפטי מותאם מחדש במצב סיטונאי.
בעקבות רישומים אלקטרופיזיולוגיים מתאי עצב אלה וסתימות ביוטין בו זמנית, הפרוסה מקובעת, מעובדת לביוטין ומבוצעת שחזור תלת מימד בעזרת מחשב של הנוירונים. בסופו של דבר, השיטה שלנו מכוונת לניתוח כמותי מבני ותפקודי מתואם של מיקרו-מעגלים עצביים. היתרון העיקרי של הקלטות זוגיות מנוירונים מצומדים סינפטית הוא שאנו יכולים לבצע ניתוח מבני ותפקודי מתואם של נוירונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים במעגלי מיקרו עצביים.
אפילו לאחרונה, טכניקות שהוצגו כמו גירוי אופטי של נוירונים אינן מסוגלות עד כה להשיג זאת בפירוט רב כל כך. שיטה זו מאפשרת לחקור את האינטראקציות של עירור ועיכוב של סוגי נוירונים שזוהו מורפולוגית וכיצד הפעילות מווסתת. מי שמדגים את הנהלים להקלטות חיות מחמד יהיה גואן.
הוא פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. לאחר הכנת פרוסות מאזור היעד, אפשר להם לדגור במהלך תקופה זו, משוך את פיפטות התיקון, שאמורות להיות בעלות שוק ארוך ודק. לאחר אבטחת פרוסת מוח עם נבל פלטינה בתא ניסוי, מלאו פיפטה הקלטה בתמיסה פנימית.
הנח את הפיפטה במגבר המקדים והדביק נוירון פוסט-סינפטי משוער במצב תא שלם באמצעות פיפטת תיקון מחפשת בעלת התנגדות של שמונה עד 10 מגה-אוהם מלאה בתמיסה פנימית שבה מלחי אשלגן מוחלפים במלחי נתרן. הפעל יניקה עדינה על פיפטת החיפוש כדי לתקן נוירון פרה-סינפטי פוטנציאלי בתא רופף. תצורה מצורפת.
החזק את פוטנציאל הממברנה מתחת לאטם הרופף בין שלילי 30 לשלילי 60 מילי-וולט במצב מהדק זרם. לאחר מכן הפעל פולסי זרם גדולים של 0.2 עד שני ננו אמפר כדי לעורר פוטנציאל פעולה בתא הפרה-סינפטי הפוטנציאלי. שימו לב לפוטנציאל הפעולה הזה כספיקלט קטן על תגובת המתח.
הגדר את תדר הגירוי ל-0.1 הרץ כדי למנוע התמוטטות של התגובה הפוסט-סינפטית. אם הנוירון הפוסט-סינפטי אינו מגיב לגירוי של תיקון הנוירון הקדם-סינפטי הפוטנציאלי שנבדק, נוירון פרה-סינפטי פוטנציאלי חדש במצב איטום רופף. בדוק עד 30 נוירונים פרה-סינפטיים פוטנציאליים בדרך זו.
המשך השימוש באותה אלקטרודת תיקון חיפוש כל עוד ניתן ליצור אטם עם התנגדות של יותר מ -30 מגה אוהם. אם גירוי במצב איטום רופף מביא ל-EPSP או IPSP עם חביון של פחות מחמש אלפיות השנייה בנוירון הפוסט-סינפטי, הסר את פיפטת החיפוש מהנוירון הקדם-סינפטי באמצעות אלקטרודת תיקון הקלטה מלאה בביוטין המכילה תמיסה פנימית רגילה עם התנגדות של ארבעה עד שמונה מגה אוהם. טלאי את הנוירון הקדם-סינפטי והקלט במצב מהדק זרם תא שלם.
עורר פוטנציאל פעולה על ידי הזרקת זרם בנוירונים הפרה-סינפטיים ורשום את התגובה הפוסט-סינפטית. אחסן את הנתונים במחשב לצורך ניתוח לא מקוון מאוחר יותר. במהלך ההקלטה, ביוטין מתפזר לתוך הנוירון כדי להשיג צביעה מספקת.
אפשרו לביוטין להתפזר במשך 15 עד 30 דקות לפחות, בהתאם לגודל הנוירון. עבור מיקרו-מעגלים עצביים עם יחס קישוריות גבוה, לא נעשה שימוש באלקטרודת חיפוש. במקום זאת, התחל בתיקון ישיר של נוירון פרה-סינפטי במצב תא שלם.
לאחר מכן באמצעות אלקטרודת תיקון מלאה במדבקת תמיסה פנימית רגילה נוירון פוסט-סינפטי פוטנציאלי גם במצב תא שלם, שני התאים צריכים להיות תחת בקרת מהדק נוכחית. לעורר פוטנציאל פעולה בתא הפרה-סינפטי ולעקוב אחר הנוירון הפוסט-סינפטי הפוטנציאלי לפוטנציאל פוסט-סינפטי. אם תא העצב אינו מראה תגובה לגירוי פרה-סינפטי, השתמשו באלקטרודה חדשה כדי לתקן תא עצב חדש שוב במצב תא שלם.
כאשר נמצא חיבור, המשך בהקלטה כפי שהודגם קודם לכן מבלי לשנות את פיפטת התיקון. לאחר תיקון והרכבה של הפרוסות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, בחנו את תאי העצב המסומנים בביוטין תחת מיקרוסקופ אור. ודא שהאלות האקסונליות והקוצים הדנדריטיים נראים בבירור.
באמצעות מערכת מעקב אחר נוירונים מסחרית, עקוב ידנית אחר הנוירונים או זוגות נוירונים המצומדים סינפטית. הקפד לכלול אפילו בטחונות אקסונליים או דנדריטיים קטנים. השתמש בעקבות כדי להשיג שחזורים עצביים תלת מימדיים, תקן את השחזורים העצביים להתכווצות בכל שלושת הממדים המרחביים בחלק המתאים של תוכנית המעקב.
גורמי תיקון הצטמקות עבור מדיום ההטבעה הם כ-1.1 עבור כיווני x ו-y, וכ-2.1 עבור כיוון Z. זוג תאים בצימוד הדדי המורכב מכוכב קוצני וזינוק מהיר לתוך תא העצב. בשכבה הקורטיקלית ארבע מולאו בביוטין.
במהלך ההקלטה, הנקודות הירוקות מצביעות על מגעים סינפטיים מעוררים משוערים בין הנוירון הקוצני הקדם-סינפטי לבין הנוירון הבין-סינפטי הפוסט-סינפטי. הנקודות הכחולות מצביעות על מגעים סינפטיים מעכבים הדדיים משוערים. תמונות בעוצמה גבוהה של המגעים הסינפטיים מוצגות כאן.
העיגולים הפתוחים הירוקים מראים מגעים מעוררים, והעיגולים הפתוחים הכחולים מראים מגעים מעכבים. שחזור נוירו-צלול של זוג תאים זה המחובר הדדית מוצג כאן. האקסון הבין-נוירוני מוצג בכחול, והסומה והדנדריט שלו מוצגים באדום.
אקסון הנוירונים הקוצניים מוצג בירוק והסומה והדיט שלו בלבן. החלק הפנימי מראה את התאים הדנדריטים של הנוירונים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים. יחד עם המגעים הסינפטיים המשוערים, זוהו קווי מתאר של חבית במיקרוגרפי צילום שדה בהיר בעוצמה נמוכה שנעשו מפרוסת המוח החריפה.
חיבור סינפטי מייצג עם יחס קישוריות נמוך ביותר מוצג כאן. פוטנציאל פעולה פרה-סינפטי בתא פרה-מתכתי בשכבה שש עורר פוטנציאל פוסט-סינפטי מונוס-סינפטי בתא עצב פרמטאלי של שכבה ארבע. ההשהיה המוצגת כאן של יותר משלוש אלפיות השנייה של חיבור טרנס למינרי זה ארוכה בהרבה מההשהיה של אלפית שנייה שנצפתה בחיבורים תוך-למינאריים מקומיים.
שני פוטנציאלי פעולה ב-10 הרץ שהתעוררו בתא הפרה-מתכתי בשכבה שש הפעילו פוטנציאלים פוסט-סינפטיים בנוירון הפרמטאלי של כוכב השכבה הרביעית המוצג כאן. שימו לב להנחיה לטווח הקצר. חשוב לזכור שמצב החיתוך צריך להיות מותאם לחיבור סינפטי נתון, ושבמהלך ההקלטה ההגדרה צריכה להיות יציבה לחלוטין ואז מובטחת הבנת ההקלטה האופטימלית.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד משתמשים במדידות האלקטרופיזיולוגיות ובשחזורים המורפולוגיים כדי לקבל תמונה כוללת של התכונות המבניות והתפקודיות של מעגלי מיקרו עצביים בניאו-קורטקס.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
פרוטוקול זה מדגים את האפיון של חיבורים סינפטיים בין נוירונים שזוהו מורפולוגית באמצעות ניתוח אלקטרופיזיולוגי ומבני. באמצעות פרוסות מוח חריפות, חוקרים יכולים לבצע פאץ' קלמפ על נוירונים בודדים ולעורר נוירונים מסביב על מנת ליצור חיבורים סינפטיים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירומדע
- אלקטרופיזיולוגיה
- מורפולוגיה נוירונית
רקע
- הבנת חיבורים סינפטיים חיונית למחקר בנוירומדע.
- טכניקות פאץ' קלמפ מאפשרות ניתוח פונקציונלי מפורט של נוירונים.
- ניתוח מורפולוגי סימולטני מספק תובנות לגבי מבנה הנוירונים.
- פרוסות מוח חריפות הן אופטימליות לחקר אינטראקציות סינפטיות.
מטרת המחקר
- לתאר את השלבים הטכניים להקלטה אלקטרופיזיולוגית.
- לתאם מאפיינים פונקציונליים ומבניים של נוירונים.
- לשפר את ההבנה של מיקרו-מעגלים נוירוניים.
שיטות בשימוש
- הכנת פרוסות מוח חריפות לחקר סינפטי אופטימלי.
- הקלטות פאץ' קלמפ לזיהוי נוירונים מחוברים סינפטית.
- מילוי ביוציטין לניתוח מורפולוגי של נוירונים.
- גירוי של נוירונים מסביב על מנת ליצור חיבורים סינפטיים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של חיבורים סינפטיים בין נוירונים.
- הדגמה של הקורלציה בין מאפיינים מבניים לפונקציונליים.
- תובנות לגבי הדינמיקה של מיקרו-מעגלים נוירוניים.
- ביסוס פרוטוקול אמין למחקרים עתידיים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק גישה מקיפה לחקר חיבורים סינפטיים.
- הוא מדגיש את החשיבות של שילוב טכניקות אלקטרופיזיולוגיות ומורפולוגיות.
- הממצאים תורמים להבנה עמוקה יותר של אינטראקציות נוירוניות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Paired patch-clamp recordings in acute brain slices enable direct, quantitative analysis of synaptic connectivity and functional microcircuit properties, supporting mechanistic de-risking in early neuroscience drug discovery. This approach provides high-resolution correlation between neuronal structure and function, informing target validation and predictive confidence for CNS portfolio decisions. Integrating electrophysiological and morphological data strengthens translational continuity from discovery biology to preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of synaptic connectivity and microcircuit function in disease-relevant brain regions.
- Supports mechanistic de-risking by correlating electrophysiological responses with neuronal morphology.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in CNS programs.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated neuronal systems for downstream compound screening.
- Provides quantitative, reproducible electrophysiological and morphological outputs for assay standardization.
- Enables reliable evaluation of compound effects on synaptic transmission and connectivity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional and structural biomarkers for translational continuity in CNS research.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying microcircuit mechanisms underlying disease phenotypes.
- Informs preclinical model selection based on validated synaptic and circuit-level endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by providing quantitative, mechanistic insights into neuronal microcircuits, supporting lead identification and translational biomarker development in CNS pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of synaptic connectivity and pathway function in native tissue context.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of synaptic responses for compound evaluation.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of latency, amplitude, and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Aligns structural and functional endpoints for biomarker validation and model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing diverse neuronal circuits across CNS programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes electrophysiological and morphological workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage in neuroscience R&D.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS assets based on validated circuit mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires specialized electrophysiology expertise and training in patch-clamp techniques.
- Demands access to advanced microscopy and neuron tracing infrastructure for 3D reconstruction.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of recording and analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or neuronal subtypes based on connectivity ratios.
- Connectivity estimates can be affected by tissue preparation artifacts such as dendritic or axonal truncation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:22
Paired Patch-Clamping: Neuronal Connections with a Low Connectivity
5:11
Paired Patch-Clamping: Neuronal Connections with a High Connectivity
6:16
Neuronal Reconstruction and Synaptic Contact Localization
7:17
Results: Morphology and Electrophysiology of Synaptic Connections in Cortical Neuronal Microcircuits
9:35
Conclusion
